Способ повышения однородности липосомальных комплексов на основе миРНК при загрузке на липосомальный вектор Российский патент 2025 года по МПК C12N15/88 C12N15/52 A61K9/127 A61K47/18 A61K47/30 C07C271/16 C07C271/34 C07F9/113 

Область применения.

Изобретение относится к области биотехнологии, медицины и химико-фармацевтической промышленности, и описывает способ получения комплексов миРНК/липосомальный вектор для экспериментов in vivo.

Уровень техники.

В серии многочисленных исследований на клетках in vitro было показано, что липидные системы доставки 2X3-DOPE на основе катионного липида 2Х3 и липида-хелпера DOPE могут эффективно доставлять короткие РНК дуплексы в клетки для инициации процесса РНК-интерференции [Патент на изобретение № 2747559, опубл. 06.05.2021 Бюл. № 13; патент на изобретение № 2683572 опубл. 29.03.2019 Бюл. № 10; 1. Luneva, A.S., Puchkov, P.A., Shmendel, E.V. et al. Optimization of the Technology for the Preparation of Cationic Liposomes for the Delivery of Nucleic Acids. Russ J Bioorg Chem 44, 724–731 (2018). https://doi.org/10.1134/S1068162019010084]. Преимущество этой системы доставки состоит в том, что цвиттер-ионный хелперный липид 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин (DOPE) способен образовывать инвертированную гексагональную фазу при кислом рН эндосом, что способствует повышению эффективности высвобождения нуклеиновых кислот в цитоплазме [Vysochinskaya V. et al. Influence of Lipid Composition of Cationic Liposomes 2X3-DOPE on mRNA Delivery into Eukaryotic Cells // Pharmaceutics. 2022. Vol. 15, № 1. P. 8.]. Однако, при получении суспензии частиц на основе катионных липосом и целевых дуплексов для экспериментов in vivo приходится использовать более высокие концентрации исходных компонентов, что ведет к значительным изменениям физико-химических характеристик разрабатываемых лекарственных средств и усложняет стандартизацию условий при проведении доклинических исследований.

Сущность изобретения

Технический результат заявляемого изобретения направлен на повышение однородности получаемых при реализации способа липосомальных комплексов на основе миРНК при загрузке на липосомальный вектор.

Результат достигается за счет того, что в способе повышения однородности липосомальных комплексов на основе миРНК при загрузке на липосомальный вектор готовят рабочие растворы для загрузки дуплексов миРНК на липосомальный вектор, представляющие собой раствор миРНК и раствор липосом. Рабочие растворы для загрузки дуплексов миРНК на липосомальный вектор без полисорбата готовят следующим образом: раствор миРНК готовят путем внесения в 422 мкл воды для инъекций 118 мкл исходного раствора миРНК, представляющего собой раствор миРНК в воде с концентрацией дуплекса 0,2 мМ, имеющего размер 21 нуклеотидных пар (остатков), после чего осуществляют перемешивание пипетированием, затем полученный раствор выдерживают при комнатной температуре 10 минут, а раствор липосом готовят путем внесения в 492 мкл исходного раствора 2мМ липосом, представляющего собой поликатионный липид 1,26-бис(холест-5-ен-3β-илоксикарбониламино) -7,11,16-2-тетраазагексакозан тетрагидрохлорид (2X3) и липида-хелпера 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламина (DOPE),(катионные липосомы) 48 мкл воды для инъекций после чего осуществляют перемешивание пипетированием, затем полученный раствор выдерживают при комнатной температуре 10 минут.

Рабочие растворы, содержащие 0,05% полисорбата 80 готовят следующим образом: раствор миРНК готовят путем внесения в 417 мкл воды для инъекций 5,4 мкл 5% полисорбата 80 после чего осуществляют перемешивание пипетированием, затем полученный раствор выдерживали при комнатной температуре в течение 10 минут, затем в раствор с полисорбатом вносят 118 мкл исходного раствора 0,2мМ миРНК и перемешивают пипетированием, после этого раствор выдерживают при комнатной температуре 10 минут, а раствор липосом готовят путем внесения в 43 мкл воды для инъекций 5,4 мкл 5% полисорбата 80 и перемешивают пипетированием, после смешивания полученный раствор выдерживают при комнатной температуре в течение 10 минут, затем полученный раствор с полисорбатом вносят в 492 мкл исходного раствора 2мМ липосом и перемешивали пипетированием, затем полученный раствор выдерживают при комнатной температуре 10 минут.

Рабочие растворы, содержащих 0,1% полисорбата 80, готовят следующим образом: раствор миРНК готовят путем внесения в 417 мкл воды для инъекций вносили 5,4 мкл 10% полисорбата 80 и перемешивают пипетированием, после этого смешивают полученный раствор и выдерживают его при комнатной температуре в течение 10 минут, затем в раствор с полисорбатом вносят 118 мкл исходного раствора 0,2мМ миРНК и перемешивают пипетированием, а полученный раствор выдерживают при комнатной температуре 10 минут, а раствор липосом готовят путем внесения в 43 мкл воды для инъекций 5,4 мкл 10% полисорбата 80 и перемешивают пипетированием, после смешивания полученный раствор выдерживают при комнатной температуре в течение 10 минут, затем полученный раствор с полисорбатом вносят в 492 мкл исходного раствора 2мМ липосом и перемешивают пипетированием, а полученный раствор выдерживают при комнатной температуре 10 минут.

Рабочие растворы, содержащие 0,5% полисорбата 80, готовят следующим образом: раствор миРНК готовят путем внесения в 395 мкл воды для инъекций вносят 27 мкл 10% полисорбата 80 и перемешивают пипетированием, после этого смешивают полученный раствор и выдерживают его при комнатной температуре в течение 10 минут, затем в раствор с полисорбатом вносят 118 мкл исходного раствора 0,2мМ миРНК и перемешивают пипетированием, а полученный раствор выдерживают при комнатной температуре 10 минут, а раствор липосом готовят путем внесения в 21 мкл воды для инъекций 27 мкл 10% полисорбата 80 и перемешивают пипетированием, после смешивания полученный раствор выдерживают при комнатной температуре в течение 10 минут, затем полученный раствор с полисорбатом вносят в 492 мкл исходного раствора 2мМ липосом и перемешивают пипетированием, а полученный раствор выдерживают при комнатной температуре 10 минут.

После этого осуществляют загрузку миРНК на липосомальный вектор для этого осуществляют смешивание полученных растворов, содержащих дуплексы миРНК и липосомальный вектор, в потоке, используя шприцы для инъекций с диаметром иглы 29G, полученные в результате смешивания растворы комплексов миРНК на липосомальный вектор, выдерживают при комнатной температуре в течение 20 минут, затем отбирают объем 900 мкл полученных растворов с помощью 1-канальной автоматической пипетки, после чего вносят по 100 мкл 9% раствора хлорида натрия в каждый из анализируемых вариантом загрузки, перемешивают пипетированием и выдерживают при комнатной температуре не менее 60 минут перед использованием.

Изобретение поясняется следующими фигурами:

фиг. 1 – схема получения липосомальных комплексов;

фиг. 2 – размер липосомальных комплексов, полученных с использованием полисорбата 80;

фиг. 3 – Индекс полидисперсности липосомальных комплексов, полученных с использованием полисорбата 80;

фиг. 4 – Результаты проточной цитометрии. FL1- флуоресценция, FITC; SSC- боковое светорассеяние. Q2 – процент клеток связавшихся с меченными флуоресцентным дуплексом липосомами. Q4 – процент клеток без флуоресцентного сигнала. Время детекции: 6 часов после трансфекции;

фиг. 5 – Накопление миРНК в органах после внутривенного введения. Статистически значимые различия по отношению к контрольной группе получены для тканей печени, селезенки, почки и легкого (р < 0,05): (А) Инъекционная доза 2,5 мг/кг, (Б) инъекционная доза 7,5 мг/кг.

Осуществление изобретения

При реализации настоящего изобретения использовали поликатионный липид 1,26-бис(холест-5-ен-3β-илоксикарбониламино) -7,11,16-2-тетраазагексакозан тетрагидрохлорид (2X3) и липид-хелпер 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламина (DOPE) (катионные липосомы) на основе которых были получены липосомы с использованием ультразвуковой обработки:

В качестве миРНК использовали дуплекс с выступающими липкими концами, образованный двумя комплементарными олигонуклеотидами длиной 21 нуклеотидный остаток [Патент на изобретение № 2644675, опубликован 13.02.2018, Бюл. №5]:

Структура полисорбата 80 представляла собой:

Электростатическое взаимодействие положительно заряженных катионных липосомальных векторов и отрицательно заряженных молекул нуклеиновых кислот приводит к образованию наноразмерных липосомальных комплексов, которые связываются с отрицательно заряженной мембраной клетки и проникают внутрь. Эффективность проникновения частицы в клетку зависит от ее размера. При получении липосомальных комплексов путем обычного смешивания наблюдается широкое распределение частиц по размерам, что неизбежно ведет к снижению эффективности переноса миРНК в цитозоль. В отдельных случаях средний кумулятивный диаметр частиц в препарате может достигать 1300 нм при индексе полидисперсности 0,6, что осложняет их последующее использование в экспериментах in vivo.

В этой связи нами была проведена серия экспериментов по оптимизации условий загрузки миРНК на липосомальный вектор. Условия определялись для дуплексов миРНК длиной 21 нуклеотидный остаток с выступающими липкими концами. В качестве дополнительного компонента загрузки в состав препарата был введен полиоксиэтилен(20)-сорбитанмоноолеата (полисорбат 80). Полисорбат 80 рекомендован Европейской фармакопеей в качестве поверхностно-активного вещества для улучшения солюбилизирующих свойств. В экспериментах использовались водные растворы дуплексов миРНК и липосомального вектора, содержащие полисорбат 80 в интервале концентраций 0-0,5%.

Подготовка растворов и загрузку миРНК на липосомальный вектор.

Исходные растворы представляли собой:

1. Раствор миРНК в воде, концентрация дуплекса 0,2 мМ.

Концентрация дуплекса обусловлена технологической схемой их получения из одноцепочечный олигонуклеотидов и техническими характеристиками используемого оборудования.

Лабораторный регламент получения лекарственного средства на основе малых интерферирующих РНК (ЛР 96028925-02-2016; ООО «Российское общество онкоурологов», 2016).

2. Раствор липосом в воде, концентрация 2 мМ.

Концентрация липосом обусловлена технологической схемой их получения из липидной пленки и техническими характеристиками используемого оборудования.

Лабораторный регламент получения лекарственного средства на основе малых интерферирующих РНК (ЛР 96028925-02-2016; ООО «Российское общество онкоурологов», 2016).

3. Раствор полисорбата 80 в воде, концентрация 5%.

Концентрация обусловлена техническими характеристиками используемого оборудования и значением критической концентрации мицеллообразования для полисорбата 80 в воде.

4. Раствор полисорбата 80 в воде, концентрация 10%.

Концентрация обусловлена техническими характеристиками используемого оборудования и значением критической концентрации мицеллообразования для полисорбата 80 в воде.

5. Раствор хлорида натрия в воде, концентрация 9%.

Концентрация обусловлена техническими характеристиками используемого оборудования и соответствует десятикратной концентрации изотонического раствора для плазмы крови.

6. Вода для инъекций.

Подготовка растворов:

Подготовка рабочих растворов для загрузки дуплексов миРНК на липосомальный вектор без полисорбата:

Раствор миРНК готовили следующим образом: в 422 мкл воды для инъекций вносили 118 мкл исходного раствора 0,2мМ миРНК и перемешивали пипетированием. Раствор выдерживали при комнатной температуре 10 минут.

Раствор липосом готовили следующим образом: в 492 мкл исходного раствора 2мМ липосом вносили 48 мкл воды для инъекций и перемешивали пипетированием. Раствор выдерживали при комнатной температуре 10 минут.

Подготовка рабочих растворов, содержащих 0,05% полисорбата 80, для загрузки дуплексов миРНК на липосомальный вектор:

Раствор миРНК готовили следующим образом: в 417 мкл воды для инъекций вносили 5,4 мкл 5% полисорбата 80 и перемешивали пипетированием. После смешивания полученный раствор выдерживали при комнатной температуре в течение 10 минут. Затем в раствор с полисорбатом вносили 118 мкл исходного раствора 0,2мМ миРНК и перемешивали пипетированием. Раствор выдерживали при комнатной температуре 10 минут.

Раствор липосом готовили следующим образом: в 43 мкл воды для инъекций вносили 5,4 мкл 5% полисорбата 80 и перемешивали пипетированием. После смешивания полученный раствор выдерживали при комнатной температуре в течение 10 минут. Затем полученный раствор с полисорбатом вносили в 492 мкл исходного раствора 2мМ липосом и перемешивали пипетированием. Раствор выдерживали при комнатной температуре 10 минут.

Подготовка рабочих растворов, содержащих 0,1% полисорбата 80, для загрузки дуплексов миРНК на липосомальный вектор:

Раствор миРНК готовили следующим образом: в 417 мкл воды для инъекций вносили 5,4 мкл 10% полисорбата 80 и перемешивали пипетированием. После смешивания полученный раствор выдерживали при комнатной температуре в течение 10 минут. Затем в раствор с полисорбатом вносили 118 мкл исходного раствора 0,2мМ миРНК и перемешивали пипетированием. Раствор выдерживали при комнатной температуре 10 минут.

Раствор липосом готовили следующим образом: в 43 мкл воды для инъекций вносили 5,4 мкл 10% полисорбата 80 и перемешивали пипетированием. После смешивания полученный раствор выдерживали при комнатной температуре в течение 10 минут. Затем полученный раствор с полисорбатом вносили в 492 мкл исходного раствора 2мМ липосом и перемешивали пипетированием. Раствор выдерживали при комнатной температуре 10 минут.

Подготовка рабочих растворов, содержащих 0,5% полисорбата 80, для загрузки дуплексов миРНК на липосомальный вектор:

Раствор миРНК готовили следующим образом: в 395 мкл воды для инъекций вносили 27 мкл 10% полисорбата 80 и перемешивали пипетированием. После смешивания полученный раствор выдерживали при комнатной температуре в течение 10 минут. Затем в раствор с полисорбатом вносили 118 мкл исходного раствора 0,2мМ миРНК и перемешивали пипетированием. Раствор выдерживали при комнатной температуре 10 минут.

Раствор липосом готовили следующим образом: в 21 мкл воды для инъекций вносили 27 мкл 10% полисорбата 80 и перемешивали пипетированием. После смешивания полученный раствор выдерживали при комнатной температуре в течение 10 минут. Затем полученный раствор с полисорбатом вносили в 492 мкл исходного раствора 2мМ липосом и перемешивали пипетированием. Раствор выдерживали при комнатной температуре 10 минут.

Загрузка миРНК на липосомальный вектор:

Во всех случаях смешивание растворов, содержащих дуплексы миРНК и липосомальный вектор, проводили в потоке, используя шприцы для инъекций с диаметром иглы 29G, так, как это показано на фигуре 1

Полученные в результате смешивания растворы комплексов миРНК/липосомальный вектор, выдерживали при комнатной температуре в течение 20 минут. Отбирали объем 900 мкл полученных растворов с помощью 1-канальной автоматической пипетки (Gilson Pipetman, 100-1000 мкл), после чего вносили по 100 мкл 9% раствора хлорида натрия в каждый из анализируемых вариантов загрузки, перемешивали пипетированием и выдерживали при комнатной температуре не менее 60 минут перед использованием.

Контроль качества загрузки

Оценку физико-химических характеристик проводили методом динамического лазерного светорассеяния с использованием анализатора Delsa™Nano (Beckman Coulter, США). Определяли гидродинамический диаметр и индекс полидисперсности (фиг.2 и фиг. 3). Измерения проводились при t=25 °C. Результаты отражают среднее значение трех измерений.

Использование поверхностно-активного вещества полисорбат 80 позволило улучшить физико-химические характеристики получаемых препаратов. Было показано, что в присутствии полисорбата 80 при получении липосомальных комплексов, размер и индекс полидисперсности комплексов уменьшаются, а стабильность липосомальных комплексов увеличивается (фиг.2 и фиг. 3). Частицы оптимального размера < 200 нм были получены при концентрации 0,5% полисорбата 80. Данный размер частиц считается оптимальным при проведении экпериментов in vivo [Liu, D., Mori, A., & Huang, L. (1992). Role of liposome size and RES blockade in controlling biodistribution and tumor uptake of GM1-containing liposomes. Biochimica et biophysica acta, 1104(1), 95–101. https://doi.org/10.1016/0005-2736(92)90136-a; Elsana, H., Olusanya, T. O. B., Carr-Wilkinson, J., Darby, S., Faheem, A., & Elkordy, A. A. (2019). Evaluation of novel cationic gene based liposomes with cyclodextrin prepared by thin film hydration and microfluidic systems. Scientific reports, 9(1), 15120. https://doi.org/10.1038/s41598-019-51065-4].

Примеры использования.

Пример 1. Получение 10 мл препарата липосомальных комплексов в присутствии 0,5% полисорбата 80 для экспериментов in vivo.

Подготовку растворов и загрузку миРНК на липосомальный вектор проводили следующим образом.

Исходные растворы:

1. Раствор миРНК в воде, концентрация дуплекса 0,2 мМ;

2. Раствор липосом в воде, концентрация 2 мМ;

3. Раствор полисорбата 80 в воде, концентрация 10%;

4. Раствор хлорида натрия в воде, концентрация 9%;

5. Вода для инъекций.

Подготовка рабочих растворов, содержащих 0,5% полисорбата 80, для загрузки дуплексов миРНК на липосомальный вектор:

Раствор миРНК готовили следующим образом: в 3,95 мл воды для инъекций вносили 0,27 мл 10% полисорбата 80 и перемешивали пипетированием. После смешивания полученный раствор выдерживали при комнатной температуре в течение 10 минут. Затем в раствор с полисорбатом вносили 1,18 мл исходного раствора 0,2мМ миРНК и перемешивали пипетированием. Раствор выдерживали при комнатной температуре 10 минут.

Раствор липосом готовили следующим образом: в 0,21 мл воды для инъекций вносили 0,27 мл 10% полисорбата 80 и перемешивали пипетированием. После смешивания полученный раствор выдерживали при комнатной температуре в течение 10 минут. Затем полученный раствор с полисорбатом вносили в 4,92 мл исходного раствора 2мМ липосом и перемешивали пипетированием. Раствор выдерживали при комнатной температуре 10 минут.

Смешивание растворов, содержащих дуплексы миРНК и липосомальный вектор, проводили в потоке, используя шприцы для инъекций с диаметром иглы 29G.

Полученный в результате смешивания раствор липосомальных комплексов выдерживали при комнатной температуре в течение 20 минут. Отбирали объем 9,0 мл полученного раствора с помощью 1-канальной автоматической пипетки (Gilson Pipetman, 100-1000 мкл), после чего вносили 1,0 мл 9% раствора хлорида натрия в раствор липосомальных комплексов, перемешивали пипетированием и выдерживали при комнатной температуре не менее 60 минут перед использованием.

Состав тестируемого препапарата: миРНК дуплекс - 0,02 мМ (0,25±0,01 мг/мл), липосомы 2Х3: DOPE - 0,82 мМ (1,09±0,01 мг/мл), хлорид нария - 0,9%, полисорбат 80 - 0,45%.

Стабильность липосомальных комплексов оценивали в течение 7-ми дней (таблица 1).

Таблица 1. Стабильность препарата при концентрации полисорбата 80 0,5%

День измерения Средний диаметр частиц, нм Индекс полидесперсности 1 148.63±0.93 0.243±0.0104 2 142.93±2.40 0.250±0.01 3 143.30±0.62 0.244±0.0085 7 140.20±4.03 0.256±0.0090

Вывод: по результатам проведенных исследований показано, что полученные липосомальные комплексы являются стабильными и могут быть использованы в экспериментах in vivo в течение недели.

Пример 2. Оценка связывания с мембраной клетки липосомальных комплексов, полученных с использованием полисорбата 80 в концентрации 0,5%.

Оценку проводили с использованием стандартного флуоресцентного дуплекса (BLOCK-iT Fluorescent, Invitrogen, США), который является общепринятым препаратом сравнения для миРНК дуплексов. Загрузку флуоресцентного дуплекса на липосомальный вектор проводили согласно рекомендациям производителя в присутствии 0,5% полисорбата 80.

В клетках карциномы толстой кишки НТ-29 (АРС-/-) in vitro переносили загруженные в присутствии полисорбата 80 липосомальные комплексы. Эффективность связывания с мембраной клетки оценивали при помощи проточной цитометрии через 6 часов после трансфекции. Результаты анализа представлены на фиг. 4.

Таким образом, показано, что препарат связался с 70% клеток, что свидетельствует о потенциально высокой эффективности переноса миРНК в клетки посредством липосомального комплекса, полученного в присутствии 0,5% полисорбата 80.

Пример 3. Оценка переносимости препарата в условиях in vivo при однократном введении

Все эксперименты на животных проводили в строгом соответствии с требованиями национального стандарта Российской Федерации «Принципы надлежащей лабораторной практики» (ГОСТ 53434-2009, 2010 г.) и Приказа Минздравсоцразвития России № 708н от 13 октября 2010 г. «Об утверждении Правил лабораторной практики».

Состав тестируемого препапарата: миРНК дуплекс - 0,02 мМ (0,25±0,01 мг/мл), липосомы 2Х3: DOPE - 0,82 мМ (1,09±0,01мг/мл), хлорид нария - 0,9%, полисорбат 80 – 0,45%.

Загрузку миРНК на липосомальный вектор проводили так, как это указано в примере 1.

В эксперименте использовали самцов линии Balb/С, которым однократно внутривенно вводили по 3 и 1,5 мг/кг миРНК в составе испытуемого средства. Результаты эксперимента представлены в таблице 2. Гибели животных не наблюдали.

Таблица 2. Динамика изменения массы тела мышей линии Balb/С.

Доза, мг/кг Масса тела животных на сутки после введения препарата 0 3 7 14 3 19,5±1,6 23,0±0,9 23,4±0,9 23,9±1,1 1,5 20,8±0,8 21,8±1,4 22,2±1,3 22,9±0,9 контроль 21,3±1,1 23,1±0,8 23,3±0,5 24,0±0,9

В течение всего периода наблюдений все мыши нормально принимали корм и питьевую воду. Каких-либо изменений в состоянии шерстного покрова не обнаружено, шерсть гладкая. Случаев диареи, адинамии или агрессивности среди мышей опытных групп не зафиксировано. У умерщвлённых через 14 суток мышей при аутопсии не выявлено каких-либо патологических изменений внутренних органов.

Вывод: таким образом, полученные данные позволяют считать возможным однократное введение инъекционного раствора липосомальной композиции с полисорбатом 80 в экспериментах на животных.

Пример 4. Оценка переносимости препарата в условиях in vivo при многократном введении.

Все эксперименты на животных проводили в строгом соответствии с требованиями национального стандарта Российской Федерации «Принципы надлежащей лабораторной практики» (ГОСТ 53434-2009, 2010 г.) и Приказа Минздравсоцразвития России № 708н от 13 октября 2010 г. «Об утверждении Правил лабораторной практики».

Состав тестируемого препапарата: миРНК дуплекс - 0,02 мМ (0,25±0,01 мг/мл), липосомы 2Х3: DOPE - 0,82 мМ (1,09±0,01мг/мл), хлорид нария - 0,9%, полисорбат 80 - 0,45%.

Загрузку миРНК на липосомальный вектор проводили так, как это указано в примере 1.

В эксперименте использовали самцов и самок гибридов первого поколения, F1(CBA/Lac x C57BL/6), которым в течении пяти суток внутривенно вводили по 3 мг/кг миРНК в составе испытуемого средства, суммарная доза - 15 мг/кг миРНК. Результаты эксперимента представлены в таблице 3.

Таблица 3. Переносимость инъекционного раствора липосомального комплекса с 0,45% полисорбатом 80 при многократном введении.

группа Кол. живот. Вводимое вещество Доза при однократном введении, мл/мышь Состояние,
поведение Гибель сутки 1 2 3 4 5 самки 5 миРНК 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 без отклонений нет самцы 5 миРНК 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 без отклонений нет самки 5 Физ. раствор 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 без отклонений нет самцы 5 Физ. раствор 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 без отклонений нет

В течение всего периода наблюдений, 6 суток, все мыши нормально принимали корм и питьевую воду. Каких-либо изменений в состоянии шерстного покрова не обнаружено, шерсть гладкая. Случаев диареи, адинамии или агрессивности среди мышей опытных групп не зафиксировано. У умерщвлённых через 6 суток мышей при аутопсии не выявлено каких-либо патологических изменений внутренних органов.

Вывод: таким образом, полученные данные позволяют считать возможным многократное введение инъекционного раствора препарата с полисорбатом в экспериментах на животных.

Пример 5. Оценка распределения миРНК после внутривенного введения

Все эксперименты на животных проводили в строгом соответствии с требованиями национального стандарта Российской Федерации «Принципы надлежащей лабораторной практики» (ГОСТ 53434-2009, 2010 г.) и Приказа Минздравсоцразвития России № 708н от 13 октября 2010 г. «Об утверждении Правил лабораторной практики».

Состав тестируемого препапарата: миРНК дуплекс - 0,02 мМ (0,25±0,01 мг/мл), липосомы 2Х3: DOPE - 0,82 мМ (1,09±0,01мг/мл), хлорид нария - 0,9%, полисорбат 80 – 0,45%.

В исследовании использовали 18 здоровых мышей — самцов линии Balb/c, полученных из разведения в Российском онкологическом научном центре имени Н. Н. Блохина, с массой тела 21-22 г. Животные были рандомизированы на 3 группы: группа 1 (контрольная группа) получала внутривенно физиологический раствор хлористого натрия по 0,5 мл; группа 2 - внутривенно субстанцию на основе миРНК в дозе 2,5 мг/кг; группа 3 - внутривенно субстанцию на основе миРНК в дозе 7,5 мг/кг. Забор гистологического материала для проведения биохимического исследования осуществляли через 48 и 96 ч после внутривенного введения. Забой животных осуществляли в строгом соответствии с существующими требованиями. Количество экзогенных миРНК в образцах тканей оценивали при помощи количественной полимеразной цепной реакции (ПЦР) согласно рекомендациям Liu и соавт. [Liu WL, Stevenson M, Seymour LW, Fisher KD. Quantification of siRNA using competitive qPCR. Nucleic Acids Res. 2009 Jan; 37 (1): e4.]. Результаты анализа представлены на фиг. 5.

Выводы: в результате проведенного исследования было показано, что органом, наиболее восприимчивым к действию препаратов на основе РНК-интерференции, является печень. Повышение вводимой дозы миРНК приводит к кратному увеличению миРНК в тканях почки и мозга в течение 48 ч с последующим снижением их концентрации к 96 ч. В целом распределение миРНК между органами носит неравномерный характер, что необходимо учитывать при разработке новых таргетных препаратов на основе РНК-интерференции.

Изобретение относится к области биотехнологии. Раскрывается способ получения комплексов миРНК/липосомальный вектор для экспериментов in vivo, обеспечивающий повышение однородности полученных комплексов при более высоких концентрациях исходных реагентов. 5 ил, 3 табл., 5 пр.

Способ повышения однородности липосомальных комплексов на основе миРНК при загрузке на липосомальный вектор, характеризующийся тем, что готовят следующие рабочие растворы для загрузки дуплексов миРНК на липосомальный вектор, представляющие собой раствор миРНК и раствор липосом:

рабочие растворы для загрузки дуплексов миРНК на липосомальный вектор без полисорбата, для этого раствор миРНК готовят путем внесения в 422 мкл воды для инъекций 118 мкл исходного раствора миРНК, представляющего собой раствор миРНК в воде с концентрацией дуплекса 0,2 мМ, имеющего размер 21 нуклеотидных пар, после чего осуществляют перемешивание пипетированием, затем полученный раствор выдерживают при комнатной температуре 10 минут, а раствор липосом готовят путем внесения в 492 мкл исходного раствора 2мМ липосом, представляющего собой поликатионный липид 1,26-бис (холест-5-ен-3β-илоксикарбониламино) -7,11,16-2-тетраазагексакозан тетрагидрохлорид и липида-хелпера 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламина, 48 мкл воды для инъекций, после чего осуществляют перемешивание пипетированием, затем полученный раствор выдерживают при комнатной температуре 10 минут,

рабочие растворы, содержащие 0,05% полисорбата 80, для этого: раствор миРНК готовят путем внесения в 417 мкл воды для инъекций 5,4 мкл 5% полисорбата 80, после чего осуществляют перемешивание пипетированием, затем полученный раствор выдерживают при комнатной температуре в течение 10 минут, затем в раствор с полисорбатом вносят 118 мкл исходного раствора 0,2мМ миРНК и перемешивают пипетированием, после этого раствор выдерживают при комнатной температуре 10 минут, а раствор липосом готовят путем внесения в 43 мкл воды для инъекций 5,4 мкл 5% полисорбата 80 и перемемешивают пипетированием, после смешивания полученный раствор выдерживали при комнатной температуре в течение 10 минут, затем полученный раствор с полисорбатом вносили в 492 мкл исходного раствора 2мМ липосом и перемешивали пипетированием, затем полученный раствор выдерживают при комнатной температуре 10 минут,

рабочие растворы, содержащие 0,1% полисорбата 80, для этого: раствор миРНК готовят путем внесения в 417 мкл воды для инъекций 5,4 мкл 10% полисорбата 80 и перемешивают пипетированием, после этого смешивают полученный раствор и выдерживают его при комнатной температуре в течение 10 минут, затем в раствор с полисорбатом вносят 118 мкл исходного раствора 0,2мМ миРНК и перемешивают пипетированием, а полученный раствор выдерживают при комнатной температуре 10 минут, а раствор липосом готовят путем внесения в 43 мкл воды для инъекций 5,4 мкл 10% полисорбата 80 и перемешивают пипетированием, после смешивания полученный раствор выдерживают при комнатной температуре в течение 10 минут, затем полученный раствор с полисорбатом вносят в 492 мкл исходного раствора 2мМ липосом и перемешивают пипетированием, а полученный раствор выдерживают при комнатной температуре 10 минут,

рабочие растворы, содержащие 0,5% полисорбата 80, готовят следующим образом: раствор миРНК готовят путем внесения в 395 мкл воды для инъекций 27 мкл 10% полисорбата 80 и перемешивают пипетированием, после этого смешивают полученный раствор и выдерживают его при комнатной температуре в течение 10 минут, затем в раствор с полисорбатом вносят 118 мкл исходного раствора 0,2мМ миРНК и перемешивают пипетированием, а полученный раствор выдерживают при комнатной температуре 10 минут, а раствор липосом готовят путем внесения в 21 мкл воды для инъекций 27 мкл 10% полисорбата 80 и перемешивают пипетированием, после смешивания полученный раствор выдерживают при комнатной температуре в течение 10 минут, затем полученный раствор с полисорбатом вносят в 492 мкл исходного раствора 2мМ липосом и перемешивают пипетированием, а полученный раствор выдерживают при комнатной температуре 10 минут;

затем осуществляют саму загрузку миРНК на липосомальный вектор, для этого осуществляют смешивание полученных растворов, содержащих дуплексы миРНК и липосомальный вектор, в потоке, используя шприцы для инъекций с диаметром иглы 29G,

полученные в результате смешивания растворы комплексов миРНК загружают на липосомальный вектор, выдерживают при комнатной температуре в течение 20 минут, затем отбирают объем 900 мкл полученных растворов с помощью 1-канальной автоматической пипетки, после чего вносят по 100 мкл 9% раствора хлорида натрия в каждый из анализируемых вариантов загрузки, перемешивают пипетированием и выдерживают при комнатной температуре не менее 60 минут перед использованием.