Способ культивирования высокопатогенного вируса гриппа А Российский патент 2025 года по МПК C12N7/04 

Уровень техники

Эпидемии и пандемии гриппа выявляются в течение нескольких веков и привели к значительным потерям человеческих жизней.

Вирус гриппа А представляет собой сегментированный РНК-содержащий вирус, принадлежащий к семейству Orthomyxoviridae. Эпидемии и пандемии вызываются присутствием вирусов с новыми компонентами оболочек, иммунитет к которым у населения очень низкий. Эти новые компоненты часто являются результатом мутации и/или смешивания вирусов гриппа человека и животных.

Вирус гриппа А поражают множество видов животных, включая млекопитающих, например человека, лошадей, собак, свиней, хорьков, и птицу, например уток, кур и индеек. Существует 16 известных серотипов НА и 9 известных серотипов NA. Птицы являются особенно важными носителями, образуя множество генетически/антигенетически различных вирусов, которые переносятся обратно человеку через тесный контакт человека и животными. Свиньи являются пермиссивными для человеческих и птичьих штаммов. Благодаря этой необычной черте, свиньи считаются «смесительными сосудами», позволяющими генетический обмен между птичьими и человеческими вирусами, когда одни и те же клетки инфицированы обоими типами вируса.

Существует значительный интерес к недавним вспышкам гриппа. Тяжелый тип респираторного заболевания был идентифицирован у собак, который возникает из-за вируса гриппа собаки (ВГС). Было доказано, что это респираторное заболевание является высоко заразным. Более того, ВГС может вызывать 100% заражение с 80% смертностью, и вплоть до 5-8%) смертности среди тяжелых инфекций. С тех пор, как в первый раз его выявили в 2004 у собак породы грейхаунд (Crawford et al., Science 310(5747): 482-485 (2005)) ВГС быстро распространился по Соединенным Штатам, где по меньшей мере в 25 штатах были отмечены вспышки ВГС, и в двадцати семя штатах было отмечено превалирование серотипа ВГС.

Серотип ВГС, вызвавший недавнюю вспышку, был H3N8. Этот серотип ВГС изначально был обнаружен у лошадей, и полагают, что он преодолел видовой барьер в собак.

Вероятно, что отсутствие эффективной вакцины против вируса гриппа собаки сыграло основную роль в быстром и обширном распространении у собак этого вируса.

Вирус гриппа (H5N1, птичий грипп), также называемый «вирус H5N1», является подтипом вируса гриппа, который возникает в основном у птиц, и может быть смертельным для них. Вирус H5N1 обычно не поражает людей, но инфекции с присутствием этого вируса возникали у человека. До настоящего времени более 200 подтвержденных случаев у человека, вызвавшие около 150 смертей, были описаны в 10 странах, в основном в Азии. К счастью, пока еще вирус нелегко передается от птицы к человеку и от одного человека к другому. Однако это может случиться, что приведет к эпидемии или пандемии. Наилучшей стратегией профилактики смертности, связанной с эпидемией или пандемией, является вакцинация.

Вакцины гриппа в настоящее время вводят людям в случае высокого соотношения польза-риск в смысле профилактики госпитализации и смерти, однако мировая ежегодная мощность производства сезонной вакцины ограничена и не реалистично снижает глобальный высокий риск для населения. Современные вакцины получены культивированием в куриных эмбрионах и клетках млекопитающих вируса, полученного от Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) или Центров контроля за заболеваемостью (ЦКЗ), которые предоставляют исходные вакцинные вирусы для производства вакцин каждый год.

При этом обращаем внимание, что сведения о культивировании вирусов органоидах или субклеточных фракциях одноклеточных организмов, в т.ч. митохондриях дрожжей для получения вакцин отсутствуют.

Изменения в НА распространенных вирусов (антигенный дрейф) требуют периодической замены штаммов вакцин во время интерпандемических периодов.

Известен способ выделения и культивирования высокопатогенного вируса гриппа А, заключающийся в том, что заражение вирусом производят в перевиваемой культуре монослоя клеток почки кошки ПК-91 (Заявка RU2010146648, МПК C12N 5/00; C12N 7/00, опубл. 27.05.2012, бюлл. №15).

Недостатком известного способа является использование органа лабораторного животного в качестве биологического материала, что в силу своей негуманности запрещено с 1986 г. Европейской конвенцией о защите позвоночных животных.

Известен способ репликации вируса гриппа в культуре ткани клеток, почек эмбриона млекопитающих, в т.ч. клеток почек быка Мадин-Дарби (МДВК) и клеток почек эмбриона человека (патент RU 2491339, МПК C12N 7/00, опубл. 27.08.2013).

Недостатком известного способа является дорогостоящий, технологически сложный и «негуманный» процесс культивирования вируса гриппа А для последующего производства вакцин.

Наиболее близким к заявляемому изобретению по совокупности существенных признаков и достигаемому результату является техническое решение «Способы культивирования клеток, размножения и очистки вирусов», согласно которому проводят размножение адгезивных клеток почек собаки MDCK на микроносителях в свободной от сыворотки культуральной среде с последующим инфицированием размноженных MDCK клеток вирусов гриппа А или В (патент RU 2547587, МПК C12N 7/00, опубл. 10.04.2015).

Недостатком известного способа является использование клеток млекопитающих (собаки) для последующего культивирования вирусов гриппа А или В.

Следует отметить, что нами не выявлен способ культивирования вирусов, в т.ч. вирусов гриппа А в органоидах или субклеточных фракциях одноклеточных организмов, в т.ч. митохондриях дрожжей. Раскрытие сущности изобретения.

Предлагаемый способ решает задачу отказа от использования куриных эмбрионов (дефицит пищевых продуктов) или культуры клеток органов млекопитающих (дороговизна, трудоемкость тех. процесса, антигуманизм). Поставленная задача решается тем, что согласно заявленному способу в качестве культуры клеток впервые предложено использовать культуру митохондрий дрожжей.

Заявляемый способ культивирования вирусов гриппа А в культуре клеток включает следующие этапы:

а) размножение культуры клеток в свободной от культуральной жидкости среде,

б) инфицирование культуры клеток с помощью вируса гриппа А,

в) инкубация инфицированной вирусом гриппа культуры клеток при условиях, которые позволяют осуществлять увеличение численности вируса гриппа, при этом в качестве культуры клеток используют культуру митохондрий дрожжей.

Наиболее оптимальным является использование культуры митохондрий дрожжей Saccharomyces cerevisiae S179-5А (ВКПМ Y-100 - депонирован в Национальном Биоресурсном Центре - Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (НБЦ ВКПМ) Национальный исследовательский центр «Курчатовский институт» под регистрационным номером Y-100).

Оптимально клетки дрожжей сначала центрифугируют и таким образом освобождают от культуральной среды. Затем, клетки дрожжей Saccharomyces cerevisiae, освобожденные от культуральной среды, обрабатывают ферментом зимолиазой для получения промежуточной культуры сферопластов, которые затем разрушают в гомогенизаторе Даунса, центрифугируют и получают суспензию митохондриальной культуры. Контроль получения культуры митохондрий осуществляют с использованием атомно-силового микроскопа в контактном режиме в воздушной среде.

Для получения лучших результатов инфицирование высокопатогенным вирусом гриппа А с последующим его культивированием и выделением производят в суспензии - взвеси культуры митохондрий в буферном растворе, оптимальный состав которого включает:

маннитол - 0,6 М;

этилендиаминтетрауксусная кислота ЭДТА - 1 мМ;

Трис-HCL (гидлохлорид) - 10 мМ;

бычий сывороточный альбумин BSA - 4 мг/мл.

Оптимальная посадочная концентрация при внесении вируса гриппа А для инфицирования культуры митохондрий составляет от 4,3×10⁴ ГЭ/мл до 8,2×10⁴ ГЭ/мл.

Для получения лучших результатов суспензию культуры митохондрий перед заражением вирусом доводят на спектрофотометре до оптической плотности от 0,10 до 0,60.

Культуру митохондрий, инфицированную вирусом гриппа А, инкубируют при значении рН от 6,5 до 7,5 и температуре 30-33°С.

Сведений о культивировании вирусов, в том числе вирусов гриппа А в митохондриях дрожжей, в частности, дрожжей Saccharomyces cerevisiae, в доступных источниках научной и патентной информации не обнаружено.

Авторами экспериментально установлены возможность культивирования высокопатогенного вируса гриппа А. Таким образом, заявляемое техническое решение соответствует критерию «изобретательский уровень», так как его применение впервые обеспечивает получение нового результата - культивирование высокопатогенного вируса гриппа А в митохондриях дрожжей.

Краткое описание чертежей

На фиг. 1 - изображение колоний Saccharomyces cerevisiae SI79-5А (ВКПМ Y-100).

На фиг. 2 - микроскопия культуры (ув. 1000х, иммерсия) (Использованное оборудование: микроскоп Primo Star (Carl Zeiss AG, Германия).

На фиг. 3 - основные геометрические параметры зонда.

На фиг. 4 - фото дрожжей Saccharomyces cerevisiae.

На фиг. 5 - фото митохондрий дрожжей Saccharomyces cerevisiae.

На фиг. 6 - таблица показателей концентрации вируса гриппа А в ГЭ/мл в опытных и контрольных образцах.

На фиг. 7 - графики концентрации вируса гриппа А в ГЭ/мл в опытных и контрольных образцах.

Осуществление изобретения

Экспериментальные доказательства способа культивирования вирусов в митохондриях дрожжей осуществляли в несколько этапов.

1. Технологический процесс культивирование дрожжей Saccharomyces cerevisiae.

2. Технологический процесс получения культуры митохондрий из биомассы дрожжей Saccharomyces cerevisiae.

3. Инфицирование культуры митохондрий вирусом гриппа А.

4. Количественный учет роста вируса гриппа А в культуре митохондрий. Лиофилизированная культура клеток дрожжей Saccharomyces cerevisiae S179-5А (ВКПМ Y-100) получена в виде одной ампулы из коллекции БРЦ ВКПМ Национального исследовательского центра «Курчатовский институт».

После регидрирования из лиофильного состояния культура была высеяна на жидкие и плотные питательные среды и выращивалась при температуре 30°С в термостате ТС0-1/80 в течение 48 часов.

Культура при росте на агаре Сабуро (ФБУН ГНЦ ПМБ, Россия) с хлорамфениколом (HiMedia, Индия) образует выпуклые белые колонии с ровным краем с характерным дрожжевым запахом (фиг.1).

Микроскопическое исследование выявило наличие овальных клеток (или в виде пчелиных сот в скоплениях клеток), характеризующиеся почкованием и типичной картиной морфологии, характерной для дрожжевых грибов (фиг.2).

Полученная культура была идентифицирована методом MALDI ToF на масс-спектрометре VITEK MS (bioMerieux, Франция) с использованием реагента MS-FA и матрикса MS-CHCA (bioMerieux, Франция).

Культура клеток дрожжей Saccharomyces cerevisiae S179-5А выращивалась на плотной питательной среде Сабуро (с хлорамфениколом) при температуре 30°С в термостате ТС0-1/80 (Смоленское СКТБ СПУ, Россия) в течение 48 часов. После этого клетки смывали стерильным физиологическим раствором объемом 100 мл и доводили до оптической плотности 9,7 единиц по МакФарланду с использованием прибора для определения мутности Densi-La-Meter II (Erba Lachema s.r.o, Чехия).

Дополнительно была подготовлена культура клеток дрожжей Saccharomyces cerevisiae S179-5А в жидкой питательной среде Сабуро в объеме 400 мл (два флакона по 200 мл), выращенная при температуре 30°С в термостате ТС0-1/80 (Смоленское СКТБ СПУ, Россия) в течение 48 часов.

Выращенную культуру (охлажденную при температуре 2-4°С, 100 мл с плотностью 5,4 ед.) разливают в 6 пробирок (по 16,5 мл) и центрифугируют 8 мин при 2000 об/мин (Центрифуга ЦЛС-3, ТУ5-375-4170-73).

Супернатант сливают, а осадок собирают в 4 пробирки, ресуспендируют в 50 мл охлажденной дистиллированной воды и центрифугируют в тех же условиях.

Супернатант сливают, осадок из 4-х пробирок ресуспендируют, наливают по 16 мл охлажденной воды в каждую пробирку, и центрифугируют в тех же условиях. После центрифугирования пробирки с осадком клеток дрожжей взвешивают и наливают буфер СИД с дитиотреитолом (ДТТ).

Осадок ресуспендируют в буфере СИФ (без фермента), добавляют 10 мл буферной среды СИФ. Измеряют начальную оптическую плотность суспензии, разбавляя водой отбираемую аликвоту так, чтобы показание спектрофотометра было около 1 (длина волны 450 нм, кювета -10 × 10 мм), (цифровой UV-VIS спектрофотометр PD-303 UV, Япония).

Биомассу клеток дрожжей подвергают ферментативной обработке для получения сферопластов - промежуточной стадии перед выделением культуры митохондрий.

Фермент зимолиазу (GEO13.0001 20 т-20000 u/g, производство компании GRISP) в количестве 1 мг вносят в суспензию в объеме 35 мл с оптической плотностью, равной 1, для образования сферопластов. Инкубируют при постоянном перемешивании на магнитной мешалке при 30°С (магнитная мешалка ПЭ-6110).

Образование сферопластов контролируют с помощью спектрофотометрии. Каждые пять минут отбирают аликвоту, разбавляют водой (в том же количестве, что и при измерении начальной оптической плотности), и проводят измерение на спектрофотометре. Критерием образования сферопластов является уменьшение оптической плотности в 10 раз.

Проба была оставлена при комн. температуре в лаборатории и на следующий день были произведены замеры, которые показали в 11.00 - 0,101. Таким образом, уменьшение оптической плотности произошло в 10 раз.

Остановку ферментативного метода воздействия на клетки дрожжей осуществляют добавлением фенилметилсульфонилфторида (PMSF).

Проба, охлажденная два часа, в количестве 35 мл после обработки зимолазой была разлита в две пробирки.

Осадок промывают один раз, ресуспендируя стеклянной палочкой в 40 мл СПП буфера и центрифугируют 8 мин при 2000 об/мин.

После последнего центрифугирования осадок ресуспендируют стеклянной палочкой и в каждую пробирку вносят по 6 мл раствора СВ1.

Разрушение сферопластов осуществляют в гомогенезаторе. В гомогенизатор вносят объем пробы в количестве 6 мл поочередно из каждой пробирки и обрабатывают пестиком - 20 движений.

В две пробирки, в которых было по 6 мл пробы, добавляют по 10 мл среды СВ2 и центрифугируют 10 минут 3000 об/мин при температуре 2-4°С для осаждения разрушенных сферопластов (центрифуга ЦЛМН-Р10-01-ЭЛЕКТРОН, Liston).

Супернатант каждой пробирки (объем 16 мл) переливают в чистые конические пробирки по 3,5-4,0 мл, после чего производят один раз высокоскоростное центрифугирование для осаждения митохондрий (11000 об/мин 10 минут) (центрифуга High speed centrifuge type 310, 013137-П, VOLTAGE-RPM, Poland).

В конце осадок митохондрий переносят в эппендорф.

В четыре пробирки к осадку наливают по 0,5 мл раствора СВ2, стеклянной палочкой перемешивают осадки и собирают в одну пробирку (0,5×4=2,0 мл). Дозатором 1,0 мл пробы переносят в эппендорф объемом 1,5 мл, и по 0,5 мл в два других эппендорфа.

Изображения дрожжей Saccharomyces cerevisiae и их митохондрий были получены с помощью атомно-силового микроскопа СММ-2000 (ОАО «Завод Протон- МИЭТ», Россия) в контактном режиме в воздушной среде. В качестве подложки используют слюду, на поверхность которой наносят 5 мкл водного раствора соответствующих образцов. Сканирование происходит после полного высыхания капли.

В процессе сканирования используют кантилеверы MSCT (Bruker, США), предназначенные для исследования биологических образцов. Основные геометрические параметры используемого зонда, а также количественные его характеристики, приведены на фиг. 3.

Фото дрожжей Saccharomyces cerevisiae и их митохондрий приведены соответственно на фиг. 4 и фиг. 5.

Далее проводят инфицирование митохондрий вирусом А и количественный учет роста вируса гриппа А в митохондриях дрожжей Saccharomyces cerevisiae.

Полученное рабочее разведение вируса гриппа А 9,2×10⁴ ГЭ/мл инфицируют во взвесь митохондрий и сферопластов, полученных из 100 мл суспензии дрожжей в физ. Растворе мутностью 5,0 по McFarland и из 200 мл 2-суточной бульонной культуры дрожжей. В качестве контроля опыта рабочее разведение вируса гриппа А вносят в 0,9% раствор хлорида натрия (физ.раствор).

Рабочее разведение вируса гриппа А смешивают со взвесью митохондрий, сферопластов и физ.раствором (контроль опыта) в соотношении 1:1 (0,5 мл: и 0,5 мл) в двух параллелях. Инкубацию реакционной смеси осуществляют при температуре 30°С в термостате ТС0-1/80 (Смоленское СКТБ СПУ, Россия) в течение до 90 часов.

Отбор проб для определения концентрации вируса осуществляют в четырех временных точках: 0 ч, 18 ч, 24 ч, 90 ч.

Выделение нуклеиновых кислот и амплификацию осуществляют одномоментно.

Полученные результаты (фиг.6 и фиг.7) свидетельствуют об увеличении концентрации вируса гриппа А, по отношению к контролю опыта, во взвеси с митохондриями в 1,4 раза в точке 18 ч., в 2 раза (min в 1,3; max в 4,3) в точке 24 ч., в 3 раза - 90 ч. Таким образом, в течение суток во взвеси с митохондриями наблюдалось максимальное увеличение количества вируса гриппа А в 4,3 раза.

Таким образом, предлагаемый приоритетный способ культивирования высокопатогенного вируса гриппа А в митохондриях дрожжей имеет перспективы использования в производстве вакцин без применения куриных яиц и культур клеток тканей млекопитающих, в том числе человека.

Изобретение относится к области биотехнологии и вирусологии. Предложен способ культивирования высокопатогенного вируса гриппа А. Способ включает следующие этапы: а) размножение культуры клеток в свободной от культуральной жидкости среде, б) инфицирование культуры клеток с помощью вируса гриппа А, в) инкубацию инфицированной вирусом гриппа культуры клеток при условиях, которые позволяют осуществлять увеличение численности вируса гриппа, при этом в качестве культуры клеток используют культуру митохондрий дрожжей Saccharomyces cerevisiae SI79-5А (ВКПМ Y-100). Способ позволяет отказаться от использования культуры клеток органов млекопитающих. 2 з.п. ф-лы, 7 ил., 1 табл.

1. Способ культивирования вирусов гриппа А в культуре клеток, включающий этапы:

а) размножение культуры клеток в свободной от культуральной жидкости среде,

б) инфицирование культуры клеток вирусом гриппа,

в) инкубация инфицированной вирусом гриппа культуры клеток при условиях, которые позволяют осуществлять культивирование вируса гриппа, отличающийся тем, что в качестве культуры клеток используют культуру митохондрий дрожжей Saccharomyces cerevisiae.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве культуры клеток используют культуру митохондрий дрожжей Saccharomyces cerevisiae S179-5A ВКПМ Y-100.

3. Способ по п. 2, отличающийся тем, что культуру митохондрий дрожжей Saccharomyces cerevisiae S179-5А ВКПМ Y-100 используют для размножения по этапу «а» в виде суспензии, для чего производят освобождение культуры митохондрий от культуральной жидкости центрифугированием, освобожденные клетки обрабатывают ферментом зимолиазой для получения промежуточной культуры сферопластов, которые затем разрушают в гомогенизаторе Даунса, и вновь центрифугируют.