Способ получения наноразмерного лиофилизированного гидролизата коллагена Российский патент 2024 года по МПК A61K35/60 A61K38/01 B82Y40/00 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно, получению наноразмерного гидролизата коллагена из плавательного пузыря осетровых и сиговых видов рыб, который может быть использован для получения медицинских и косметических средств, биологически активных добавок (БАД), препаратов для заместительной и регенеративной хирургии, а также в качестве наномодификатора при создании полимерных материалов.

Известно, что коллаген - это наиболее распространенный фибриллярный белок, составляющий основу соединительной ткани. Способность к биодеградации, очень низкая антигенность, высокая биосовместимость, высокая механическая прочность и устойчивость к тканевым ферментам, способность образовывать комплексы с биологически активными веществами (гепарином, антибиотиками и др. веществами, содержащими функциональные группы), стимуляция регенерации собственных тканей организма позволяют отнести коллаген к незаменимым медико-биологическим материалам. Сырьем для получения коллагена являются отходы кожевенной, пищевой промышленности, а также многочисленные отходы производств по переработке промысловых рыб. При этом на основе коллагена получают ценные пищевые продукты, медицинские препараты, косметические средства, биологически активные добавки и одновременно решают экологические проблемы, связанные с утилизацией отходов.

Рыбный коллаген имеет определенный ряд преимуществ по сравнению с коллагеном животного происхождения, получаемым из шкур и костей крупного рогатого скота (КРС), он, прежде всего, безопасен, т.к. для животного сырья характерно наличие возбудителей болезней, например, губчатой энцефалопатии, носителями которых является домашний скот. Кроме того, животный коллаген плохо усваивается организмом по сравнению с рыбным. Коллаген, входящий в состав рыб, благодаря своему уникальному химическому составу близок к человеческому коллагену, не вызывает аллергической реакции, на 96% идентичен человеческому белку, обладает трансдермальными свойствами и обладает способностью проникать через кожу.

Известны способы выделения коллагена из природного сырья, среди которых применяют кислотный, щелочной, щелочно-солевой, электрохимический, ферментативный гидролиз и другие методы.

Известен способ получения полностью гидролизованного коллагена (см. RU №2680968, кл. С07К 1/12, С07К 2/00, опубл. 01.03.2019), включающий гидролиз гольевого спилка шкур КРС в присутствии соляной кислоты, сорбцию аминокислот коллагена на среднесшитом катионите, элюцию аминокислот и аммиака щелочью, отгонку аммиака из элюата под вакуумом, нейтрализацию и осветление раствора аминокислот на ионосорбенте, при этом часть соляной кислоты, химически не связанную с аминокислотами, после окончания гидролиза удаляют в виде хлористого водорода путем вакуум-отгонки.

Недостатком известного решения является многостадийность и сложность технологического процесса. Кроме того, в источнике отсутствуют сведения о дисперсности полученного продукта.

Способ получения функционального коллагенового гидролизата по патенту RU №2409216 (кл. A23J 1/10, опубл. 20.01.2011) включает приемку коллагенсодержащего сырья - отходы жиловки мяса, удаление жира и мышц, промывку, измельчение, ферментативный гидролиз в две стадии с использованием препаратов Нейтраза 1.5 MG и Коллагеназа пищевая. После обработки гидролизат отделяют, упаковывают и замораживают.

Недостатком известного способа является многостадийность и длительность процесса.

Известен способ получения коллагена из шкур прудовых рыб (см. RU №2501812, кл. С08В 37/08, А61К 35/60, А61К 38/39, А61К 31/728, C12N 9/14, опубл. 20.12.2013), заключающийся в отбеливании перекисно-солевым раствором, набухании в 1,0-1,2%-ом растворе гидроксида натрия, нейтрализации 3%-ым раствором борной кислоты, обработке «Панкреатином» с целью доочистки коллагена и промывке холодной водой. Сушку коллагена проводят в сушильных камерах с принудительной циркуляцией воздуха при 18-20°С.

Недостатком известного технического решения является отсутствие контроля качества конечного сырья, при этом нет возможности получения данных о размере частиц, химической структуре, микробиологических характеристиках продукта.

Известен способ получения сухого микропорошка коллагена (см. RU № 2604504, кл. A23L 29/281, опубл. 10.12.2016), по которому плавательные пузыри рыбы семейства осетровых вначале промывают, механически удаляют жировые примеси и слизи, сушат при комнатной температуре в течение 72-80 часов, проводят механоактивацию в мельнице планетарного типа при скорости вращения мелющих тел не менее 700 оборотов в минуту до достижения фракции частиц микропорошка не более 15 мкм в течение 10-15 минут.

При этом требуется применение специализированного оборудования для механоактивации, кроме того, известный способ не предусматривает очистку, а получаемый порошок характеризуется грубодисперсными размерами частиц коллагена, что ограничивает области применения данного продукта.

Известен способ по заявке RU №2006104108 (кл. А61К 35/60, опубл. 27.07.2006) для получения гидролизата рыбьего белка из остатков мяса рыбы ферментативным гидролизом при рН в интервале 5,0-8,0 и при температуре в интервале 40-70°С, с последующим нагреванием до 90-99°С, декантацией, фильтрованием, разделением в трехфазном сепараторе с выделением масляной, эмульсионной и водной фракций. Далее водную фракцию фильтруют через ультрамембрану, а затем подвергают распылительной сушке.

Основным недостатком известного способа является использование высоких температур, при которых возможна денатурация белка.

Наиболее близким к заявленному техническому решению по технической сущности является способ получения коллагена (см. RU №2076718, кл. A61K 35/36, A61K 35/32, опубл. 04.10.1997), в котором сырье (дерма) подвергают щелочно-солевой обработке, нейтрализации уксусной кислотой, с последующим замораживанием, лиофильной сушкой и измельчением, без последующей стерилизации.

Недостатком известного решения является невозможность контролировать размеры частиц получаемого продукта, длительность сушки (до 36 час) в лиофильной камере, отсутствие стадии очистки от низкомолекулярных примесей.

Задачей, на решение которой направлено изобретение, является разработка способа получения из плавательного пузыря рыб наноразмерного лиофилизированного гидролизата коллагена.

Технический результат получаемый при решении поставленной задачи выражается в получении наноразмерного лиофилизированного гидролизата коллагена из плавательного пузыря рыбы из семейства осетровых и сиговых, пригодного для использования в качестве натуральной основы для изготовления медицинских и косметических изделий и средств.

Для решения поставленной задачи способ получения лиофилизированного гидролизата коллагена, основанный на использовании плавательного пузыря рыбы из семейства осетровых и сиговых, включающий промывание, механическую очистку плавательных пузырей, щелочно-солевой гидролиз, очистку раствора от низкомолекулярных соединений, фильтрацию и лиофильную сушку, характеризуется тем, что щелочно-солевой гидролиз проводят в 10% растворе едкого натра с добавлением 5% раствора натрия сульфата при гидромодуле 1:4 в течение 5±0,5 часов, очистку раствора от низкомолекулярных соединений проводят в диализных мешках с диаметром пор 12-14 кДа в течение 24±0,5 часов, дополнительно фильтруют через фильтр с диаметром пор 0,2 мкм для выделения наноразмерной фракции, после чего, проводят замораживание при температуре не более минус 40°С в течение 4±0,2 часов и сублимационную сушку в течение 24±0,5 часов под вакуумом при температуре не более минус 55°С. Кроме того, при использовании плавательного пузыря рыбы из семейства осетровых по окончании щелочно-солевой обработки и до диализной очистки дополнительно проводят нейтрализацию сырья в растворе 1 М уксусной кислоты при гидромодуле 1:4 в течение 24±0,5 часов.

Сопоставительный анализ признаков заявленного решения с признаками аналогов свидетельствует о соответствии заявленного решения критерию «новизна».

Признаки отличительной части формулы изобретения обеспечивают решение технической задачи, а именно, получение экологически чистого лиофилизированного гидролизата коллагена со средним диаметром частиц от 69,01 до 86,25 нм, что расширяет области применения продукта в медицине, косметологии, биотехнологиях и в производстве полимерных материалов.

Технический результат достигается за счет применения щелочно-солевого гидролиза, очистки от низкомолекулярных соединений в диализных мешках с последующей сублимационной сушкой и фильтрацией для выделения нанофракции гидролизата коллагена.

Таким образом, в ближайшем аналоге используют более концентрированные растворы щелочи, гидролиз протекает более длительный период (24 час), при этом отсутствует стадия диализа водной дисперсии, сублимационная сушка проводится при более высокой температуре в течение продолжительного времени (до 36 час), отсутствует стадия фильтрации полученного материала.

При щелочной обработке происходит деполимеризация белковых молекул, разрушаются межмолекулярные поперечные связи. Высокомолекулярный коллаген и продукты его расщепления, легко растворяются в воде при нагревании. Защитное действие солей при щелочной обработке объясняется их обезвоживающим эффектом, способствующим уплотнению структурных элементов и повышению общей стабильности белка.

Использование сублимационной (лиофильной) сушки позволяет максимально сохранить органолептические, физико-химические и функционально-технологические показатели продукции при обеспечении ее пролонгированного хранения. Сублимационная сушка протекает в широком диапазоне температуры и глубоком вакууме, что в совокупности позволяет сохранять высокие потребительские свойства полученных материалов, биологическую ценность и структуру материала в течение продолжительного времени хранения (до 5 лет). Кроме того, проведение лиофильной сушки при более низкой температуре, чем в ближайших аналогах, позволяет существенно сократить продолжительность процесса.

Наличие в составе гидролизата коллагена наночастиц обеспечивает высокую эффективность применения продукта, поскольку обеспечивает лучшую проницаемость гидролизата через поры эпидермиса или клеточные мембраны (см. Каплун, А. П. Рациональный дизайн нано- и микроразмерных лекарственных форм биологически активных субстанций / А. П. Каплун, Д. А. Безруков, В. И. Швец // Биотехнология. - 2010. - № 6. - С. 9-18. - EDN HEEFQN).

Заявленное техническое решение иллюстрируется чертежом, где на фигуре показан ИК-спектр гидролизата коллагена, полученного экспериментальным путем.

В заявленном техническом решении используют коллаген, полученный из плавательного пузыря осетровых (ACIPENSERIDAE) и сиговых (COROGENIDAE) видов рыб, преимущественно, обитающих в водоемах северных регионов, известных экологической чистотой. Кроме того, преимуществом северных видов рыб является отсутствие болезней, характерных для сырья, полученного из КРС, биосовместимость полученного гидролизата коллагена с организмом человека. Уникальность рыб определяется богатым аминокислотным составом соединительной ткани, причем, плавательный пузырь почти полностью состоит из коллагена, что делает его перспективным сырьем для получения материалов косметического, медицинского назначения.

Аминокислотный состав рыбного коллагена, выделенного заявленным способом из северных видов рыб, характеризуется высоким содержанием аспаргиновой аминокислоты, глицина, аланина, пролина и др. Аминокислотный состав рыбных коллагенов представлен в таблице 1.

Способ получения лиофилизированного гидролизата коллагена, содержащего наноразмерные частицы из плавательного пузыря рыб, осуществляется следующим образом.

Плавательные пузыри рыб (осетровые, сиговые) очищают, удаляют наружные прирези мышечной ткани, тщательно промывают водопроводной водой, взвешивают. Проводят гидролиз в присутствии 10% раствора едкого натра с добавлением 5% раствора натрия сульфата при постоянном перемешивании на механической мешалке в течение 5±0,5 час с жидкостным коэффициентом 4. Для очистки раствора от низкомолекулярных соединений проводят диализ в течение суток (24±0,5 часов) при постоянном перемешивании на механической мешалке, для этого коллагенсодержащую суспензию наливают в диализный мешок с размером пор 12-14 кДа и переносят в стакан с деионизированной водой. Для выделения наноразмерной фракции дополнительно фильтруют через фильтр с диаметром пор 0,2 мкм, что позволяет отделить грубодисперсную фракцию. Полученную суспензию замораживают при температуре не более минус 40°С в течение 4±0,2 час и сушат в лиофильной камере (например, типа FD-1200 FLOM) в течение 24±0,5 час при температуре не более минус 55°С.

Оценку полученного по заявленному способу гидролизата коллагена проводили по следующим критериям: размер частиц, химический состав, микробиологические показатели (см. фигуру, таблицы 2-4).

Проведенные исследования свидетельствуют о том, средний размер частиц водной дисперсии гидролизата коллагена омуля, определенный на наносайзере Malvern Zetasizer Nano ZS, составляет 27,29 мкм, после фильтрования через фильтр с диаметром пор 0,2 мкм средний размер частиц составляет 69,01 нм. Средний размер частиц водной дисперсии гидролизата коллагена осетра составляет 80,66 мкм, после фильтрации средний размер частиц составляет 86,25 нм (см. таблицу 2).

На ИК-спектрах гидролизата коллагена фиксируются полосы поглощения, обусловленные валентными колебаниями NH-связи (Амид А), плоскостными деформационными колебаниями NH-связи (Амид II); а также С-N (деф.), NH-связи (Амид III). Данные полосы поглощения характеризуют колебание пептидной связи белка и можно предположить, что полученный продукт по заявленному способу является коллагеном, сохранившим свою нативную, трехспиральную структуру (см. таблицу 3, фигуру).

Готовый порошок коллагена безопасен, что подтверждают результаты микробиологического анализа (см. таблицу 4), и может быть использован как материал для разработки косметических средств: крема, сывороток, лосьонов, масок, патчей, БАД и средства терапевтического назначения: подложки для культивирования фибробластов для раневых поверхностей, трансплантатов для восстановления поврежденных участков кожи человека, компонент для костных имплантов, а также может выступать в качестве наномодификатора при создании полимерных материалов. Как показали проведенные исследования, содержание тяжелых металлов (Pb, Cd, Hg, As, Zn, Cu, Fe, Mn) в плавательных пузырях существенно ниже ПДК.

Примеры реализации заявленного изобретения.

Пример 1. Плавательные пузыри сиговых видов рыб очищали, удаляли наружные прирези мышечной ткани, тщательно промывали водопроводной водой, взвешивали. Проводили гидролиз в присутствии 10% раствора едкого натра с добавлением 5% раствора натрия сульфата при постоянном перемешивании на механической мешалке в течение 5±0,5 час с жидкостным коэффициентом 4. Для очистки раствора от низкомолекулярных соединений проводили диализ в течение суток (24±0,5 часов) при постоянном перемешивании на механической мешалке, для этого коллагенсодержащую суспензию наливали в диализный мешок с размером пор 12-14 кДа и переносили в стакан с деионизированной водой. Для выделения наноразмерной фракции дополнительно фильтровали через фильтр с диаметром пор 0,2 мкм, что позволило отделить грубодисперсную фракцию, которая может быть использована впоследствии для других целей. Полученную суспензию замораживали при температуре не более минус 40°С в течение 4±0,2 час и сушили в лиофильной камере в течение 24±0,5 час при температуре не более минус 55°С.

Пример 2. Плавательные пузыри осетровых видов рыб очищали, удаляли наружные прирези мышечной ткани, тщательно промывали водопроводной водой, взвешивали. Очищенные пузыри измельчали и замачивали в дистиллированной воде в течение часа. Затем воду сливали и проводили гидролиз в присутствии 10% раствора едкого натра с добавлением 5% раствора натрия сульфата при постоянном перемешивании на механической мешалке в течение 5±0,5 час с жидкостным коэффициентом 4. По окончании щелочно-солевой обработки раствор сливали, оставшуюся массу выдерживали в дистиллированной воде в течение 1±0,2 часа. Далее воду сливали и выдерживали в растворе 1 М уксусной кислоты с жидкостным коэффициентом 1:4 в течение 24±0,5 часов и подвергали диализу. Для этого коллагенсодержащую суспензию наливали в диализный мешок с размером пор 12-14 кДа и переносили в стакан с деионизированной водой, при этом воду меняли 2-3 раза в день. Для выделения наноразмерной фракции дополнительно фильтровали через фильтр с диаметром пор 0,2 мкм, что позволило отделить грубодисперсную фракцию. Полученную суспензию замораживали при температуре не более минус 40°С в течение 4±0,2 часа и сушили в лиофильной камере в течение 24±0,5 часов при температуре не более минус 55°С.

Таким образом, заявленное изобретение позволяет получить экологически чистый лиофилизированный гидролизат коллагена со средним диаметром частиц от 69,01 до 86,25 нм, что расширяет область использования продукта в медицинской, косметической, пищевой и других отраслях промышленности.

Таблица 1

Аминокислотный состав коллагенов, полученных из разного сырья

Аминокислоты Содержание, % Гидролизат коллагена, полученный из плавательного пузыря сиговых видов рыб Коллаген гольевого спилка шкур КРС [1] Коллаген из свиных ножек [2] Глицин 23,23 31,85 40,39 Аланин 15,25 10,35 10,26 Глутаминовая кислота 14,30 8,09 38,33 Аспарагиновая кислота 12,06 5,62 - Пролин 10,17 9,89 4,84 Лизин 3,97 3,52 - Лейцин 3,78 3,99 - Серин 3,74 - 0,85 Аргинин 3,33 - - Фенилаланин 2,59 1,75 - Тирозин 2,46 - - Метионин 2,21 - - Треонин 1,14 2,06 1,51 Триптофан 1,07 - - Валин 0,46 - 0,86 Цистеин 0,26 - -

Примечание:

1. Устинова A.B., Дыдыкин A.C., Попова А.П., Сурнин Е.В. Комплексные биологически активные добавки для профилактики остеопороза в составе мясных продуктов // Технологии функциональные продукты. - 2011. - №. 5. - С. 26-28.

2. Телишевская Л.Я. Белковые гидролизаты. М.: Аграрная наука, 2000. 290 с.

Таблица 2

Размер частиц гидролизата коллагена

Гидролизат коллагена Средний размер частиц до фильтрования, мкм Средний размер частиц после фильтрования, нм Полученный из плавательного пузыря омуля 27,29 69,01 Полученный из плавательного пузыря осетра 80,66 86,25

Таблица 3

Данные ИК-спектроскопии гидролизата коллагена

Амид Частота, см^-1 Вид связи Амид А 3285 Валентные колебания NH связи 2921;2850 Валентные колебания СН₃ связи II 1560 Деформационные колебания NH, CN связи 1444 Деформационные колебания СН₃ связи III 1317 CN-растяжение, NH-поворот 1108 Валентные колебания -С-С- связи

Таблица 4

Результаты микробиологического исследования гидролизата коллаген

№ Исследуемые показатели Допустимые уровни Результат 1 Количество мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов (КМАФАиМ), КОЕ/г, не более 5 х 10⁵ 0 2 Бактерии группы кишечных палочек (колиформы), не допускается в массе продукта, (г) 0,01 Не обнаружено 3 E.Coli, не допукается в массе продукта, (г) 0,1 Не обнаружено 4 S. aureus, не допукается в массе продукта, (г) 1,0 Не обнаружено 5 Плесени, КОЕ/г, не более 10³ Не обнаружено 6 Дрожжи, КОЕ/г, не более 100 Не обнаружено

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способу получения лиофилизированного гидролизата коллагена, основанному на использовании плавательного пузыря рыбы из семейства осетровых или сиговых. Способ получения лиофилизированного гидролизата коллагена, основанный на использовании плавательного пузыря рыбы из семейства осетровых и сиговых, включающий промывание, механическую очистку плавательных пузырей, щелочно-солевой гидролиз, очистку раствора от низкомолекулярных соединений, фильтрацию и лиофильную сушку, характеризуется тем, что щелочно-солевой гидролиз проводят в 10% растворе едкого натра с добавлением 5% раствора натрия сульфата при гидромодуле 1:4 в течение 5±0,5 ч, очистку раствора от низкомолекулярных соединений проводят в диализных мешках с диаметром пор 12-14 кДа в течение 24±0,5 ч, дополнительно фильтруют через фильтр с диаметром пор 0,2 мкм для выделения наноразмерной фракции, после чего проводят замораживание при температуре не более -40°С в течение 4±0,2 ч и сублимационную сушку в течение 24±0,5 ч под вакуумом при температуре не более -55°С. Указанное изобретение позволяет получить наноразмерный лиофилизированный гидролизат коллагена, пригодный для использования в качестве натуральной основы для изготовления медицинских и косметических изделий и средств. 1 з.п. ф-лы, 1 ил., 4 табл., 2 пр.

1. Способ получения лиофилизированного гидролизата коллагена, основанный на использовании плавательного пузыря рыбы из семейства осетровых или сиговых, включающий промывание, механическую очистку плавательных пузырей, щелочно-солевой гидролиз, очистку раствора от низкомолекулярных соединений, фильтрацию и лиофильную сушку, характеризующийся тем, что щелочно-солевой гидролиз проводят в 10% растворе едкого натра с добавлением 5% раствора натрия сульфата при гидромодуле 1:4 в течение 5±0,5 ч, очистку раствора от низкомолекулярных соединений проводят в диализных мешках с диаметром пор 12-14 кДа в течение 24±0,5 ч, дополнительно фильтруют через фильтр с диаметром пор 0,2 мкм для выделения наноразмерной фракции, после чего проводят замораживание в течение 4±0,2 ч при температуре не более -40°C и сублимационную сушку под вакуумом в течение 24±0,5 ч при температуре не более -55°C.

2. Способ получения лиофилизированного гидролизата коллагена по п. 1, отличающийся тем, что при использовании плавательного пузыря рыбы из семейства осетровых по окончании щелочно-солевой обработки и до диализной очистки дополнительно проводят нейтрализацию сырья в растворе 1 М уксусной кислоты при гидромодуле 1:4 в течение 24±0,5 ч.