МЕТОД ПЕРВИЧНОЙ ИЗОЛЯЦИИ ШТАММОВ ВИРУСА ГРИППА A, ШТАММ VIRUS A/DUCK/NOVOSIBIRSK/56/05 H5N1 ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ, ПРОФИЛАКТИЧЕСКИХ И ЛЕЧЕБНЫХ ПРЕПАРАТОВ, ДЛЯ ОЦЕНКИ ПРОТИВОВИРУСНОЙ АКТИВНОСТИ РАЗЛИЧНЫХ СОЕДИНЕНИЙ Российский патент 2007 года по МПК C12N7/00 

Изобретение относится к медицинской вирусологии, в частности к проблеме диагностики, лечения и профилактики гриппа А, и предназначено для разработки средств и методов биологической защиты.

Известно относительно немного чувствительных клеточных культур для первичной изоляции вирусов гриппа А. Традиционно для выделения вирусов гриппа из зараженного биологического материала применяют куриные эмбрионы. В настоящее время для первичной изоляции вируса гриппа предложены культуры тканей млекопитающих (MDCK). По методу Davis H.W. е.a. (Bull. Wid. Htlh. Org., 1978, v.14, p.1445-1448) первичную изоляцию вирусов гриппа человека проводят в культуре клеток почки собаки спаниель (MDCK) с добавлением в поддерживающую среду TPCK-treated tripsin, XIII fraction, Sigma, в конечной концентрации 2 мкг/мл. В литературе нет данных изоляции вируса гриппа А с использованием культур клеток СПЭВ. В литературе нет данных о первичной изоляции вируса гриппа А с помощью культур клеток СПЭВ, также нет до сих пор рекомендаций ВОЗ по культивированию вируса гриппа А в культурах клеток СПЭВ для производства диагностических и профилактических препаратов.

Г.А.Данлыбаева и др. (Вопросы вирусологии 1991, 1, с.10-13), изучая чувствительность клеток культур тканей человека и животных, обнаружили, что вирус гриппа штамм А/морской голубок/Астрахань/31/76(H5N3) активно репродуцировался не только в клетках MDCK, но и в перевиваемой культуре клеток почки эмбриона свиньи (СПЭВ). Классической системой для производства диагностических и профилактических препаратов являются развивающиеся куриные эмбрионы. Известен способ культивирования вируса гриппа в клетках Vero (SU 614873, 15.10.1997, 849716).

В настоящее время для производственных целей по рекомендации Всемирной Организации Здравоохранения (ВОЗ) используют штаммы вируса гриппа А, культивируемые в куриных эмбрионах или в культурах клеток почки собак МДСК.

Однако получение антигенов для диагностики гриппа А птиц или сывороток к нему требует сложной дополнительной очистки вируссодержащей аллантоисной жидкости, а в культурах клеток МДСК продукция вируса идет на низком уровне, требует дополнительной концентрации вируссодержащего материала.

Сущность изобретения: первичная изоляция путем заражения культуры СПЭВ биологическим материалом, зараженным или подозрительным на заражение вирусом гриппа А, позволившая выделить инфекционный вирус гриппа А, а именно: штамм вируса гриппа A/duck/Novosibirsk/56/05 H5N1, характеризующийся высокой способностью продуцироваться в культурах клеток почек эмбриона свиньи (СПЭВ). Полученный штамм вируса гриппа А птиц H5N1 характеризуется высокой антигенной активностью, способностью индуцировать вируснейтрализующие, протективные антитела и может быть использован для приготовления тест-систем и других диагностических препаратов, для оценки противовирусной активности различных соединений, для получения вакцины, высокоиммуногенных иммуноглобулинов против вируса гриппа А H5N1, пригодных для создания диагностических, лечебных и профилактических препаратов.

Получение оригинального штамма вируса гриппа A/duck/Novosibirsk/56/05 H5N1.

Штамм вируса гриппа A/duck/Novosibirsk/56/05 H5N1 выделен в период эпизоотии среди домашних птиц (утки и куры) в Новосибирской области (Здвинский район). Из пула внутренних органов больной домашней утки, положительного на РНК Н5 вируса гриппа А, по данным полимеразной цепной реакции (ОТ ПЦР).

Материал от больной утки был использован для первичной изоляции вируса гриппа А методом заражения культур клеток СПЭВ.

Для изоляции вируса использовали свежеприготовленную суспензию культур клеток СПЭВ, полученную из коллекции клеточных культур ГУ НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН. Суспензия содержала 5×10⁶ клеток в 1 мл питательной среды 199 с добавлением антибиотиков и ферментов, трипсин. Подготовленную суспензию клеток СПЭВ разливали в 24 луночные панели по 200 мкл на лунку и по 25 мкл каждой из подготовленных проб смывов или органов от птиц вносили непосредственно в клетки. На каждую пробу использовали по 2 лунки с суспензией клеток. Для заражения культур клеток СПЭВ использовали неразведенные и разведенные в 10 раз пробы из пула органов больной домашней утки. Часть лунок с суспензией клеток оставляли в качестве контролей. Панели в течение 20 мин оставляли при комнатной температуре, периодически слегка встряхивая.

По истечении этого времени в лунки с суспензией клеток панелей добавляли по 0,4 мл среды 199 и панели инкубировали при 37°С в атмосфере CO₂. Через 24 часа после заражения проводили учет по цитопатогенному действию агента.

Инфекционные титры вируса гриппа A (H5N1) учитывали, используя метод Рида и Менча.

Полимеразную цепную реакцию (ОТ-ПЦР) использовали для определения генома вируса гриппа А (Н5) в образцах проб, отобранных из зараженных культур клеток СПЭВ на стадии максимального проявления цитопатогенной активности вируса.

Дальнейшее определение типа гемагглютинина и нейраминидазы осуществляли методом микрочипов.

Таким образом, использование культур клеток СПЭВ для первичной изоляции вируса позволило выделить инфекционный вирус гриппа A/duck/Novosibirsk/56/05 H5N1

Идентификация штамма A/duck/Novosibirsk/56/05 H5N1.

Идентификация штамма была проведена методами реакции торможения гемагглютинации, ОТ-ПЦР с использованием праймеров к геному вируса гриппа А, методом секвенирования амплифицированных участков генома вируса гриппа, достоверно показавшего наличие гена, кодирующего гемагглютинин Н5 вируса гриппа. Методом микрочипов было установлено, что изолированный вариант относится к H5N1 вируса гриппа птиц. Методом анализа последовательностей нуклеиновых кислот показано также, что ген, кодирующий гемагглютинин 5, содержит сайт нарезания, характерный для патогенных штаммов вируса гриппа А H5N1.

Штамм A/duck/Novosibirsk/56/05 H5N1 депонирован в Государственную коллекцию вирусов, регистрационный номер 2371.

Физико-химические признаки.

Индекс инактивации дезоксихолатом натрия - 5,2. Индекс термоинактивации - 5,5 (при прогревании в течение 20 мин при 50°С). При фильтрации вируссодержащей суспензии через миллипоровые фильтры размером 100 нм снижение инфекционного титра не наблюдали. Это свидетельствует о том, что штамм вируса имеет размеры до 100 нм и содержит в своем составе липопротеидную оболочку.

На основании анализа первичной структуры РНК, антигенных признаков выделенный штамм вируса отнесен к семейству Orthomyxoviridae.

Культуральные свойства.

Взаимодействие штамма вируса гриппа А птиц с культурами клеток различного происхождения (СПЭВ, Vero, МДСК) происходит в форме острой инфекции, сопровождается деструкцией клеток, наступающей, как правило, через 24-48 часов после заражения с накоплением вируса в культуральной среде в титрах до 10,0 lg ТЦД50/МЛ. В культуральной жидкости инфицированных штаммом A/duck/Novosibirsk/56/05 H5N1 культур клеток накапливается РНК ВГС, выявляемая с помощью праймеров к области генов, кодирующих гемагглютинин Н5, а также гемагглютинины в титрах до 1:256. При роллерном культивировании инфицированных штаммом ВГС фибробластов куриного эмбриона в культуральной жидкости на 4-5-е сутки после инфекции накапливаются гемагглютинины, агглютинирующие эритроциты гуся в титре до 1:128.

Антигенные свойства.

Антигенные свойства штамма A/duck/Novosibirsk/56/05 H5N1 изучены в РГА и РТГА, в реакции биологической нейтрализации, методом иммуноферментного анализа. В реакциях использовали поликлональные сыворотки, полученные к вирусу гриппа А H5N1. Реакцию биологической нейтрализации ставили с разведениями сывороток 1:10 и с десятикратными разведениями вируссодержащего материала. Реакцию нейтрализации учитывали по индексу нейтрализации.

Иммуногенные свойства.

Высокие антигенные свойства штамма A/duck/Novosibirsk/56/05 H5N1 позволяют использовать его для получения высокоиммуногенных сывороток) или иммунных асцитических жидкостей. Показано, что однократное заражение мышей инактивированным ультрафиолетом вируссодержащим материалом позволяет выявлять на 14-16 сутки антитела к вирусу гриппа А в сыворотке крови, активно реагирующие в РТГА и в ELISA (титры антител 1:40, 1:80 соответственно).

Диагностический препарат - антиген из штамма A/duck/Novosibirsk/56/05 H5N1 получают путем роллерного культивирования вируса в культурах клеток СПЭВ с последующим осветлением культуральной жидкости, а при необходимости осаждением путем ультрацетрифугирования вируса в бляшку на пике проявления его гемагглютинирующей активности (24 часа после заражения). В этом случае гемагглютинирующая активность вируса из бляшки достигает титра 1:5120.

Профилактический препарат (культуральную инактивированную вакцину) готовят из культуральной жидкости, собранной из инфицированных штаммом вируса гриппа А культур клеток СПЭВ на 2-3 сутки после заражения при роллерном выращивании урожая вируса. Сбор культуральной жидкости инактивируют формальдегидом в концентрации 1:2000 в течение 60 суток при +4°С или ультрафиолетовыми лучами в установке в течение 1,5 минут, проверяя остаточную инфекционность и сохранение антигенной активности.

Скрининг противовирусных препаратов основан на использовании инфицированных штаммом A/duck/Novosibirsk/56/05 H5N1 культур клеток СПЭВ, которые обрабатывают препаратами до, после или в момент заражения штаммом вируса гриппа А. Результаты учитывают по способности тех или иных соединений в разных условиях использования подавлять репликацию вируса гриппа А в культурах клеток СПЭВ.

Пример 1.

Метод изоляции вируса птичьего гриппа А. С этой целью используют суспензию перевиваемой линии клеток почки эмбриона свиньи (СПЭВ), приготовленную на среде 199 с добавлением 100 ЕД пенициллина и стрептомицина, для выделения вируса гриппа проводят инфицирование суспензии клеток в объеме 1-2 мл пробами полевого материала в объеме до 0,2-0,4 мл в 25 см³ флаконах с последующей 30-минутной инкубацией смеси вирус-клетка при комнатной температуре для оптимальной адсорбции вируса. По окончании периода адсорбции вируса на клетки объем вируссодержащей суспензии во флаконе доводят средой 199 с добавлением антибиотиков и трипсина (TPCK-treated tripsin, XIII fraction, Sigma до 10 мл), инкубируют в термостате с подачей CO₂ при 37°С до проявления цитодеструкции. Использование для изоляции вируса гриппа А серии десятикратных разведений проб полевого материала для заражения культур клеток позволяет повысить эффективность выделения вируса гриппа А.

Пример 2

Получение вируссодержащей культуральной жидкости, необходимой для производства диагностических препаратов на основе предлагаемого высокопродуктивного штамма вируса A/duck/Novosibirsk/56/05 H5N1. В качестве материала для исследований за отсутствием аналога предлагаем штамм A/duck/Novosibirsk/56/05 H5N1, которым заражали монослой культур клеток СПЭВ, выращенный роллерным способом. Для заражения используют 10 ТЦД₅₀/ на клетку и после часового контакта клетки трижды отмывают от неадсорбированного вируса, после чего вносят ростовую среду 199 с 1% сыворотки эмбриона телят и инкубируют на роллерной установке при 37°С в течение 24-48 часов, когда в культурах будут отмечены отчетливые явления цитодеструктивного действия вируса. Полученные данные, характеризующие слив культуральной жидкости, пригодной для получения антигенов вируса гриппа, приведены в таблице.

Таким образом, высокопродуктивный штамм ВГС может быть использован для производства диагностических препаратов.

Пример 3.

Получение вируссодержащей культуральной жидкости, необходимой для производства профилактических препаратов (культуральной инактивированной вакцины) на основе предлагаемого высокопродуктивного штамма вируса A/duck/Novosibirsk/56/05 H5N1. В качестве материала для исследований за отсутствием аналога предлагаем высокопродуктивный для культур клеток СПЭВ и Vero-Е6 (перевиваемые культуры клеток почки зеленой мартышки) штамм A/duck/Novosibirsk/56/05 H5N1, которым заражали монослой культур клеток Vero-Е6, выращенный роллерным способом. Для заражения используют 10,0 ТЦД₅₀/на клетку и после часового контакта клетки трижды отмывают от неадсорбированного вируса, после чего вносят ростовую среду 199 с 0,1% альбумина человека телят и инкубируют на роллерной установке при 37°С в течение 24-48 часов, когда в культурах будут отмечены отчетливые явления цитодеструктивного действия вируса. Полученные данные, характеризующие слив культуральной жидкости, пригодной для получения культуральной инактивированной вакцины против гриппа H5N1, приведены в таблице.

Таким образом, высокопродуктивный штамм ВГС может быть использован для производства профилактических препаратов.

Пример 4.

Получение экспериментальной модели: вирус птичьего гриппа А (H5N1) и чувствительные для его репликации культуры клеток СПЭВ, пригодной для скрининга противовирусных препаратов.

Культуры клеток СПЭВ обрабатывают нетоксическими для клеток дозами препаратов до, после или в момент заражения штаммом вируса гриппа А. Результаты учитывают по способности тех или соединений в разных условиях подавлять репликацию вируса гриппа А в культурах клеток СПЭВ. В качестве контроля служат: инфицированные вирусом гриппа А (штамм A/duck/Novosibirsk/56/05 H5N1) культуры клеток без внесения противовирусных препаратов, незараженные культуры клеток СПЭВ, обработанные препаратами в те же сроки и в тех же дозах.

Таким образом, предлагаемый метод первичной изоляции позволяет выделять вирусы гриппа А. Штамм вируса гриппа A/duck/Novosibirsk/56/05 H5N1, (ГКВ №2371), первичную изоляцию которого провели с помощью этого метода путем заражения культуры клеток почки эмбриона свиньи (СПЭВ), характеризуется высокой способностью репродуцироваться в культуре СПЭВ, способностью индуцировать вируснейтрализующие, протективные антитела. Высокая антигенная активность этого штамма позволяет его использовать для получения высокоиммуногенных сывороток. Штамм вируса гриппа A/duck/Novosibirsk/56/05 H5N1, (ГКВ №2371) пригоден для получения диагностических, профилактических препаратов и для оценки противовирусной активности различных соединений.

Таблица
Инфекционная и антигенная A/duck/Novosibirsk/56/05 H5N1 при роллерном культивировании инфицированных культур клетокКультуры клетокВремя отбора проб культуральной жидкостиКонцентрат вируса6 часов12 часов24 часа40 часов24 часаГАЦПДГАЦПДГАЦПДГАЦПД¹⁾ГАСПЭВ1:801:32+1: 128+++1:256++++1:5120Lg ТЦД₅₀ 4,0 6,2 10,0 10,511,01) ЦПД - цитопатогенное действие вируса гриппа: + - гибель 10-15% клеток; ++ - поражение 50% клеток; +++ - гибель 75-80% инфицированных клеток, ++++ - гибель 100% клеток.

Изобретение относится к медицинской вирусологии. Первичная изоляция штаммов вируса гриппа A/H5N1 происходит путем заражения культуры клеток почки эмбриона свиньи (СПЭВ). Для инкубации зараженной культуры используют поддерживающую среду 199 с добавлением пенициллина и стрептомицина и в присутствии в среде-поддержке ТРСК treated tripsin. Также получен штамм A/duck/Novosibirsk/56/05 H5N1, выделенный описанным выше методом. Штамм характеризуется высокой антигенной активностью, а также способностью индуцировать вируснейтрализующие, протективные антитела. Штамм может быть использован для приготовления тест-систем и других диагностических препаратов. 2 н. и 2 з.п. ф-лы, 1 табл.

1. Метод первичной изоляции штаммов вируса гриппа A/H5N1, включающий заражение культур клеток биологическим материалом, зараженным или подозрительным на заражение вирусом, отличающийся тем, что первичная изоляция вируса происходит путем заражения культуры клеток почки эмбриона свиньи (СПЭВ).2. Метод изоляции вируса гриппа A/H5N1 по п.1, отличающийся тем, что для инкубации зараженной культуры используют поддерживающую среду 199 с добавлением 100 ЕД пенициллина и стрептомицина и в присутствии в среде-поддержке ТРСК treated tripsin, фракция XIII, фирма Sigma, США, в конечной концентрации 2 мкг/мл.3. Метод по пп.1 и 2, отличающийся тем, что для заражения используют серию десятикратных разведений проб полевого материала.4. Штамм вируса гриппа A/duck/Novosibirsk/56/05 H5N1, (ГКВ №2371), выделенный методом по любому из пп.1-3, характеризующийся высокой способностью продуцироваться в культуре клеток почек эмбриона свиньи (СПЭВ), пригодный для получения диагностических, профилактических и лечебных препаратов и для оценки противовирусной активности различных соединений.