Способ получения биосовместимых и биоразлагаемых гидрогелей методом замены растворителя Российский патент 2025 года по МПК C08J3/75 C08J3/16 C08G63/08 C08G63/664 C08L67/04 A61L15/26 A61L27/52 

Область техники

Изобретение относится к области химии высокомолекулярных соединений и регенеративной медицины, направлено на разработку биосовместимых и биоразлагаемых полимерных гидрогелевых материалов, которые могут быть использованы для создания тканеинженерных конструкций, носителей лекарственных препаратов, а также раневых покрытий и других медицинских изделий.

Уровень техники

В настоящее время развитие регенеративной медицины требует все большего количества биосовместимых материалов для восстановления тканей и органов человека. Основная идея заключается в создании матрицы (каркаса), которая совместима с биологической средой организма и по своим физико-механическим свойствам схожа с нативными тканями. Включение в подобную матрицу клеток и факторов роста, которые стимулируют их пролиферацию и дифференциацию, будет способствовать регенерации нативной ткани. Для таких целей могут применяться губчатые, волокнистые или гидрогелевые материалы.

Гидрогели - это коллоидные системы, состоящие из воды более чем на 80-90%, дисперсная фаза которых представляет собой трехмерный каркас высокомолекулярного соединения природного или синтетического происхождения. Такие материалы потенциально обладают отличной биосовместимостью благодаря высокому содержанию воды, а также мягкой и эластичной структуре. В качестве полимерной основы гидрогеля можно использовать различные высокомолекулярные соединения, такие как полиакриламид, поливиниловый спирт, целлюлоза, коллаген, хитозан, блок-сополимеры этиленгликоля с гидрофобными полимерами, альгиновую кислоту, кремнийорганические полимеры и т.д.

Гидрогели могут быть физически или химически сшитыми, оба варианта имеют как преимущества, так и недостатки. В химически сшитых гидрогелях узлы сетки связаны ковалентными связями, что делает материалы более прочными, однако такой вид сшивки предполагает применение сшивающих агентов, катализаторов или воздействие УФ. Все это делает методику получения довольно сложной, а также ставит вопрос о биосовместимости материалов, т.к. сшивающие агенты и катализаторы зачастую обладают высокой токсичностью. В случае физически сшитых гидрогелей силы, удерживающие трехмерную сетку, носят не ковалентный характер, а, как правило, сцепление происходит за счет гидрофобных взаимодействий, водородных связей, электростатического притяжения и т.д. Все это предполагает более простые методы получения и отсутствие потенциально токсичных сшивателей, однако существенным недостатком таких систем являются невысокие физико-механические характеристики. Часто такие материалы не способны поддерживать форму и имеют довольно низкие модули упругости, не сопоставимые с таковыми у нативных тканей организма. В связи с чем актуальным является разработка новых подходов получения гидрогелей, поиск новых материалов для создания биобезопасных прочных систем для потенциального применения в биомедицине.

Анализ российских и зарубежных патентов показал, что на данном этапе развития области глобально можно выделить 3 основных способа получения гидрогелевых материалов:

1) Химическая сшивка (около 29% исследованных патентов)

2) Смешение компонентов с образованием гидрогеля (52%)

3) Циклы заморозки-оттаивания для получения криогелей (8%)

Самыми часто используемыми высокомолекулярными соединениями для получения гидрогелей по результатам анализа известного уровня техники являются: хитозан (около 25% исследованных патентов), амфифильные блок-сополимеры этиленгликоля и капролактона и/или лактада и/или гликолида (22%), коллаген (13%), поливиниловый спирт (10%), целлюлоза (10%), полиакриламид (7%).

В патенте US11680107B2 раскрыт способ получения термочувствительных гидрогелей на основе амфифильных тройных и двойных блок-сополимеров этиленгликоля и лактид-со-гликолида различного состава. Смеси указанных сополимеров растворяли в фосфатно-солевом буфере (PBS) или трис-солевом буфере (TBS) при температуре 4°С (концентрации 15-25%). Полученные растворы термостатировали при температурах от 15 до 45°С для установления точки золь-гель перехода. По результатам реологических испытаний для всех образцов с концентрацией сополимеров 15% золь-гель переход выше 25°С. Такой метод приготовления гидрогелей достаточно простой, однако подходит только для сополимеров с небольшой молекулярной массой. Кроме того, результаты реологических испытаний демонстрируют очень низкие модули упругости (менее 100 Па). В качестве инжектируемых носителей лекарственных препаратов, как предлагают авторы патента, такой материал может быть использован, однако для создания тканеинженерных конструкций эти системы слишком не прочные.

В статьях [Bhatia S. R., Yin X., Hewitt D. R. О., Quah S. P., Zheng В., Mattei G. S., Khalifan P.G., Grubbs R.B. Soft Matter. V. 14. P. 7255-7263 (2018)] и [Surita R. Bhatia, Gregory N. Tew. Degrad. Polymers and Mater. V. 1114 (18). P. 313-324 (2012)] были получены гидрогелевые материалы на основе синтезированной серии тройных блок-сополимеров P(D,L)LA-PEG-P(D,L)LA (M_w=16,5-19,6 кДа, PDI=1,1-1,3) с различным соотношением D/L-звеньев. Способ получения включает диспергирование сополимеров в воде с последующим выдерживанием полученных суспензий при повышенной температуре. Изменение соотношения D/L дает нелинейное изменение модуля накоплений: при соотношениях 75/25 и 85/15 гидрогели более жесткие и обладают более высоким модулем, чем при 50/50 и 100/0. Авторы объясняют такое реологическое поведение конкуренцией между прочностью вследствие образования кристаллитов PLLA и уменьшением доли мостиковых цепей PEG. В случае соотношений 75/25 и 85/15 узлы в физической сетке гидрогеля являются полукристаллическими, т.е. присутствуют как аморфные домены, так мелкие или слабо упорядоченные кристаллиты. Такая структура дает достаточную подвижность проходным цепям гидрофильного блока для образования мостиковых структур. В зависимости от состава и концентрации значения модуля накоплений оказались в диапазоне 1-10 кПа.

В патенте US11884765B2 раскрыт способ получения химически сшитых гидрогелей на основе амфифильных двойных и тройных блок-сополимеров этиленгликоля и капролактона, модифицированных акрилоилхлоридом. В качестве инициатора был использован водорастворимый фенил(2,4,6-триметилбензоил)фосфинат лития (LAP). Модифицированные блок-сополимеры растворяли в дистиллированной воде и смешивали с водным раствором LAP, полученную смесь помещали в соответствующую форму и инициировали процесс воздействием излучения видимого диапазона (395-405 нм). В результате были получены прозрачные и эластичные гидрогели. Такой метод сшивки имеет ряд преимуществ. LAP -биобезопасный цитосовместимый водорастворимый фотоинициатор, помимо этого данный инициатор запускает полимеризацию под воздействием излучения видимого диапазона, что безопаснее, чем УФ. Однако в целом данный метод получения довольно сложный и затратный, поскольку включает процесс модификации концевых групп сополимеров акрилоилхлоридом, а также синтез LAP (как указали авторы патента). Хотя LAP коммерчески доступный инициатор, его применение будет сильно повышать себестоимость таких гидрогелей. Также несмотря на химическую сшивку модули упругости указанных систем все равно остаются не высокими: до 32 кПа по результатам испытаний на сжатие.

В патенте US10011689B2 раскрыт способ получения химически сшитых гидрогелей на основе амфифильных тройных блок-сополимеров этиленгликоля и лактид-со-гликолида, модифицированных акрилатными концевыми группами. В качестве инициатора сшивки используется достаточно токсичное и взрывоопасное соединение - азобисизобутиронитрил (AIBN), а сам процесс радикальной полимеризации протекает достаточно долго, после чего требуется длительная очистка от остаточного мономера, инициатора и т.д. Также полученные гидрогели имеют сравнительно низкие модули упругости не более 5 кПа.

Схожие подходы к получению химически сшитых систем раскрыты в патентах US2004077797A1, CN101845120A.

В статье [Li S., Molina I., Martinez M.B., Vert M. J. Mater. Science: Mater. Medicine. V. 13. P. 81-86 (2002)] был раскрыт способ получения гидрогелевых материалов через органическую фазу на основе синтезированных блок-сополимеров P(D,L)LA-PEG-P(D,L)LA (M_n=45,8 кДа и M_n=78,9 кДа) с достаточно длинными гидрофильными и гидрофобными блоками. Для этого сополимеры растворяли при нагревании в тетраэтиленгликоле, после чего охлаждали до комнатной температуры и отмывали от исходного растворителя в дистиллированной воде. Полученные данным образом гидрогели способны поддерживать дискообразную форму, что свидетельствует о достаточно высоких значениях модуля упругости для подобных систем. Однако в данной работе не были изучены физико-механические характеристики полученных гидрогелей.

Наиболее близким к настоящему изобретению является патент US6350812B1, в котором раскрывается способ получения физически сшитых гидрогелей на основе тройных блок-сополимеров лактида и этиленгликоля, за счет подбора состава высокомолекулярного соединения. Способ включает растворение блок-сополимеров в минимальном количестве ацетона (0,2 г образца в 0,4 или 0,8 мл растворителя), добавление дистиллированной воды (4 мл) и очистку от остаточного органического растворителя заменой воды, методом диализа или выпариванием ацетона. В результате был получен мягкий гидрогель. Данный метод по смыслу схож с заявляемым патентом, т.к. аналогично предполагает растворение блок-сополимера в органическом растворителе и его замену на водную фазу. Недостатки прототипа: 1) частично ограниченный стенками сосуда объем раствора блок-сополимера может приводить к образованию довольно рыхлого и/или неспособного поддерживать форму гидрогелевого материала; 2) высокий градиент концентраций, т.к. контакт с водой будет преимущественно, с одной стороны, вследствие чего сетка гидрогеля будет формироваться не во всем объеме сразу. При проведении замены растворителя в диализном мешке, во-первых, ограничение объема органической фазы позволяет получать материалы определенной формы, которую они способны поддерживать длительное время. Во-вторых, диффузия растворителя через поры диализного мешка происходит более равномерно по всему объему.

Раскрытие изобретения

Технической задачей изобретения является разработка биосовместимых и биоразлагаемых гидрогелевых материалов методом замены органического растворителя на основе амфифильных тройных блок-сополимеров с широким диапазоном физико-механических характеристик для потенциальных применений в биомедицине.

Техническим результатом является получение биосовместимых и биоразлагаемых гидрогелевых материалов на основе амфифильных тройных блок-сополимеров методом замены органического растворителя с широким диапазоном модулей упругости от 3 кПа до 0,2 МПа.

Для достижения технического результата предложен способ получения биосовместимых и биоразлагаемых гидрогелей методом замены растворителя характеризующийся тем, что включает: стадию приготовления 15-20 масс. % раствора или растворов амфифильных блок-сополимеров полилактидов или полилактонов с полиэтиленгликолем в органическом растворителе, с последующим введением полученного раствора в диализный мешок с размером пор от 3,5 до 5,0 кДа и диаметром 6-10 мм, стадию диализа полученного раствора блок-сополимера в дистиллированной воде с удельной электропроводностью не более 10^-4 См/см в стакане объемом 1-5 л в течение 5-7 суток при постоянном перемешивании, где в первые 2-3 часа внешний раствор меняют каждые 30-60 минут, а далее раз в сутки до завершения процесса самоорганизации с образованием физической сетки гидрогеля и удаления остаточного органического растворителя, стадию извлечения полученного материала.

Совокупность приведенных выше существенных признаков приводит к тому, что получаемые данными способами гидрогели имеют преимущественно цилиндрическую форму с четкими границами, что подтверждает возможность получать материалы любых форм и размеров в зависимости от потенциального применения. Варьируя степень полимеризации гидрофильного и гидрофобных блоков сополимера и степень кристалличности можно получать материалы с широким диапазоном модулей упругости от 3 кПа до 0,2 МПа. Структура гидрогелей устойчива при нормальных условиях.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1 - Схема получения гидрогелевых материалов

Осуществление изобретения

Способ получения биосовместимых и биоразлагаемых гидрогелей методом замены растворителя состоит из следующих этапов:

1) Приготовление растворов амфифильных тройных блок-сополимеров в органическом растворителе

2) Диализ в дистиллированной воде

3) Извлечение гидрогелей

4) Контроль характеристик материалов

Амфифильные тройные блок-сополимеры полилактидов или полилактонов с полиэтиленгликолем включают биосовместимые гидрофильный и гидрофобные блоки. В качестве амфифильного тройного блок-сополимера полилактидов или полилактонов с полиэтиленгликолем используются амфифильные тройные блок-сополимеры с аморфными гидрофобными блоками, полукристаллическими гидрофобными блоками или полукристаллическими гидрофобными блоками с противоположными конфигурациями.

В качестве гидрофобного блока может быть выбран полимер из следующей группы: полигликолид (PGA), полилактид (PLA), поликапролактон (PCL) и их статистические сополимеры поли(лактид-со-гликолид) (PLGA), поли(лактид-со-капролактон) (PCLA). В качестве гидрофильного блока - полиэтиленгликоль (PEG). В предпочтительном варианте используются тройные блок-сополимеры лактида и этиленгликоля (PLA-PEG-PLA), например, P(L или D или D,L)LA-b-PEG-b-P(L или D или D,L)LA с различными степенями полимеризации гидрофильного и гидрофобных блоков.

Органические растворители, которые могут быть использованы для приготовления растворов блок-сополимеров, должны отвечать 2 условиям: хорошо растворять оба блока в составе сополимера, т.е. быть неселективными растворителями, и хорошо смешиваться с водой в любых соотношениях. В качестве таких растворителей может использоваться 1,4-диоксан, ДМСО, ацетон, ТГФ. В предпочтительном варианте используется 1,4-диоксан.

Приготовление растворов амфифильных тройных блок-сополимеров в органическом растворителе.

Для приготовления раствора амфифильного тройного блок-сополимера в органическом растворителе берут пробирку типа эппендорф или виалу с крышкой, в которой растворяют амфифильный тройной блок-сополимер в органическом растворителе с получением раствора с концентрацией блок-сополимера 15-20 масс. %.

Для приготовления раствора смеси амфифильных тройных блок-сополимеров с противоположными конфигурациями гидрофобных блоков в органическом растворителе используют две разные пробирки типа эппендорф или виалы с крышкой, в которых растворяют амфифильные тройные блок-сополимеры в органическом растворителе с получением 15-20 масс. % растворов, которые затем смешивают для получения стереокомплексных структур. Полученный раствор амфифильных тройных блок-сополимеров помещают в диализный мешок с размером пор от 3,5 до 5,0 кДа и диаметром 6-10 мм и необязательно выдерживают в 1,4-диоксане в течение 2-3 суток для формирования стереокомплексных узлов сетки до полного завершения процесса структурообразования (фиг. 1) или же сразу переходят к следующей стадии.

Диализ

Диализный мешок с раствором амфифильного(-ых) тройного(-ых) блок-сополимера(-ов) помещают в стакан объемом 1-5 л с дистиллированной водой с удельной электропроводностью не более 10^-4 См/см. Диализ проводят в течение 5-7 суток при постоянном перемешивании, в первые несколько часов внешний раствор меняют каждые 30-60 минут, далее раз в сутки до завершения процесса самоорганизации с образованием физической сетки гидрогеля и удаления остаточного органического растворителя. В данной методике замена растворителя лимитируется скоростью диффузии через поры диализного мешка. Вследствие максимального градиента концентраций для данных условий полимерные цепи формируют гидрогелевую сетку в первые несколько часов.

Извлечение гидрогелей

После завершения диализа полученные гидрогели извлекают из диализных мешков для дальнейших исследований.

Контроль характеристик материалов

Контроль характеристик материала осуществляют согласно техническим требованиям на выпускаемую продукцию.

Приведенные ниже примеры иллюстрируют варианты заявленного изобретения, но не ограничивают его.

Пример 1.

В пластиковом виале растворяют 0,8 г амфифильного тройного блок-сополимера P(D,L)LA₂₆-PEG₁₀₄-P(D,L)LA₂₆, где нижний индекс указывает степень полимеризации блока, с молекулярной массой 8,3 кДа и аморфными гидрофобными блоками в 3,2 г 1,4-диоксана («Компонент-реактив»). Полученный 20 масс. % раствор помещают в диализный мешок диаметром 10 мм и размером пор 3,5 кДа («Orange Scientific»), который погружают в стакан с дистиллированной водой 10^-4 См/см объемом 5 л. Диализ проводят в течение 5 суток при постоянном перемешивании, в первые 2 часа внешний раствор меняют каждые 30 минут, далее раз в сутки до завершения процесса самоорганизации с образованием физической сетки гидрогеля и удаления остаточного органического растворителя. После окончания процесса диализа полученный гидрогель извлекают из диализного мешка. Модуль упругости полученного гидрогелевого материала составил 3 кПа.

Пример 2.

В двух пластиковых виалах отдельно растворяют по 0,4 г амфифильных тройных блок-сополимеров P(L)LA₆₅-PEG₁₃₆-P(L)LA₆₅ и P(D)LA₆₅-PEG₁₃₆-P(D)LA₆₅, где нижний индекс указывает степень полимеризации блока, с молекулярной массой 15,4 кДа и полукристаллическими гидрофобными блоками противоположной конфигурации в 1,6 г 1,4-диоксана («Компонент-реактив»). Полученные растворы смешивают в массовом соотношении 1:1, помещают в диализный мешок диаметром 10 мм и размером пор 5,0 кДа («Orange Scientific))), который погружают в стакан с дистиллированной водой (10^-4 См/см) объемом 1 л. Диализ проводят в течение 6 суток при постоянном перемешивании, в первые 3 часа внешний раствор меняют каждые 40 минут, далее раз в сутки до завершения процесса самоорганизации с образованием физической сетки гидрогеля и удаления остаточного органического растворителя. После окончания процесса диализа полученный гидрогель извлекают из диализного мешка. Модуль упругости полученного гидрогелевого материала составил 170 кПа.

Пример 3.

В двух пластиковых виалах отдельно растворяют по 0,4 г амфифильных тройных блок-сополимеров P(L)LA₃₈-PEG₁₃₆-P(L)LA₃₈ и P(D)LA₃₈-PEG₁₃₆-P(D)LA₃₈, где нижний индекс указывает степень полимеризации блока, с молекулярной массой 11,5 кДа и полукристаллическими гидрофобными блоками противоположной конфигурации в 1,6 г 1,4-диоксана («Компонент-реактив»). Полученные растворы смешивают массовом соотношении 1:1, помещают в диализный мешок диаметром 10 мм и размером пор 3,5 кДа («Orange Scientific») и выдерживают его в 1,4-диоксане в течение 2 суток для формирования стереокомплексных узлов сетки до полного завершения процесса структурообразования. Полученный органический гель в диализном мешке погружают в стакан с дистиллированной водой (10^-4 См/см) объемом 3 л. Диализ проводят в течение 7 суток при постоянном перемешивании, в первые 2,5 часа внешний раствор меняют каждые 60 минут, далее раз в сутки до полного удаления остаточного органического растворителя. После окончания процесса диализа полученный гидрогель извлекают из диализного мешка. Модуль упругости полученного гидрогелевого материала составил 98 кПа.

Пример 4.

В пластиковом виале растворяют 0,8 г амфифильного тройного блок-сополимера P(L)LA₂₁₀-PEG₂₇₂-P(L)LA₂₁₀, где нижний индекс указывает степень полимеризации блока, с молекулярной массой 42,2 к Да и полукристаллическими гидрофобными блоками в 3,2 г 1,4-диоксана («Компонент-реактив»). Полученный 20 масс. % раствор помещают в диализный мешок диаметром 6 мм и размером пор 3,5 кДа («Orange Scientific))), который погружают в стакан с дистиллированной водой (10^-4 См/см) объемом 5 л. Диализ проводят в течение 7 суток при постоянном перемешивании, в первые 2 часа внешний раствор меняют каждые 30 минут, далее раз в сутки до завершения процесса самоорганизации с образованием физической сетки гидрогеля и удаления остаточного органического растворителя. После окончания процесса диализа полученный гидрогель извлекают из диализного мешка. Модуль упругости полученного гидрогелевого материала составил 35 кПа.

Таким образом, предложенный способ получения биосовместимых и биоразлагаемых гидрогелей позволяет получать гидрогели преимущественно цилиндрической формы, с четкими границами, структура которых устойчива при нормальных условиях, с широким диапазоном модулей упругости от 3 кПа до 0,2 МПа, что расширяет спектр возможных применений таких материалов в биомедицинской области.

Изобретение относится к химии, более конкретно к области высокомолекулярных соединений. Предложен способ получения биосовместимых и биоразлагаемых гидрогелей методом замены растворителя, включающий: стадию приготовления 15-20 масс. % раствора или растворов амфифильных тройных блок-сополимеров полилактидов или полилактонов с полиэтиленгликолем в органическом растворителе с последующим введением полученного раствора в диализный мешок с размером пор 3,5-5,0 кДа и диаметром 6-10 мм; стадию диализа полученного раствора блок-сополимера в дистиллированной воде с удельной электропроводностью не более 10^-4 См/см в стакане объемом 1-5 л в течение 5-7 суток при постоянном перемешивании, где в первые 2-3 ч внешний раствор меняют каждые 30-60 мин, а далее раз в сутки до завершения процесса самоорганизации с образованием физической сетки гидрогеля и удаления остаточного органического растворителя; стадию извлечения полученного материала. Изобретение обеспечивает получение гидрогелевых материалов с широким диапазоном модулей упругости от 3 кПа до 0,2 МПа. 2 з.п. ф-лы, 1 ил., 4 пр.

1. Способ получения биосовместимых и биоразлагаемых гидрогелей методом замены растворителя, характеризующийся тем, что включает: стадию приготовления 15-20 масс. % раствора или растворов амфифильных тройных блок-сополимеров полилактидов или полилактонов с полиэтиленгликолем в органическом растворителе с последующим введением полученного раствора в диализный мешок с размером пор от 3,5 до 5,0 кДа и диаметром 6-10 мм, стадию диализа полученного раствора блок-сополимера в дистиллированной воде с удельной электропроводностью не более 10^-4 См/см в стакане объемом 1-5 л в течение 5-7 суток при постоянном перемешивании, где в первые 2-3 ч внешний раствор меняют каждые 30-60 мин, а далее раз в сутки до завершения процесса самоорганизации с образованием физической сетки гидрогеля и удаления остаточного органического растворителя, стадию извлечения полученного материала.

2. Способ получения биосовместимых и биоразлагаемых гидрогелей методом замены растворителя по п. 1, отличающийся тем, что в качестве амфифильного блок-сополимера полилактидов или полилактонов с полиэтиленгликолем используются амфифильные тройные блок-сополимеры с аморфными блоками, полукристаллическими гидрофобными блоками или с полукристалическими гидрофобными блоками с противоположными конфигурациями.

3. Способ получения биосовместимых и биоразлагаемых гидрогелей методом замены растворителя по п. 1, отличающийся тем, что перед стадией диализа смесь растворов амфифильных блок-сополимеров полилактидов или полилактонов с полиэтиленгликолем в органическом растворителе помещают в диализный мешок и необязательно выдерживают в органическом растворителе в течение 2-3 суток для формирования стереокомплексных узлов сетки до полного завершения процесса структурообразования.