Способ получения высокомолекулярного коллагена из биологического материала Российский патент 2025 года по МПК A61K38/36 A61K35/32 A61K35/36 A61K8/65 A61K8/98 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способу получения субстанции, вспомогательных веществ и пищевых добавок - чистого сухого высокомолекулярного коллагена, который может быть использован: в медицине и фармации для получения готовых лекарственных форм, косметологии для получения косметических препаратов, функциональных и специализированных продуктов питания и биологически активных добавок.

Коллаген - гликопротеин, фибриллярный белок, составляющий основу соединительной ткани организма (сухожилие, кость, хрящ, дерма и т. п.) и обеспечивающий её прочность и эластичность. В последнее время коллагенсодержащие препараты находят самое широкое применение в медицине, косметологии, фармакологии. Коллаген совместим с большинством лекарственных препаратов и практически не вызывает аллергических реакций, раздражающего воздействия и используется в производстве различных мягких и твердых лекарственных форм. Источником коллагена являются, чаще всего, отходы пищевой промышленности, т.к. коллаген содержится в коже, сухожилиях, хрящах (Васильев М.П. Коллагеновые нити, волокнистые и пленочные материалы: Монография. - СПб. СПГУТД. - 2004. - 397 с.).

В настоящее время известны способы получения коллагена из различных видов животного сырья (Неклюдов А.Д., Иванкин А.Н. Биологически активные соединения из природных объектов. Свойства, структурно-функциональные взаимосвязи. М.: МГУЛ, 2003, с. 369-412).

Из уровня техники известен способ получения (патент RU 2076718C, заявка 93014161/14, 09.04.1993, приоритет 09.04.1993, патентообладатель: Курский государственный медицинский институт), который заключается в щелочно-солевой обработке, нейтрализации 10% уксусной кислотой с последующей лиофилизацией. Недостатком данного способа является слабая щелочная вытяжка за счет недостаточной концентрации щелочи, присутствия большого количества клеточных компонентов в целевом продукте из-за нерастворенных пластин дермы, а только измельченных.

Известный способ получения коллагена (патент RU 2672593 C1, заявка 2017125270, приоритет 15.12.2015, патентообладатель ГАЙСТЛИХ ФАРМА АГ) заключается в обезвоживании растворителем как спирт или кетон, обезжиривании хлорсодержащими углеводородами, или гексаном или толуолом. Обработке сильным неорганическим основанием при значении рН, превышающем 12, в течение от 6 до 24 часов и последующей сильной неорганической кислотой при значении рН, равном от 0 до 1, в течение от 1 до 12 часов. Его недостатки в длительности процесса, использовании слишком концентрированных растворов, что способствует разрушению коллагена.

За прототип был взят способ (патент RU 2322249 C1, заявка 2006138769/15, приоритет 02.11.2006, патентообладатель ФГУ «Нижегородский научно-исследовательский институт травматологии и ортопедии Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»). Его недостатки заключаются в отсутствие стадии обезжиривания, что влечет за собой дополнительные примеси, в долгом выделении коллагена за счет очень низких концентраций растворов щелочей и кислот, за счет чего не удается достичь максимально эффективной вытяжки клеточных компонентов из кожи животных, следовательно, повышение количества примесей в целевом продукте, невозможность полностью растворить полученный полупродукт после щелочной обработки, следовательно, низкий выход коллагена, так как он остался в клетках дермы или слишком долгое растворение клеточных компонентов.

С целью усовершенствования известных способов получения коллагена было изучено его выделение из дермы крупного рогатого скота (КРС) методами кислотного и щелочного гидролиза с последующим осаждением в органических растворителях.

Задачей, на решение которой направлена заявляемое изобретение является разработка эффективного метода получения коллагена высокой степени чистоты из дермы КРС с высоким выходом целевого продукта.

Данная задача решается за счет того, что заявленный способ получения отличается от известных проведением стадии предварительного обезжиривания, корректировкой концентрации реагентов и оптимального температурного режима при щелочном и кислотном гидролизе, определением сбалансированного объемного соотношения «гидролизат - растворитель» на стадии осаждения органическими растворителями.

Пример 1.

Стадия 1. Подготовка биологического материала.

Сначала проводят подготовку биологического материала. Дерму гольевого спилка КРС очищают от волос и жировой ткани механическим способом. Далее очищенную дерму измельчают на пластины размером от 0,5 до 1 см² и тщательно промывают водой.

Стадия 2. Обезжиривание дермы КРС.

Подготовленное измельченное биологическое сырье массой 50 ± 0,1 г и обезжиривают в достаточном количестве гексана в течение 30 - 60 минут при t = 60 - 68°C и перемешивании на магнитной мешалке с нагревом в конической колбе. После обезжиривания дерму сушат в вакуум-сушильном шкафу при t = 60°C в течение 30 - 40 минут до постоянной массы. Выход по стадии обезжиривания составил порядка 81 ± 1%, что составило 40 - 41 г обезжиренной дермы.

Стадия 3. Щелочная обработка дермы КРС.

Обезжиренную в гексане дерму, обрабатывали 20% раствором едкого натра в течение 15 минут при t = 95 - 100°C и активном перемешивании на магнитной мешалке с нагревом в конической колбе. При этом происходило изменение цвета раствора от прозрачного до насыщенного коричневого/чайного/коньячного. Гидролиз проводили до начала разрушения клеточного матрикса (дерма предельно мягкая, рыхлая, но не перешла в раствор). Полученный биоматериал промывали 2 л проточной холодной воды, затем небольшим количеством дистиллированной воды до pH=7 - 8, отфильтровывали и сушили 30 - 40 минут при t = 95 - 100°C.

Стадия 4. Кислотная обработка биоматериала.

Промытый полупродукт со стадии щелочного гидролиза выдерживали в 90% уксусной кислоте при t = 100 - 110° в течение 2 - 3 часов с активным перемешиванием в колбонагревателе с перемешивающим устройством до полного растворения всех клеточных компонентов. Кислотный гидролиз проводили в двугорлой круглодонной колбе, снабженной термометром и обратным холодильником. Цвет раствора изменился на желто-коричневый. Полученный гидролизат оставляли при комнатной температуре до полного охлаждения.

Стадия 5. Осаждения коллагена.

Коллагеносодержащий гидролизат приливали в ацетон медленно тонкой струйкой при активном перемешивании. Осаждение проводили в химическом стакане на магнитной мешалке. Коллаген осаждается на мешалке и стенках посуды. Влажный коллаген механически отделяли от мешалки и стенок химической посуды, помещали в стеклянные чаши Петри. Выход по стадиям щелочного, кислотного гидролиза и осаждения составил 65 ± 2% от массы обезжиренной, высушенной дермы, что составило 25,5 - 27,1 г влажного коллагена.

Стадия 6. Сушка и размол коллагена.

Чаши Петри с полученным коллагеном оставляли сушиться при t =45 - 60°C в течение 6 - 12 часов до полного испарения ацетона из сгустков коллагена в вакуум-сушильном шкафу. После высушивания коллагена проводили размол продукта на мельнице. При необходимости проводили досушку измельченного продукта при t =45 - 60°C в течение 1 - 2 часа (до отсутствия запаха ацетона и постоянной массы). Полученный сухой, измельченный коллаген просеивали на сите.

Выход по стадии сушки и размола 48 ± 1% от массы влажного коллагена, что составило 12,5 - 12,7 г чистого, сухого коллагена. Суммарный выход составил 25,0 - 25,4%.

Пример 2.

Стадии 1 - 4 данного метода аналогичны примеру 1.

Стадия 5. Осаждения коллагена.

Коллагеносодержащий гидролизат приливали в диоксан медленно тонкой струйкой при активном перемешивании. Осаждение проводили в химическом стакане на магнитной мешалке. Коллаген осаждается на мешалке и стенках посуды. Влажный коллаген механически отделяли от мешалки и стенок химической посуды, помещали в стеклянные чаши Петри. Выход по стадиям щелочного, кислотного гидролиза и осаждения составил 69 ± 2% от массы обезжиренной, высушенной дермы, что составило 27,1 - 28,8 г влажного коллагена.

Стадия 6 данного метода аналогичны примеру 1.

Выход по стадии сушки и размола 51 ± 1% от массы влажного коллагена, что составило 14,2 - 14,4 г чистого, сухого коллагена. Суммарный выход составил 28,4 - 28,8%.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способу получения субстанции коллагена. Способ получения субстанции коллагена из дермы КРС включает подготовку сырья, измельчение на пластины размером от 0,5 до 1 см², обезжиривание в достаточном количестве гексана в течение 30-60 минут при t = 60-68°C и перемешивание на магнитной мешалке с нагревом, сушку при t = 60°C до постоянной массы, щелочную обработку 20% раствором едкого натра при t = 95-100°C, промывку материала 2 л проточной холодной воды до pH=7-8, фильтрацию и сушку при t = 95-100°C, кислотную обработку 90% уксусной кислотой при t = 100-110°С в течение 2-3 часов, осаждение коллагена приливанием в ацетон или диоксан медленно тонкой струйкой при активном перемешивании, отделение от мешалки и стенок посуды, сушку при t =45-60°C в течение 6-12 часов до полного испарения ацетона, размол продукта на мельнице, просеивание на сите. Изобретение обеспечивает пониженное содержание примесей, сокращение времени получения коллагена, получение коллагена высокой степени чистоты с высоким выходом целевого продукта. 2 пр.

Способ получения субстанции коллагена из дермы КРС, включающий подготовку сырья, измельчение на пластины размером от 0,5 до 1 см², обезжиривание в достаточном количестве гексана в течение 30-60 минут при t = 60-68°C и перемешивании на магнитной мешалке с нагревом, сушку при t = 60°C до постоянной массы, щелочную обработку 20% раствором едкого натра при t = 95-100°C, промывку материала 2 л проточной холодной воды до pH=7-8, фильтрацию и сушку при t = 95-100°C, кислотную обработку 90% уксусной кислотой при t = 100-110°С в течение 2-3 часов, осаждение коллагена, приливанием в ацетон или диоксан медленно тонкой струйкой при активном перемешивании, отделение от мешалки и стенок посуды, сушку при t =45-60°C в течение 6-12 часов до полного испарения ацетона, размол продукта на мельнице, просеивание на сите.