Лантаноидный краситель для контрастирования биологических препаратов при сканирующей электронной микроскопии в обратно-рассеянных электронах и способ его получения и применения Российский патент 2025 года по МПК G01N21/84 G01N23/2251 C01F17/00 C12P9/00 

Настоящее изобретение относится к медицинской биотехнологии, медицинским и биологическим реактивам, а именно к реактивам для контрастирования биологических препаратов с целью визуализации ультраструктурного строения исследуемого препарата тканей и суспензий клеток методами электронной микроскопии в обратно-рассеянных электронах.

Подавляющее большинство биологических препаратов не обладают собственным электронным контрастом, так как состоят из атомов с низкой атомной массой и поэтому слабо отклоняют электроны электронного пучка микроскопа, формирующего изображение. Принцип увеличения контрастности изображения структуры таких препаратов в пучках электронов основан на предварительной импрегнации (пропитывании) тяжелыми металлами. Важным условием получения качественного изображения является оптимальный подбор контрастирующих элементов, которые должны избирательно реагировать с веществами, входящими в структуру клеточных органелл, тем самым создавая достаточный для визуализации и при этом селективный электронный контраст. Оптимальный реактив для контрастирования должен взаимодействовать со всеми биополимерами (полипептидами, полисахаридами и полинуклеотидами), а также с веществами липидной природы. В настоящее время ни один индивидуальный контрастирующий агент (контрастер) не обладает набором таких свойств, поэтому для контрастирования биологических структур используют различные варианты их комбинаций. Как правило, для увеличения контрастности в электронной микроскопии применяют соединения осмия, урана, свинца и вольфрама, в настоящее время также широко распространено использование электронных красителей на основе солей лантаноидов. Наиболее часто используемой методикой контрастирования биологических структур при электронной микроскопии является последовательное окрашивание тканей или клеточных суспензий уранилацетатом и цитратом свинца после постфиксации образцов тетраоксидом осмия [Dykstra J., Reuss L.E. Biological Electron Microscopy: Theory, Techniques, and Troubleshooting. Chapter 1. Specimen Preparation for Electron Microscopy. P. 1-73. (Kluwer Academic/Plenum Publishers, 2003].

Контрастирование биологических образцов для электронной микроскопии может выполняться посредством окрашивания предварительно подготовленных на ультрамикротоме ультратонких срезов на сетках-подложках либо путем окрашивания цельных сегментов тканей (en-bloc) после их постфиксации тетраоксидом осмия. Оба варианта выполняются с использованием одних и тех же реактивов, однако окрашивание по принципу en-bloc требует большей продолжительности для равномерного пропитывания всех слоев. Иногда контрастирование уранилацетатом en-bloc проводят на этапе обезвоживания образцов в спиртах возрастающей концентрации. Именно контрастирование образцов en-bloc является оптимальным вариантом при исследованиях биологических тканей методом сканирующей электронной микроскопии в обратно-рассеянных электронах (EM-BSEM).

Исследование цельных сегментов тканей (en-bloc) методом сканирующей электронной микроскопии в обратно-рассеянных электронах (EM-BSEM), обладает рядом преимуществ относительно обычной трансмиссионной (просвечивающей) электронной микроскопии (ПЭМ). Отсутствие необходимости ультрамикротомии эпоксидных блоков (вследствие анализа в формате en-bloc) позволяет просматривать образцы с твердыми металлическими или минеральными включениями и изучать большую площадь образцов (1 см² и выше) с высоким качеством изображения и на большом увеличении [Mukhamadiyarov R.A., Bogdanov L.A., Glushkova T.V., Shishkova D.K., Kostyunin A.E., Koshelev V.A., Shabaev A.R., Frolov A.V., Stasev A.N., Lyapin A.A., Kutikhin A.G. EMbedding and Backscattered Scanning Electron Microscopy: A Detailed Protocol for the Whole-Specimen, High-Resolution Analysis of Cardiovascular Tissues. Front Cardiovasc Med. 2021; 8:739549. doi: 10.3389/fcvm.2021.739549]. Окрашивание образцов по методике en-bloc для EM-BSEM отличается увеличенным временем проводки на каждом этапе, а также заменой процедуры резки шлифовкой и полировкой поверхности эпоксидного блока. Так как ПЭМ и EM-BSEM основаны на одном и том же физическом принципе - упругом рассеянии электронов, при котором тяжелые металлы имеют большее сечение, получаемое при EM-BSEM изображение аналогично ПЭМ. Методика пробоподготовки биологических образцов с контрастированием водным раствором уранилацетата по принципу en-bloc для EM-BSEM обычно включает в себя следующие этапы:

1. Фиксация биологических тканей в альдегидных фиксаторах (как правило, в 2,5% растворе глутарового альдегида или 4% растворе параформальдегида, приготовленном на фосфатном буфере);

2. Отмывка биологических тканей от альдегидного фиксатора в фосфатном буфере;

3. Фиксация биологических тканей в 1% растворе тетраоксида осмия, приготовленном на фосфатном буфере;

4. Отмывка биологических тканей от тетраоксида осмия в фосфатном буфере;

5. Контрастирование биологических тканей в 2% водном растворе уранилацетата;

6. Обезвоживание биологических тканей в серии растворов этилового спирта возрастающей концентрации (от 60% до 95%);

7. Обезвоживание биологических тканей в абсолютном этиловом спирте;

8. Пропитывание биологических тканей ацетоном или окисью пропилена;

9. Пропитывание биологических тканей смесью эпоксидной смолы и ацетона или окиси пропилена;

10. Пропитывание биологических тканей чистой эпоксидной смолой;

11. Заключение биологических тканей в эпоксидную смолу путем ее полимеризации при нагревании;

12. Шлифовка и полировка заключенных в эпоксидную смолу биологических тканей;

13. Дополнительное контрастирование полированной поверхности заключенных в эпоксидную смолу биологических тканей цитратом свинца.

Несмотря на высокое качество контрастирования и широкое распространение окрашивания биологических образцов уранилацетатом и цитратом свинца, замена уранилацетата в качестве контрастирующего агента является актуальной задачей вследствие его радиоактивности и высокой токсичности, значительно затрудняющими его утилизацию и сопряжено с юридическими сложностями и бюрократическими издержками при его использовании. Современные исследования показали возможность эффективной замены уранилацетата на гематоксилин [Sasaki Н., Arai Н., Kikuchi Е., Saito Н., Seki K., Matsui Т. Novel electron microscopic staining method using traditional dye, hematoxylin. Sci Rep. 2022; 12 (1): 7756. doi: 10.1038/s41598-022-11523-y], экстракт чая оолонг [Sato S., Sasaki Y., Adachi A., Dai W., Liu X.L., Namimatsu S. Use of oolong tea extract (OTE) for elastin staining and enhancement in ultrathin sections. Med Electron Microsc. 2003;36(3):179-82. doi: 10.1007/s00795-003-0216-1] и краситель платиновый голубой [Inaga S, Katsumoto T, Tanaka K, Kameie T, Nakane H, Naguro T. Platinum blue as an alternative to uranyl acetate for staining in transmission electron microscopy. Arch Histol Cytol. 2007; 70 (l): 43-9. doi: 10.1679/aohc.70.43]. Однако наибольший интерес представляют красители на основе солей металлов, относящихся к группе лантаноидов, которые имеют высокую атомную массу и, вероятно, сходные с уранилацетатом сайты связывания с биомолекулами, что делает их подходящими контрастирующими агентами при пробоподготовке биологических тканей и клеточных суспензий для ПЭМ.

Возможность использования лантаноидов в качестве электронноплотных меток для клеточных мембран и органелл была показана в обзоре [Shaklai М., Tavassoli М. Lanthanum as an electron microscopic stain. J Histochem Cytochem. 1982; 30 (12): 1325-30. doi: 10.1177/30.12.6185564]. Дальнейшие исследования пригодности применения нитрата лантана для электронной микроскопии сосудов показали, что он, обладая выраженными контрастирующими свойствами по отношению к субклеточным структурам, с достаточно высокой избирательностью связывается с материалом гликокаликса артериального эндотелия, что позволяет выявлять его трехмерную структуру [Chevalier L., Selim J., Castro С., Cuvilly F., Baste J.M., Richard V., Pareige P., Bellien J. Combined Electron Microscopy Approaches for Arterial Glycocalyx Visualization. Front Cardiovasc Med. 2022; 9: 840689. doi: 10.3389/fcvm.2022.840689; Chevalier L., Selim J., Genty D., Baste J.M., Piton N., Boukhalfa I., Hamzaoui M., Pareige P., Richard V. Electron microscopy approach for the visualization of the epithelial and endothelial glycocalyx. Morphologie. 2017; 101 (333): 55-63. doi: 10.1016/j.morpho.2017.04.001].

Также известен способ контрастирования биологических образцов солями гадолиния и самария по отдельности и в сочетании друг с другом [Hosogi N., Nishioka Н., Nakakoshi М. Evaluation of lanthanide salts as alternative stains to uranyl acetate. Microscopy (Oxf). 2015; 64 (6): 429-35. doi: 10.1093/jmicro/dfv054]. Образцы, предварительно фиксированные 2,5% глутаровым альдегидом в течение 2 часов, отмывали в буферном растворе какодилата натрия (0,1 моль/л, рН 7,2) и постфиксировали в 1% растворе тетраоксида осмия на какодилатном буфере в течение 1 часа. После обезвоживания в серии этанола возрастающей концентрации образцы заключали в эпоксидную смолу марки Epon 812. Ультратонкие срезы окрашивали в 2,5% водном растворе триацетата самария и 2,5% водном растворе триацетата гадолиния в течение 20 минут при комнатной температуре. После промывки дистиллированной водой и высушивания образцы докрашивали цитратом свинца по Рейнольдсу. Без окрашивания цитратом свинца контрастность изображения была недостаточной для визуальной оценки клеточной ультраструктуры. После дополнительного окрашивания цитратом свинца образцы обладали большим электронным контрастом, и полученное изображение было сопоставимо с полученным при контрастировании уранилацетатом, однако все же демонстрировало более низкий контраст.

В статье [Hosogi N., Nishioka Н., Nakakoshi М. Evaluation of lanthanide salts as alternative stains to uranyl acetate. Microscopy (Oxf). 2015; 64 (6): 429-35. doi: 10.1093/jmicro/dfv054] были представлены данные, по сравнительной оценке, результатов контрастирования ультратонких срезов биологических образцов в 2% водном растворе триацетатов иттербия, лютеция, самария и гадолиния. Качество окрашивания мембран и органелл клеток листьев шпината с использованием указанных реагентов было сравнимо с таковым при окрашивании уранилацетатом. Значения коэффициента контрастности напрямую коррелировали со временем окрашивания, а наиболее эффективным контрастирующим агентом был признан триацетат гадолиния. В кислых условиях рН, близких к рН раствора уранилацетата, способность к контрастированию у каждого реагента была немного лучше в сравнении с нейтральным рН.

В качестве прототипа был рассмотрен контрастирующий агент с коммерческим названием UranyLess ЕМ Stain (Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA). Смесь представляет собой водный раствор солей нескольких (более одного) лантаноидов. Полный состав смеси производителем не раскрывается. Имеются данные, подтверждающие эффективность контрастирования биологических тканей этим красителем [Lacavalla, М.А., Cisterna, В. (2023). Uranyl-Free Staining as a Suitable Contrasting Technique for Nuclear Structures at Transmission Electron Microscopy. In: Pellicciari, C, Biggiogera, M., Malatesta, M. (eds) Histochemistry of Single Molecules. Methods in Molecular Biology, vol. 2566. Humana, New York, NY. https://doi.org/10.1007/978-1-0716-2675-7_18].

В свете современных требований к качеству получаемых электронно-микроскопических изображений контрастирующий агент для замены уранилацетата должен обладать следующими свойствами:

1. Высокая атомная масса;

2. Отсутствие радиоактивности;

3. Отсутствие или низкий уровень токсичности;

4. Способность проникать в толщу образца (к пропитыванию тканей);

5. Избирательное взаимодействие с компонентами тканей, входящих в состав клеток (селективное действие);

6. Несвязанный краситель должен полностью удаляться при отмывке образца для предотвращения фонового окрашивания и сохранения контрастности;

7. Прочность селективного связывания должна быть достаточной для сохранения контрастности при последующих манипуляциях;

8. Высокая воспроизводимость результатов;

9. Полученное изображение должно быть аналогичным получаемому при окрашивании уранилацетатом.

С учетом перспективности использования солей лантаноидов в качестве контрастирующего агента для электронной микроскопии на первом этапе исследования были выполнены сравнительные исследования эффективности некоторых солей лантаноидов, в частности, триацетата самария Sm(CH₃COO)₃), триацетата гадолиния (Gd(CH₃COO)₃), триацетата эрбия (Er(СН₃СОО)₃), триацетата тулия (Tm(СН₃СОО)₃), триацетата иттербия (Yb(CH₃COO)₃) и триацетата лютеция (Lu(CH₃COO)₃). Для дополнительного повышения контраста полученного изображения за счет кратного увеличения связывания осмия простая постфиксация тетраоксидом осмия была заменена на ОТО-контрастирование. ОТО-контрастирование представляет собой трехэтапную процедуру, при которой на первом этапе выполняется постфиксация образцов 1% тетраоксидом осмия с добавлением ферроцианида калия, который за счет частичного восстановления тетраоксида осмия обеспечивает большую степень связывания осмия с биоматериалом, а второй этап подразумевает инкубацию образцов в тиокарбогидразиде, который связывается с тетраоксидом осмия [White D.L., Mazurkiewicz J.E., Barrnett R.J. A chemical mechanism for tissue staining by osmium tetroxide-ferrocyanide mixtures. J Histochem Cytochem. 1979; 27 (7): 1084-91. doi: 10.1177/27.7.89155; Kopriwa B.M. Block-staining tissues with potassium ferrocyanide-reduced osmium tetroxide and lead aspartate for electron microscopic radioautography. J Histochem Cytochem. 1984; 32 (5): 552-4. doi: 10.1177/32.5.6201530]. На третьем этапе выполняется дополнительная обработка образцов 2% раствором тетраоксида осмия, во время которой происходит его взаимодействие с предварительно связавшимся с осмием тиокарбогидразидом (таким образом, тиокарбогидразид представляет собой «мостик» между молекулами осмия из первой и второй инкубации). Для адекватного сравнения эффективности контрастирования образцов 2% раствором уранилацетата, патентованным лантаноидным контрастирующим агентом UranyLess и 2% растворами триацетатных солей лантаноидов процедуру ОТО-контрастирования выполняли для всех экспериментальных и контрольных групп. В остальных аспектах экспериментальные группы отличались только контрастирующими агентами.

В качестве материала использовали аорту лабораторных крыс линии Wistar. Извлеченную часть брюшной аорты поперечно разрезали на продольные сегменты длиной 3-5 мм и помещали в стеклянные емкости с 4% забуференным раствором параформальдегида на 2 часа, после чего приступали к электронно-микроскопической проводке образцов (Таблица 1). Рабочие растворы хранили и использовали в стеклянных флаконах. Для электронно-микроскопической проводки использовали стеклянные флаконы объемом 10 мл, объем раствора при проводке составлял от 3 до 4 мл.

После шлифовки и полировки до необходимой глубины эпоксидного блока образцы контрастировали цитратом свинца по Рейнольдсу в течение 7 минут путем нанесения раствора на поверхность шлифованного образца с последующей его отмывкой бидистиллированной водой. После высушивания проводили напыление углерода на полированную поверхность эпоксидных блоков (толщина углеродного покрытия от 10 до 15 нм) с помощью вакуумного напылительного поста (ЕМ АСЕ200, Leica Microsystems). Визуализацию образцов проводили при помощи сканирующей электронной микроскопии в обратно-рассеянных электронах на электронном микроскопе Hitachi S-3400N (Hitachi) в режиме BSECOMP при ускоряющем напряжении 10 или 15 кВ.

В первом эксперимента была оценена принципиальная возможность контрастирования биологических препаратов лантаноидами для исследования методом EM-BSEM (на примере триацетата иттербия). Выбор именно этого элемента для пилотного эксперимента был обусловлен тем, что в ряду лантаноидов он обладает большим атомным номером и высокой атомной массой (что увеличивает обратное рассеивание электронов), а также полученными другими авторами положительными результатами при окрашивании триацетатом иттербия ультратонких срезов для ПЭМ [Moscardini A., Di Pietro S., Signore G., Parlanti P., Santi M., Gemmi M., Cappello V. Uranium-free X solution: a new generation contrast agent for biological samples ultrastructure. Sci Rep. 2020; 10 (1): 11540. doi: 10.1038/s41598-020-68405-4; Hosogi N., Nishioka H., Nakakoshi M. Evaluation of lanthanide salts as alternative stains to uranyl acetate. Microscopy (Oxf). 2015; 64 (6): 429-35. doi: 10.1093/jmicro/dfv054]. В качестве контрольных групп в этом эксперименте были использованы аналогичные сегменты брюшной аорты крысы, окрашенные 2% раствором уранилацетата или патентованным лантаноидным контрастирующим агентом UranyLess.

Представленные на фиг. 1 данные показали высокое качество контрастирования триацетатом иттербия, сопоставимое с окрашиванием 2% раствором уранилацетата и патентованным лантаноидным контрастирующим агентом UranyLess. После контрастирования триацетатом иттербия четко выявлялась субклеточная структура сосудистых гладкомышечных клеток (СГМК) в слое медии аорты крыс, а именно клеточные ядра, ядерная оболочка, эу- и гетерохроматин. Следует отметить, что наблюдаемая деформация ядер обусловлена сжатием СГМК вследствие спазма стенки сосуда из-за отсутствия гидростатического и гидродинамического давления в просвете аорты. Цитоплазма СГМК имела светлый оттенок с хорошо различимыми митохондриями и другими мембранными структурами, внутри цитоплазмы которых просматривались сократительные волокна. В субэндотелиальном пространстве была хорошо различима базальная мембрана, сформированная из коллагена IV типа и имеющая волокнистую структуру. В эндотелиальных клетках были хорошо различимы митохондрии с выраженными кристами, мембраны эндоплазматической сети и другие мембранные органеллы, а также крупные вакуоли. В адвентиции стенки аорты были явно различимы параллельно расположенные волокна коллагена I типа, входящие в состав соединительнотканных пучков.

На следующей стадии были выполнены сравнительные исследования эффективности некоторых лантаноидов в качестве заменителя 2% раствора уранилацетата и патентованного лантаноидного контрастирующего агента UranyLess. В этом эксперименте были использованы 2% водные растворы триацетата самария (Sm(СН₃СОО)₃), триацетата гадолиния (Cd(СН₃СОО)₃), триацетата эрбия (Er(СН₃СОО)₃), триацетата тулия (Tl(СН₃СОО)₃), триацетата иттербия (Yb(CH₃COO)₃) и триацетата лютеция (Lu(CH₃COO)₃). Соли лантаноидов использовали в виде монорастворов. Критериями оценки эффективности окрашивания на этом этапе служили: 1) наличие достаточного контраста получаемого изображения ультраструктуры изучаемых биологических образцов; 2) достаточная равномерность окрашивания, позволяющая анализировать внутреннюю структуру как наиболее затемненных, так и наиболее засветленных окрашенных препаратов; 3) отсутствие поверхностного загрязнения образца или иных артефактов пробоподготовки.

Во всех представленных вариантах окрашивания наблюдали хорошую визуализацию субклеточных структур клеток и внеклеточного матрикса аорты крысы, но в особенностях окрашивания наблюдались некоторые различия. В СГМК все рассмотренные лантаноиды позволяли высококачественно выявлять клеточную ультраструктуру за счет окрашивания ядер, внутриклеточных и плазматических мембран, митохондрий и эндоплазматической сети (фиг. 2). Соли лютеция, иттербия и гадолиния позволяли получить привычный тип окрашивания, аналогичный получаемому при использовании уранилацетата. При окрашивании триацетатом тулия и триацетатом эрбия в клетках отмечали чередование затемненных и засветленных слоев в цитоплазме, нетипичное для контрастирования уранилацетатом. Применение триацетата самария приводило к избыточному контрасту ядер и нетипичному окрашиванию цитоплазмы. В отношении окрашивания коллагеновых волокон в адвентиции аорты крысы все лантаноиды демонстрировали высокое качество контрастирования, при этом волокна коллагена I типа визуализировались более детально, чем при использовании уранилацетата (фиг. 3). Результаты этой серии экспериментов показали, что использованные лантаноиды хорошо проникают в толщу биологической ткани, активно взаимодействуют с внутриклеточным материалом и эффективно контрастируют клетки аорты крысы, что позволяет исследовать их ультраструктуру методом EM-BSEM.

В представленном ряду лантаноидных красителей согласно приведенным выше критериям (среди которых преимущество отдавали сходству полученных результатов с окрашиванием уранилацетатом) наибольшую эффективность продемонстрировали соли гадолиния, иттербия и лютеция. Именно эти лантаноиды были выбраны для дальнейших исследований с целью создания наиболее эффективных контрастирующих агентов для биологических препаратов при использовании метода EM-BSEM. В следующей серии экспериментов была изучена эффективность выбранных солей как в виде индивидуальных растворов, так и их композиций.

С целью выбора оптимального состава красителя для окрашивания образцов биологических препаратов для ультраструктурного анализа методом EM-BSEM были использованы следующие водные растворы:

- 2% триацетат гадолиния,

- 2% триацетат иттербия,

- 2% триацетат лютеция,

- 1% триацетат гадолиния + 1% триацетат лютеция,

- 2% триацетат гадолиния + 2% триацетат лютеция,

- 1% триацетат гадолиния + 1% триацетат иттербия,

- 2% триацетат гадолиния + 2% триацетат иттербия,

- 1% триацетат лютеция + 1% триацетат иттербия,

- 2% триацетат лютеция + 2% триацетат иттербия,

- 1% триацетат гадолиния + 1% триацетат лютеция + 1% триацетат иттербия,

- 2% триацетат гадолиния + 2% триацетат лютеция + 2% триацетат иттербия,

- 2% уранилацетат,

- патентованный лантаноидный контрастирующий агент UranyLess.

Варианты окрашивания 2% водным раствором уранилацетата и патентованным лантаноидным контрастирующим агентом UranyLess использовали в качестве общепринятого стандарта контрастирования биологических тканей для сравнения с образцами, окрашенными лантаноидами.

При визуальной оценке все представленные варианты контрастирующих агентов продемонстрировали способность окрашивать биологические образцы и позволяли выявлять их ультраструктурную организацию (фиг. 4-6). Однако в их эффективности имелись заметные различия. В отношении контрастирования гладкомышечных клеток (фиг. 4) наилучшие результаты среди монорастворов демонстрировали 2% растворы триацетата лютеция и триацетата иттербия. При контрастировании триацетатом гадолиния наблюдали перекрашивание цитоплазмы, что затрудняло визуализацию клеточных органелл. Среди двухкомпонентных растворов преимуществом обладало сочетание 2% растворов триацетата лютеция и триацетата иттербия, а также сочетание 2% растворов триацетата гадолиния и триацетата иттербия.

При контрастировании волокон коллагена I типа в адвентиции аорты крыс (фиг. 5) наилучшие результаты показали 2% раствор триацетата лютеция, сочетание 1% растворов триацетата гадолиния и триацетата иттербия, а также сочетание 2% растворов триацетата гадолиния и триацетата лютеция. Визуально контраст, полученный с использованием этих красителей, даже превышал качество при окрашивании уранилацетатом, но не изменял привычную картину ультраструктурного строения и при этом обеспечивал лучшую идентификацию коллагеновых волокон.

В интиме аорты крысы окрашивание солями лантаноидов позволяло осуществлять визуализацию ультраструктуры эндотелиальных клеток (фиг. 6). В этих клетках качественно окрашивались ядра, хорошо визуализировались мембранные везикулярные структуры со светлым и темным содержимым, митохондрии, эндоплазматическая сеть, волокнистые структуры. Базальная мембрана имела высокий контраст, хорошо просматривалось ее волокнистое строение. Наилучший контраст при оценке качества контрастирования интимы наблюдали при использовании 2% раствора триацетата лютеция, 2% раствора триацетата иттербия, сочетания 1% растворов триацетата гадолиния и триацетата иттербия, сочетания 2% растворов триацетата гадолиния и триацетата лютеция, сочетания 2% растворов триацетата гадолиния и триацетата иттербия, а также сочетания 2% растворов триацетата гадолиния и триацетата лютеция.

С позиций интегральной оценки потребительских качеств представленных растворов в качестве красителей для создания электронного контраста биологических образцов была проведена полуколичественная оценка их свойств. Для этого были выбраны значимые, с точки зрения исследователя, критерии оценки всех рассмотренных на фиг. 4, фиг. 5 и фиг. 6 препаратов. Такими критериями служили: 1) прозрачность гиалоплазмы; 2) контраст органелл; 3) качество окрашивания соединительнотканных волокон; 4) качество окрашивания биологических мембран; 5) качество окрашивания базальной мембраны в интиме аорты. Выбор данных критериев был обусловлен тем, что именно эти ультраструктурные элементы имеют важное значение для получения качественного финального изображения и отличаются по своему химическому составу, что влияет на их взаимодействие с контрастирующим агентом, а их окрашивание позволяет получить объективное и полноценное представление об ультраструктуре клеток и тканей. Полученные результаты суммированы в таблице 2, в которой каждый показатель был полуколичественно оценен по пятибалльной шкале (таблица 2).

Для показателя прозрачность гиалоплазмы баллы контрастирующим агентам назначали по следующим критериям: 5 баллов - гиалоплазма имеет светло-серый цвет, и на ее фоне органеллы и гранулярные структуры имеют четкие контуры; 4 балла - гиалоплазма характеризуется заметным неравномерным окрашиванием и наличием серых глыбчатых структур в цитоплазме; 3 балла - наличие неравномерности окраски гиалоплазмы и присутствие обширных неокрашенных участков; 2 балла - перекрашенные участки гиалоплазмы с плохо различимыми внутренними структурами; 1 балл - окраска гиалоплазмы не позволяет различать структуру органелл из-за слишком темного или светлого окрашивания.

Для показателя контраст органелл баллы контрастирующим агентам назначали по следующим критериям: 5 баллов - четкие границы, равномерная внутренняя окраска в пределах органелл, видна внутренняя структура органелл, кристы митохондрий и раздельные мембраны эндоплазматической сети; 4 балла - наличие небольших участков мембран с размытыми границами; 3 балла - некоторые находящиеся рядом органеллы окрашиваются как единая структура; 2 балла - органеллы слабо различимы в составе цитоплазмы; 1 балл - органеллы неразличимы.

Для показателя окрашивание соединительной ткани баллы контрастирующим агентам назначали по следующим критериям: 5 баллов - четко видна структура отдельных волокон в составе коллагенового пучка, их взаимное расположение и различия в окраске; 4 балла - волокна в коллагеновых пучках хорошо различимы, но часть волокон имеют нечеткие контуры; 3 балла - волокна в коллагеновых пучках различимы, но имеют нечеткие контуры; 2 балла - просматриваются пучки соединительной ткани, но их структура неразличима; 1 балл - неразличимы как волокна, так и коллагеновые пучки соединительной ткани.

Для показателя окрашивание биологических мембран баллы контрастирующим агентам назначали по следующим критериям: 5 баллов - мембрана видна в виде четкой тонкой линии на всем ее протяжении; 4 балла - встречаются отельные короткие участки с размытой структурой; 3 балла - размытость отельных участков мембраны и нарушение ее непрерывности; 2 балла - размытость контуров мембран практически на всем ее протяжении; 1 балл - отсутствие окрашивания мембран.

Для показателя окрашивание базальной мембраны баллы контрастирующим агентам назначали по следующим критериям: 5 баллов - четко видна структура базальной мембраны, ее волокнистое строение; 4 балла - базальная мембрана видна четко, но образующие ее волокна размытые; 3 балла - волокна, образующие мембрану, различимы плохо; 2 балла - размытая структура базальной мембраны; 1 балл - структура базальной мембраны не просматривается.

По совокупности показателей после суммирования баллов наибольшее количество баллов получили следующие красители: 2% раствор триацетата лютеция - 23, 2% раствор триацетата иттербия - 22; патентованный лантаноидный контрастирующий агент UranyLess - 22, 2% раствор уранилацетата - 22, сочетание 2% растворов триацетата гадолиния и триацетата лютеция - 20, сочетание 2% растворов триацетата лютеция и триацетата иттербия - 20.

Полученные данные показали высокую эффективность лантаноидных красителей для контрастирования биологических препаратов при пробоподготовке к ультраструктурным исследованиям методом EM-BSEM. Среди изученных лантаноидов и их сочетаний наилучшие результаты показали 2% раствор триацетата лютеция и 2% раствора триацетата иттербия. При сочетании различных лантаноидов преимущество имели сочетание 2% растворов триацетата лютеция и триацетата гадолиния или 2% растворов триацетата лютеция и триацетата иттербия. При этом сочетание триацетата лютеция и триацетата гадолиния обладает преимуществом при окрашивании базальной мембраны и некоторых компонентов цитоплазмы.

Описание фигур

Фиг. 1. Сравнительная оценка эффективности триацетата иттербия (как типичного контрастирующего агента лантаноидной природы), патентованного лантаноидного контрастирующего агента UranyLess и 2% раствора уранилацетата.

Фиг. 2. Сравнительный анализ эффективности монорастворов лантаноидов для повышения контрастности субклеточных мембран сосудистых гладкомышечных клеток аорты крысы. Визуализация методом сканирующей электронной микроскопии в обратно-рассеянных электронах (EM-BSEM). Увеличение 10000 крат.

Фиг. 3. Сравнительный анализ эффективности монорастворов лантаноидов для повышения контрастности волокон коллагена I типа в адвентиции аорты крысы. Визуализация методом сканирующей электронной микроскопии в обратно-рассеянных электронах (EM-BSEM). Увеличение 10000 крат.

Фиг. 4. Сравнительный анализ эффективности монорастворов лантаноидов и их сочетаний для повышения контрастности субклеточных мембран сосудистых гладкомышечных клеток аорты крысы. Визуализация методом сканирующей электронной микроскопии в обратно-рассеянных электронах (EM-BSEM). Увеличение 10 ООО крат.

Фиг. 5. Сравнительный анализ эффективности монорастворов лантаноидов и их сочетаний для повышения контрастности волокон коллагена I типа в адвентиции аорты крысы. Визуализация методом сканирующей электронной микроскопии в обратно-рассеянных электронах (EM-BSEM). Увеличение 15000 крат.

Фиг. 6. Сравнительный анализ эффективности монорастворов лантаноидов и их сочетаний для повышения контрастности волокон коллагена IV типа в базальной мембране интимы аорты крысы. Визуализация методом сканирующей электронной микроскопии в обратно-рассеянных электронах (EM-BSEM). Увеличение 20000 крат.

Изобретение относится к медицинским и биологическим реактивам. Лантаноидный краситель для контрастирования биологических препаратов тканей и суспензий клеток при сканирующей электронной микроскопии в обратно-рассеянных электронах представляет собой сочетание 2% водных растворов триацетата лютеция и триацетата гадолиния. Лантаноидный краситель применяют для повышения электронного контраста биологических препаратов при их инкубировании в течение 16 часов и температуре 23°С. Предлагаемый лантаноидный краситель позволяет визуализировать клеточные мембраны, клеточные органеллы, ядра клеток и компоненты внеклеточного матрикса на высоком разрешении и увеличении до 50 тысяч крат. 2 н.п. ф-лы, 6 ил., 2 табл.

1. Лантаноидный краситель для контрастирования биологических препаратов тканей и суспензий клеток при сканирующей электронной микроскопии в обратно-рассеянных электронах, характеризующийся тем, что представляет собой сочетание 2% водных растворов триацетата лютеция и триацетата гадолиния.

2. Применение лантаноидного красителя по п. 1, представляющего собой сочетание 2% водных растворов триацетата лютеция и триацетата гадолиния, для повышения электронного контраста биологических препаратов при их инкубировании в течение 16 часов и температуре 23°С.