СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОМПЛЕКСНОГО ПРЕПАРАТА, СОДЕРЖАЩЕГО МУКОПОЛИСАХАРИДЫ И КОЛЛАГЕН ИЗ ЖИВОТНОГО СЫРЬЯ Российский патент 1997 года по МПК A61K35/32 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способам получения биологически активных веществ из животного сырья и может быть использовано в косметологии и медицине.

Мукополисахариды (МП) представляют собой внеклеточные вещества соединительных тканей животных, в норме связаны с белками, в частности с коллагеном. Они обеспечивают сцепление эластичных волокон и тем самым прочность структуры кожной поверхности. Структурными элементами МП являются глюкуроновая кислота и аминосахара. Коллаген является основным белком соединительной ткани, состоит из макромолекул, имеющих уникальную трехспиральную структуру и составляет 1/3 всех белков организма животного. Коллаген содержится в коже, костях, сухожилиях, сосудах, хрящах, преимущественно в виде нерастворимых внеклеточных волокон. Аминокислотный состав коллагена высокоспецифичен и состоит из 19 аминокислот, причем две не встречаются в других белках (оксипролин и оксилизин).

Известны различные способы извлечения МП из животного сырья: хрящей, трахей, легких, тонкого кишечника, кожи и других органов. Все известные способы получения МП предусматривают выделение определенного МП или смеси МП и отличаются исключительной трудоемкостью, длительностью, многостадийностью и низким выходом целевого продукта. В зависимости от источника выделения меняется состав МП и их выход. К мукополисахаридам относятся: гепарин, гепаран-сульфат, дерматан-сульфат, кератан-сульфат, хондроитин-сульфат (АВ и С), гиалуроновая кислота.

Известно, что МП используются в медицине и косметологии, причем совместно с другими компонентами, одним из которых является коллаген [1 2] С другой стороны, исходное сырье для выделения МП часто тоже содержит коллаген, от которого в процессе стадий очистки МП приходится избавляться.

В связи с этим встает актуальная задача разработки способа получения комплексного препарата, содержащего МП и коллаген одновременно.

Известен способ получения МП из органов животных, включающий следующие последовательные стадии [3]
1. Измельчение исходного сырья (25 кг) в мельнице и суспензирование в 25 л воды.

2. Щелочная экстракция в 10% NaOH при 70^oC в течение 12 ч.

3. Нейтрализация суспензии конц. HCl до pH 6 и фильтрование на фильтр-прессе.

4. Энзимолиз фильтрата папаином при 45^oC в течение 24 ч с последующей инактивацией фермента нагреванием до 90^oC.

5. Осаждение продукта ацетоном (выход 1%).

6. Для отделения нуклеиновых кислот осадок растворяют в воде и добавляют ZnCl₂, осадок отфильтровывают.

7. Из супернатанта осаждают цинковую соль сульфомукополисахаридов двумя объемами ацетона.

8. Полученный порошок перерастворяют в щелочном растворе и осаждают в присутствии NaCl четвертичными аммониевыми солями.

9. Полученный продукт нагревают (для разложения комплексной соли четвертичного аммония) и получают 10 г целевого продукта. Выход МП составляет 0,04%
В качестве сырья используют тонкий кишечник, легкие, кожу, трахеи, глаза, плаценту коров и свиней.

Недостатком известного способа является его длительность (170 ч), многостадийность и низкий выход целевого продукта.

Известен способ получения коллагена [4] из ткани животных, включающий следующие последовательные стадии:
1. Ткани животных, содержащие коллаген, измельчают и обрабатывают 5 - 15%-ным водным раствором хлористого натрия.

2. Полученную волоконную кашицу промывают водой или 0,1 0,5%-ным раствором органической кислоты (муравьиной, уксусной или лимонной) для удаления неколлагеновых белков и телопептидов.

3. К смеси добавляют пять объемов 0,1 5% уксусной кислоты до pH 2,5 - 3,5 и пепсин и инкубируют смесь 8 48 ч.

4. Для осаждения коллагена в суспензию добавляют хлорид натрия до конечной концентрации 3 -5%
5. Осадок отделяют фильтрованием или центрифугированием.

6. Полученный коллаген обессоливают путем диализа, ультрафильрованием или промыванием 60 75%-ным этиловым спиртом.

7. Обессоленный коллаген перерастворяют в воде и направляют на лиофильную сушку.

8. После сушки коллаген подвергают термообработке или обработке с использованием газообразных галогеноводородов.

Недостатком известного способа является его длительность, трудоемкость и невозможность извлекать совместно с коллагеном МП.

Наиболее близким к заявляемому способу прототипом, является способ получения МП хондроитинсульфата (ХС) [5] заключающийся в следующем:
Трахеи крупного рогатого скота измельчают, обезжиривают при нагревании в воде при 60 95^oC в течение 4-х ч, охлаждают, центрифугируют и отделяют жир.

К смеси добавляют 0,5 3,5 М раствор хлорида натрия, экстракцию ведут при 60 70^oC, затем доводят концентрацию хлорида натрия до 0,3 1,0 моль/л и pH 6,6 8,0, экстракт сорбируют на анионообменной смоле АМ-П при 50 80^oC и pH 7,5 ±0,5 при постоянном перемешивании в течение 6 ч. Целевой продукт элюируют 1,8 3 М раствором хлорида натрия. К охлажденному до 5 10^oC раствору хондроитинсульфата добавляют при интенсивном перемешивании охлажденный этанол, осадок отделяют центрифугированием. Получают ХС- сырец, который затем очищают от примесных белков известными средствами (12 стадий очистки).

Выход ХС 0,48 1,2% от исходного сырья. Количественное содержание ХС - 95 97%
Недостатком прототипа является многостадийность способа (24 стадии), длительность (приблизительно 180 ч) и низкий выход целевого продукта.

Технической задачей изобретения является упрощение способа и повышение его функциональных возможностей.

Поставленная задача достигается предлагаемым способом, заключающемся в следующем:
Соединительную ткань животных тщательно измельчают и заливают двумя объемами 2 8% щелочи, смесь инкубируют 8 48 ч до получения желеобразной гомогенной массы. К щелочному гидролизату при перемешивании добавляют концентрированную хлорную кислоту до pH 1,5 2,5 и проводят экстракцию при комнатной температуре. По окончании жмых отделяют фильтрацией или центрифугироваанием, а фильтрат диализуют через полупроницаемую мембрану против дистиллированной воды. В конце диализа на стенках диализных мешков образуется осадок, а pH диализата равен pH воды (5,5 6,0). Полученный осадок центрифугируют и направляют на сушку.

Выход целевого продукта составляет 3,5 7,0%
Целевой продукт (условное наименование "Каллон") представляет собой гигроскопичный порошок белого цвета, хорошо растворимый в воде и физрастворе и плохо растворимые в спирте и органических растворителях.

По качественному и количественному составу результаты анализа следующие:
Количественное содержание МП (по количеству уроновых кислот) 30 39%
Количественное содержание коллагена (по количеству оксипролина) 60 - 69%
Идентификацию и количественное определение МП выполняли посредством электрофореза по методу B. Casn et al. [6] Наличие нуклеиновых кислот в препарате не обнаружено. Тестирование примесей выявило следы низкомолекулярных пептидов в пределах 0,5 1%
Отличительными признаками заявляемого способа по сравнению с прототипом являются:
1. Измельченные ткани животных подвергают щелочному гидролизу, что позволяет повысить выход целевого продукта за счет селективного разрушения обычных белков и освобождения кислых МП и коллагена, а также разрыхления волокнистых структур соединительной ткани. Если перед кислотной экстракцией не проводить щелочной гидролиз, то выход целевого продукта снижается в 2 -3 раза.

Для проведения гидролиза, преимущественно используют 2 8%-ную щелочь, чтобы избежать перегидролиза и разрушения коллагеновых волокон. При использовании щелочи в концентрации менее 2% происходит неполное освобождение необходимой фракции веществ из животной ткани, а при использовании щелочи в концентрации выше 8% возможно разрушение части МП и коллагеновых волокон.

2. Экстракцию проводят хлорной кислотой при pH 1,5 2,5, что позволяет повысить выход целевого продукта и упростить способ за счет селективного извлечения кислоторастворимой фракции веществ, содержащей МП и коллаген, и одновременного удаления (осаждения) высокополимерных нуклеиновых кислот и белков.

Проведение экстракции при pH среды выше 2,5 нежелательно, т.к. понижается выход целевого продукта, а проведение экстракции при pH ниже 1,5 нецелесообразно из-за большого расхода хлорной кислоты и возможности разрушения части биополимера, содержащего МП и коллаген.

3. Выделение целевого продукта проводят путем диализа экстракта против дистиллированной воды, что позволяет упростить способ и обеспечить получение комплексного препарата, содержащего мукополисахариды и коллаген одновременно. Именно диализ позволяет извлекать необходимую фракцию веществ за счет равномерной диффузии молекул воды и диализата и постепенного формирования осадка биополимера с изменением pH среды диализата от кислой (1,5 2,5) до нейтральной (5,5 6,0).

Эксперименты показали, что никакие другие способы выделения целевого продукта (ультрафильтрация, сорбция, хроматография) не позволяют получить комплексный препарат такого состава.

В связи с тем, что в известных научно-технических и патентных источниках аналогичного способа получения комплексного препарата, содержащего МП и коллаген, не обнаружено, можно сделать вывод о соответствии предлагаемого технического решения критериям изобретения "новизна" и "изобретательский уровень".

Пример 1. Все операции проводят при комнатной температуре. 100 г свиных ушей измельчают и заливают 200 мл (2%), NaOH инкубируют при перемешивании 8 ч до образования плотного желе. К плотному желе добавляют 600 800 мл воды и смесь измельчают до получения гомогенной массы.

К гомогенату при перемешивании добавляют концентрированную хлорную кислоту до pH 1,5 и инкубируют смесь 15 мин.

Остатки негидролизованной ткани удаляют фильтрованием через бумажный фильтр. Фильтрат помещают в целлофановые диализные трубки по 200 250 мл и диализуют против четырех объемов (смен) дистиллированной воды. В конце диализа pH диализуемого раствора равен 6,0, а на стенках диализных трубок образуется осадок, который переносят в центрифужные стаканы и цетрифугируют со скоростью 5 тыс.об/мин в течение 5 мин. Надосадочную жидкость отбрасывают, а полученный препарат лиофильно высушивают. Выход препарата 4,5 г (4,5% ).

Содержание в комплексном препарате в
Мукополисахариды 36
Коллаген 63
Нуклеиновые кислоты Отсутствуют
Анализ качественного состава мукополисахаридов показал, что 98% составляет хондроитинсульфат С, а 2% дерматансульфат.

Пример 2. Способ осуществляют аналогично примеру 1 за исключением того, что в качестве сырья используют сухожилия КРС, гидролиз проводят 4%-ной гидроокисью натрия в течение 12 ч, а экстракцию осуществляют при pH 2,0 в течение 30 мин.

Выход препарат составляет 5%
Содержание мукополисахаридов 35% коллагена 4% нуклеиновые кислоты отсутствуют.

Качественный состав мукополисахаридов в
Хондроитинсульфат С 97
Дерматансульфат 3
Пример 3. 100 кг трахей крупного рогатого скота (КРС) измельчают сначала на мясорубке, а затем на измельчителе до кусочков диаметром 3 5 мм и помещают в экстрактор. В экстрактор приливают 200 л 8%-ной гидроокиси натрия и ведут гидролиз в течение 70 ч.

К гидролизату добавляют 600 л воды и смесь гомогенизируют. Затем к гомогенату приливают 80 л концентрированной хлорной кислоты до pH 2,5 и инкубируют смесь при перемешивании 60 мин. Жмых отделяют на шнековой центрифуге "Де-Слажер", промывают, сушат и используют в качестве кормовой добавки. Надосадочную жидкость направляют на диализ. Для проведения диализа надосадочную жидкость заливают в целлофановые мешки, используемые в качестве полупроницаемой мембраны, которые размещают в корпусе диализатора. В корпус заливают воду в соотношении к надосадочной жидкости 4:1 таким образом, чтобы уровень диализирующей жидкости (воды) был выше уровня надосадочной жидкости. Диализ ведут до появления осадка и установления pH в диализаторе, равном pH воды (6,0). По окончании процесса извлечения необходимой фракции веществ осадок переносят в центрифужные стаканы и центрифугируют на центрифуге К-70 со скоростью 7 тыс. об/мин. Полученный продукт подают на сушку.

Выход препарата составляет 7 кг (7%).

Содержание мукополисахаридов 34% коллагена 65% нуклеиновые кислоты отсутствуют.

Качественный состав мукополисахаридов в
Хондроитинсульфат С 98,5
Дерматансульфат 1,5
Использование предлагаемого способа позволяет по сравнению с прототипом:
увеличить выход препарата в 4 раза;
сократить число стадий процесса с 24-х до 8 стадий;
снизить себестоимость целевого продукта за счет упрощения способа, повышения выхода и исключения дорогих реактивов;
расширить функциональные возможности способа за счет:
а) использования кроме трахей других видов соединительной ткани животных (хрящи, уши, хвосты, сухожилия, кожа, кишечник и др.);
б) одновременного выделения совместно с мукополисахаридами коллагена в виде естественной неделимой смеси.

Полученный комплексный препарат может быть использован в медицине для лечения длительно не заживающих ран и в косметологии в качестве биологически активного компонента различных косметических составов.

Источники информации.

1. Иванова Л.А. Коллаген в технологии лекарственных форм, М. Медицина, 1984.

2. Патент Японии N 60-19725, кл. A 61 K 7/00, публ. 1985. Косметический состав для кожи, содержащий мукополисахариды и коллаген.

3. Патент Японии N 63-297455, кл. A 61 K 35/26, публ. 1989. Способ получения сульфомукополисахаридов.

4. Патент Японии N 60-52130, кл. A 61 K 37/12, публ. 1986. Способ получения коллагена для медицины и косметики.

5. Авторское свидетельство СССР N 1531274, кл. A 61 K 35/32. Способ получения хондроитинсульфата из трахей КРС.

6. B. Сuzu et al. Pharm Resetch Comm. 11, 297, 1979, Качественный и количественный анализ мукополисахаридов.

Применение: биотехнология, медицина и косметология. Техническая задача: упрощение способа и повышение его функциональных возможностей. Сущность изобретения: соединительную ткань животных измельчают, гидролизуют щелочью, гомогенизируют и экстрагируют хлорной кислотой при pH 1,5 - 2,5 при комнатной температуре. Экстракт отфильтровывают, а осадок промывают, высушивают и используют в качестве кормовой добавки. Целевой продукт из экстракта выделяют путем диализа через полупроницаемую мембрану против дистиллированной воды. В конце диализа на мембране образуется осадок, а pH диализата равен 6,5 - 6,0. Осадок отделяют центрифугированием и подают на сушку. Выход препарата 3,5 - 7,0%. Комплексный препарат содержит 30 - 39% мукополисахаридов и 60 - 65% коллагена. Положительный эффект. Предлагаемый способ отличается простотой, не требует дорогих импортных реактивов и обеспечивает получение комплексного препарат, содержащего мукополисахариды и коллаген. Способ применим для любых видов соединительной ткани животных (трахеи, хрящи, уши, кишечник, кожа и другие органы). 2 з.п. ф-лы.

1. Способ получения комплексного препарата, содержащего мукополисахариды и коллаген из животного сырья, включающий измельчение последнего, гидролиз водным раствором гидроокиси натрия, гомогенизацию, экстракцию кислотой, выделение и сушку целевого продукта, отличающийся тем, что экстракцию проводят хлорной кислотой при рН 1,5 2,5, а целевой продукт выделяют из экстракта диализом через полупроницаемую мембрану. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что гидролиз проводят 2,0 8,8%-ным водным раствором гидроокиси натрия в течение 8 70 ч в зависимости от исходной ткани. 3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что диализ проводят через целлофан против дистиллированной воды.