Композиция на основе миРНК для ингибирования Gal-9 (LGALS9), препарат на ее основе и способ ее применения в качестве таргетного иммуностимулятора при анти-PD-L1 терапии Российский патент 2025 года по МПК A61K31/7115 C12N15/113 A61K47/24 A61K47/26 A61P35/00 

Изобретение относится к области биотехнологии, медицины и химико-фармацевтической промышленности, а именно для подавления экспрессирующегося в клетках опухоли гена β-галактозид-связывающего лектина (LGALS9), как в монорежиме, так и при лечении анти-PD-L1-моноклональными антителами. Подавление экспрессии LGALS9 способствует усилению Т-клеточного иммунного ответа в результате увеличения числа эффекторных Т-клеток, способных инициировать разрушение клеток опухоли.

В настоящее время широкое распространение в клинической практике получили препараты, нацеленные на активацию антиген-опосредованного цитолиза опухолевых клеток за счет направленного воздействия на иммунологические контрольные точки (ИКТ) («иммунологические чекпойнты» - immunological checkpoints). Однако, для значительной группы больных терапия ингибиторами ИКТ не является эффективной, в частности, в известном исследовании Брауна с соавторами [Braun DA, et al. Interplay of somatic alterations and immune infiltration modulates response to PD-1 blockade in advanced clear cell renal cell carcinoma. Nat Med. 2020 Jun;26(6):909-918. doi: 10.1038/s41591-020-0839-y. Epub 2020 May 29. PMID: 32472114; PMCID: PMC7499153], при проведении анти-PD-1 терапии у больных с местнораспространенным почечно-клеточным раком доля «не ответчиков» составила более 70%. С молекулярной точки зрения, наблюдаемый эффект обусловлен сложными механизмами взаимодействия между различными молекулами ИКТ, одновременно присутствующими на внешней стороне мембраны клетки [Mansorunov D, Apanovich N, Apanovich P, Kipkeeva F, Muzaffarova T, Kuzevanova A, Nikulin M, Malikhova O, Karpukhin A. Expression of Immune Checkpoints in Malignant Tumors: Therapy Targets and Biomarkers for the Gastric Cancer Prognosis. Diagnostics (Basel). 2021 Dec 16;11(12):2370. doi: 10.3390/diagnostics11122370. PMID: 34943606; PMCID: РМС8700640].

В настоящее время принято считать, что при лечении пациентов препаратами атезолизумаб, дурвалумаб или авелумаб происходит блокирование лиганда рецептора PD-1 и активация цитотоксических Т-клеток, ведущая к последующей гибели клеток опухоли. Однако, существующие схемы лечения не учитывают, что с данным рецептором способна связываться другая структурная молекула Gal-9, что снижает или даже блокирует ожидаемый терапевтический эффект [Mansorunov D, Apanovich N, Apanovich P, Kipkeeva F, Muzaffarova T, Kuzevanova A, Nikulin M, Malikhova O, Karpukhin A. Expression of Immune Checkpoints in Malignant Tumors: Therapy Targets and Biomarkers for the Gastric Cancer Prognosis. Diagnostics (Basel). 2021 Dec 16;11(12):2370. doi: 10.3390/diagnostics11122370. PMID: 34943606; PMCID: РМС8700640]. При многих типах рака экспрессия тепа. LGALS9 ассоциирована с плохим прогнозом, что позволяет рассматривать его в качестве потенциальной мишени для таргетной иммунотерапии [Yang, R., Sun, L., Li, CF. et al. Galectin-9 interacts with PD-1 and TIM-3 to regulate T cell death and is a target for cancer immunotherapy. Nat Commun 12, 832 (2021). https://doi.org/10.1038/s41467-021-21099-2].

Наиболее близкой к настоящему техническому решению является композиция для ингибирования роста и стимуляции апоптоза клеток колоректального рака по патенту на изобретение РФ №2644675, опубл 13.02.018, бюл. №5 МПК А61К 31/7115, C12N 15/113, А61Р 35/00, в котором указанная композиция содержит липосомы для доставки композиции в клетки-мишени и комбинацию двух дуплексов олигонуклеотидов миРНК. Первый дуплекс предназначен для блокирования гена МСМ4 и содержит препараты малых интерферирующих олигонуклеотидов 5'-C-U-C-A-U_met-C-U-C-U-U_met-A-C-C-C-A-C-A-G-G-dTs-dT-3' в качестве прямой цепи и 5'-C-C-U-G-U-G-G-G-U_met-A-A-G-A-G-A-U_met-G-A-G-dTs-dT-3' в качестве обратной цепи. Второй для блокирования гена Livin и содержит препараты малых интерферирующих олигонуклеотидов 5'-G-G-A-A-G-A-G-A-C-U-U_met-U-G-U-C-C-A-C_met-A-dTs-dT-3' в качестве прямой цепи и 5'-U-G-U-G-G-A-C_met-A-A-A-G-U-C-U_met-C-U-U-C-C-dTs-dT-3' в качестве обратной цепи, где U_met - 2'-O-метилуридин-3'-фосфат; C_met - 2'-O-метилцитидин-3'-фосфат; dTs- 2'-дезокситимидин-3'-фосфоротиоат; dT - 2'-дезокситимидин-3'-фосфат. Изобретение позволяет повысить эффективность ингибирования роста и индукции апоптоза клеток злокачественной опухоли, уменьшив при этом побочные эффекты.

Недостатком данной композиции является предпочтительное ее использование в комбинации с препаратами платины, что не позволяет полностью избавиться от группы побочных эффектов, обусловленных длительным применением цитостатических препаратов. Композиция не обеспечивает активации механизмов, позволяющих преодолеть иммунорезистентность опухолевых клеток.

Технической задачей изобретения является создание эффективного средства подавления экспрессии LGALS9 и, как следствие, усиления Т-клеточного иммунного ответа в результате увеличения числа эффективных Т-клеток, способных инициировать разрушение клеток опухоли, а также расширение арсенала средств подавления экспрессирующегося в клетках опухоли гена β-галактозид-связывающего лектина (LGALS9), как в монорежиме, так и при лечении анти-PD-L1-моноклональными антителами.

Техническая задача достигается за счет того, что для ингибирования экспрессии β-галактозид-связывающего лектина (LGALS9) используются малые интерферирующие РНК, специфично распознающие участок мРНК гена LGALS9, в комбинации с катионным липидом и полисорбатом 80. Максимальная эффективность подавления экспрессии гена LGALS9 наблюдается при использовании дуплекса миGal9 d1, который соответствует фрагменту 1004-1022 референсной последовательности мРНК гена (NCBI NM_009587.3, с. 1004-1022), что способствует усилению Т-клеточного иммунного ответа в результате увеличения числа эффекторных Т-клеток, способных инициировать разрушение клеток опухоли.

Сущность изобретения состоит в том, что композиция для усиления Т-клеточного иммунного ответа путем блокирования функции гена LGALS9 в клетках злокачественных опухолей содержит средство для доставки миРНК в клетки-мишени, представляющее собой липосомы и дуплекс, образованный двумя олигонуклеотидами и содержащий нуклеотидные последовательности коротких интерферирующие РНК:

5'-G-G-A-U-C-U-U-G-U-G-U-G-A-A-G-C-U-C-A-dT-dT-3' в качестве прямой цепи и

5'-U-G-A-G-C-U-U-C-A-C-A-C-A-A-G-A-U-C-C-dT-dT-3' в качестве обратной цепи,

где G, С, A, U - рибонуклеотиды;

dT - 2'-дезокситимидин-3'-фосфат.

При этом препарат миРНК-олигонуклеотидов выполнен в виде дуплекса прямой и обратной комплементарных цепей нуклеотидов следующей структуры:

где G, С, A, U - рибонуклеотиды;

dT - 2'-дезокситимидин-3'-фосфат.

Предпочтительно, чтобы в качестве средства для доставки композиции в клетки-мишени она содержала липосомы, представляющие собой поликатионный липид в качестве компонента, связывающего и упаковывающего используемую нуклеиновую кислоту (НК), и цвиттер-ионный фосфолипид DOPE в качестве структурообразующего и промотирующего компонента, при соотношении по заряду дуплекс: липосомы от 1:2 до 1:8.

Предпочтительно, чтобы средство для доставки композиции в клетки-мишени было выполнено в форме липидной пленки, состоящей из поликатионного липида и нейтрального фосфолипида, гидратированных в воде с получением эмульсионно- дисперсионной системы, подвергнутой ультразвуковой обработке или экструзии, причем поликатионный липид, фосфолипид DOPE взяты в мольном соотношении 1:2.

Предпочтительно, чтобы средство для доставки композиции в клетки-мишени было получено с использованием полиоксиэтилен(20)-сорбитанмоноолеата (полисорбата 80).

Применение композиции в качестве таргетного иммуностимулятора при анти-PD-L1 терапии, включает в себя внесение в культуру клеток средства для доставки миРНК в концентрации, определенной для конкретного объекта в серии предварительных экспериментов по эффективности подавления экспрессии гена LGALS9. Нижний порог эффективности соответствует уровню снижения экспрессии гена на 60% по сравнению с контролем. Применение композиции включает в себя внесение через 24 часа после трансфекции авелумаба (анти-PD-L1), который вносят в среду для культивирования из расчета, что конечная концентрация антител составляет 15 мкг/мл.

Изобретение поясняется следующими фигурами:

Фиг. 1 Доля образцов с повышенной экспрессией генов CD274 и LGALS9. Анализ образцов тканей рака почки 98 больных методом RT-PCR.

Фиг. 2 Уровень экспрессии гена LGALS9 через 24 часа после трансфекции в зависимости от структуры тестируемых РНК-дуплексов.

Фиг. 3 Схема получения лекарственного средства.

Фиг. 4 Схема комбинированного применения препарата для усиления функции авелумаба.

Фиг. 5 Уровень экспрессии гена LGALS9 через 24 часа после трансфекции в клетках, полученных из ткани рака почки.

Фиг. 6 Динамика изменения пролиферативных свойств клеточной популяции на основании измерения клеточного индекса. 1 - клетки опухоли; 2 - клетки опухоли, трансфецированные миРНК к генам CD274 и LGALS9; 3 - совместное культивирование клеток опухоли и Т-клеток пациента в соотношении 1:2; 4 - совместное культивирование клеток опухоли, трансфецированных миРНК к генам CD274 HLGALS9, и Т-клеток пациента в соотношении 1:2.

Фиг. 7 Изменение количества клеток опухоли при совместном культивировании с Т-клетками пациента в присутствии авелумаба (15 мкг/мл) и экзогенных миРНК. Проточная цитометрия (р<0,01).

Фиг. 8 Динамика изменения пролиферативных свойств клеточной популяции при культивировании в присутствии авелумаба (15 мкг/мл), на основании измерения клеточного индекса, где: 1 - клетки опухоли; 2 - совместное культивирование клеток опухоли и активированных Т-клеток пациента в соотношении 1:1; 3 - клетки опухоли, трансфецированные миРНК CON1; 4 - клетки опухоли, трансфецированные миРНК к гену LGALS9; 5 - совместное культивирование клеток опухоли, трансфецированных миРНК к гену LGALS9, и активированных Т-клеток пациента в соотношении 1:1; 6 - совместное культивирование клеток опухоли, трансфецированных миРНК к гену LGALS9, и активированных Т-клеток пациента в соотношении 1:2; 7 - совместное культивирование клеток опухоли, трансфецированных миРНК к гену LGALS9, и активированных Т-клеток пациента в соотношении 1:3.

В серии исследований нами было показано, что при раке почки уровень экспрессии гена CD274 (PD-L1), на который назначается иммунотаргетный препарат, повышен значительно реже, чем экспрессия гена LGALS9, фиг 1. Полученные сведения подтверждают целесообразность совместного подавления экспрессии обоих генов при проведении терапии, направленной на активацию цитотоксических Т-клеток посредством подавления действия иммунных контрольных точек PD1/PDL1 и TIM-3/Gal-9. Совместная экспрессия обоих генов наблюдалась во всех 98 проанализированных образцах опухоли почки. Одновременное повышение экспрессии обоих генов имело место в 10% случаев.

С технической точки зрения, ингибирование экспрессии гена LGALS9 может быть осуществлено на посттранскрипционном уровне в результате активации механизма РНК-интерференции, инициированного экзогенными двухцепочечными молекулами РНК (миРНК), внесенными в клетку при помощи липосомального вектора. В отличие от препаратов на основе антител, в этом случае, работа гена блокируется на уровне РНК, что снижает риск развития нежелательных побочных эффектов наблюдаемых при использовании высоких доз антител.

Для ингибирования экспрессии β-галактозид-связывающего лектина (LGALS9) в заявляемом изобретении использовались малые интерферирующие РНК, специфично распознающие участок мРНК гена LGALS9, в комбинации с катионным липидом и полисорбатом 80. Таргетный участок мРНК был определен по результатам серии специальных экспериментов, результаты которых представлены на фиг 2.

В результате исследований был сделан вывод о том, что максимальная эффективность подавления экспрессии гена LGALS9 наблюдается при использовании дуплекса миGal9 d1, который соответствует фрагменту 1004-1022 референсной последовательности мРНК гена (NCBI NM_009587.3, с. 1004-1022).

Для проведения исследований исходные олигонуклеотиды были синтезированы амидофосфитным триэфирным методом с использованием твердофазного ДНК синтезатора. Дуплексы были получены в результате отжига с использованием буфера: 300 мМ KCl; 30 мМ Hepes рН 7,5; 1 мМ MgCl 2. При этом структура олигонуклеотидов и дуплекса представляет собой:

Gal 1004s 5'-GGAUCUUGUGUGAAGCUCAdTdT-3' (при прямой цепи)

Gal 1004а 5'-UGAGCUUCACACAAGAUCCdTdT3' (при обратной цепи), где

где G, С, A, U - рибонуклеотиды;

dT - 2'-дезокситимидин-3'-фосфат.

Олигонуклеотиды миРНК были синтезированы по схеме, включающей следующие этапы (шаги синтеза):

1. Загрузка полимерного носителя CPG-1000 в колонку.

2. Заполнение камеры ДНК-синтезатора аргоном.

3. Промывка колонки ацетонитрилом из расчета 500 мкл ацетонетрила на 100 мкл полимерного носителя CPG-1000.

4. Удаление тритильной защиты с поверхности полимерного носителя CPG-1000.

5. Проведение реакции конденсации (присоединение первого мономера, н.о. dT(1)), осуществляли при помощи двукратного внесения мономера в объеме, эквивалентном одному рабочему объему колонки, при концентрации 0,1 М (мономер в ацетонитриле).

6. Промывка ацетонитрилом и блокирование непрореагировавших 5'-гидрооксилов.

7. Промывка ацетонитрилом и проведение реакции окисления.

8. Промывка колонки ацетонитрилом, первый шаг синтеза завершен.

9. Второй и последующие шаги синтеза начинали с реакции удаления тритильной защиты, с последующим присоединением следующего мономера так, как это изложено для присоединения первого мономера.

10. После присоединения последнего мономера сбрасывали давление аргона и заполняют реакционную камеру воздухом, после чего проводили аммонолиз. Полученный растворенный полупродукт собирали в пробоприемник и высушивали под вакуумом.

11. На завершающих этапах проводили снятие силильной защиты и реакцию детритилирования. Промежуточный технический полупродукт получали при помощи переосаждения перхлоратом лития в ацетоне.

12. Для получения олигонуклеотида с заданной степенью чистоты (не менее 95% основного вещества), проводят дополнительную очистку при помощи ВЭЖХ.

Упрощенная схема синтеза для Gal 1004s:

Порядок присоединения мономеров(1→21):

dT(1)+dT(2)+A(3)+C(4)+U(5)+C(6)+G(7)+A(8)+A(9)+G(10)+U(11)+G(12)+U(13)+G(14)+U(15)+U(16)+C(17)+U(18)+A(19)+G(20)+G(21)

Упрощенная схема синтеза для Gal 1004а:

Порядок присоединения мономеров(1→21):

dT(1)+dT(2)+C(3)+C(4)+U(5)+A(6)+G(7)+А(8)+А(9)+С(10)+А(11)+С(12)+А(13)+С(14)+U(15)+U(16)+C(17)+G(18)+А(19)+G(20)+U(21)

Структуры основных компонентов представляли собой:

Условия загрузки дуплексов были определены в серии экспериментов с учетом заряда липосомального вектора. В качестве контроля использовали стандартный флуоресцентный дуплекс (BLOCK-iT Fluorescent, Invitrogen, США). Для этого, 10 пикомоль миРНК смешивали с липосомальным вектором так, как это показано в таблице 1.

Соотношение дуплекс:липосомы от 1:2 до 1:8 были выбраны на основании предыдущих исследований и соответствует линейному увеличению числа загруженных дуплексов на липосому (патент на изобретение РФ №2644675, опубл 13.02.018, бюл. №5 МПК А61К 31/7115, C12N 15/113, А61Р 35/00). При значениях меньше 1:2 загрузка дуплекса на липосомальный вектор происходит с низкой эффективностью; при значении больше 1:8 наблюдается полное связывание положительно заряженных липосом с отрицательно заряженным дуплексом.

Для создания эффективных катионных липосом в их состав должен входить катионный липид, функцией которого является компактизация НК, и фосфолипиды -липиды-помощники, способствующие проникновению НК в клетку. В качестве вектора по доставки дуплекса в клетки опухоли в нашем изобретении использовали катионные липосомы 2X3:2DOPE. Химический состав: поликатионный липид 1,26-бис(холест-5-ен-3β-илоксикарбониламино)-7,11,16-2-тетраазагексакозан тетрагидрохлорид (2X3) и липида-хелпера 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламина (DOPE) в мольном соотношении 1:2.

Ранее было показано, что липидные системы доставки 2X3-DOPE на основе катионного липида 2X3 и липида-хелпера DOPE в мольном соотношении 1:1 и 1:2 могут эффективно доставлять НК in vitro и in vivo [Maslov M.A. et al. Novel cholesterol spermine conjugates provide efficient cellular delivery of plasmid DNA and small interfering RNA // J. Control. Release. Elsevier B.V., 2012. Vol. 160, №2. P. 182-193]. Цвиттер-ионный хелперный липид 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин (DOPE) способен образовывать инвертированную гексагональную фазу при кислом рН эндосом, что повышает эффективность высвобождения НК в цитоплазме. Также обнаружено, что мольные соотношения поликатиоиного амфифила 2X3 и липида-хелпера DOPE в структуре липосом влияют на эффективность трансфекци [Vysochinskaya V. et al. Influence of Lipid Composition of Cationic Liposomes 2X3-DOPE on mRNA Delivery into Eukaryotic Cells // Pharmaceutics. 2022. Vol. 15, №1. P. 8.]. Поэтому для разработки композиции было выбрано мольное соотношение 2X3 и DOPE 1:2.

Трансфекцию проводили на клетках перевиваемого рака почки человека РПоч1КК общепринятым методом [Luneva, A.S., Puchkov, P.A., Shmendel, E.V. et al. Optimization of the Technology for the Preparation of Cationic Liposomes for the Delivery of Nucleic Acids. Russ J Bioorg Chem 44, 724-731 (2018). https://doi.org/10.1134/S1068162019010084]. Для этого клетки высевали в 24-х луночные планшеты (концентрации 4,0*10⁴ клеток в 1 мл среды) за 24 часа до обработки. Перед трансфекцией питательную среду с 10% сывороткой заменяли на ту же среду с 1% сывороткой без антибиотиков. В каждую лунку вносили 5 пикомоль миРНК, загруженной на липосомальный вектор. Эффективность переноса оценивали при помощи проточной цитометрии через 24 часа после трансфекции. Результаты анализа представлены в таблице 2.

Техническим результатом изобретения также является расширение арсенала средств, способных эффективно доставлять НК в клетки и подавлению экспрессирующегося в клетках опухоли гена β-галактозид-связывающего лектина (LGALS9), как в монорежиме, так и при лечении анти-PD-L1-моноклональными антителами.

Технический результат достигается предлагаемыми композициями, которые содержат:

1) поликатионный амфифил 2X3 в качестве компонента, связывающего и упаковывающего нуклеиновую кислоту;

2) цвиттер-ионный фосфолипид (DOPE) в качестве структурообразующих и промотирующих компонентов.

При этом катионный липид и фосфолипид DOPE взяты в мольном соотношении 1:2.

Поликатионный липид имеет следующий состав:

1,26-бис(холест-5-ен-3β-илоксикарбониламино)-7,11,16-2-тетраазагексакозан тетрагидрохлорида (2X3)

Технический результат также достигается способом получения композиции для доставки малых интерферирующих РНК, характеризующимся тем, что липидную пленку, состоящую из поликатионного липида 2X3 и нейтрального фосфолипида DOPE, гидратируют в воде и полученную эмульсионно-дисперсионную систему подвергают ультразвуковой обработке или экструзии.

Ранее было показано, что высокие концентрации липидной дисперсии способствуют усилению цитотоксического эффекта, поэтому в последующих экспериментах использовалось соотношение по заряду между дуплексом и липидом 1:4.

Липосомы получали различными способами. В зависимости от используемого метода получают липосомы разного размера и с различающимися характеристиками. Размер липосом важен с точки зрения их применения.

Липосомы получали: ультразвуковой (УЗ) обработкой и экструзией. Первый способ включал в себя УЗ обработку липидной дисперсии, полученной в результате гидратации липидной пленки, второй способ - продавливание (экструзию) липидной дисперсии через поликарбонатные фильтры с размером пор 100 нм. С помощью метода динамического лазерного светорассеяния были определены размеры катионных липосом. Было показано, липосомы полученные с использованием УЗ имели средний размер 85±1 нм, в то время как липосомы полученные экструзией - 154±2 нм. Поэтому способ получения липосом с использованием УЗ был выбран в качестве приоритетного.

Оценку цитотоксичности субстанции провели с использованием МТТ теста. При использовании диапазона концентраций от 25 нМ до 600 нМ цитотоксический эффект обеспечивающий гибель 50% популяции клеток не был достигнут.Использование более высоких концентраций препарата на культуре клеток in vitro не представляется возможным по техническим причинам.

Полученная композиция была оценена на предмет функциональной активности.

Достоверность различий между показателями в независимых группах оценивали с применением t-критерия Стьюдента.

Для оптимизации условий загрузки и размеров получаемых комплексов было предложено использовать полисорбат 80, что позволило получить суспензию с наименьшим разбросом частиц по размеру. Данный принцип применен впервые при загрузке катионных липосом короткими (21 н.о.) двуцепочечными молекулами РНК. Частицы желаемого размера, со средним кумулятивным диаметром 102,1±19,3 нм и индексом полидисперсности 0,19, были получены при концентрации полисорбата 0,05%.

На заключительном этапе разработан состав препарата для проведения последующих испытаний (фиг. 3). Препарат содержит: дуплекс к тещ LGALS9 в количестве 1,74 мкМ, катионные липосомы 2X3: 2DOPE 73,0 мкМ, хлорид натрия 15,4 мМ, полисорбата 80 0,25%. Полученное соотношение компонентов препарата получили на основе серии специальных экспериментов с использованием стандартного флуоресцентного дуплекса «BLOCK-iT», позволяющему на основании результатов проточной цитометрии оценить эффективность связывания получаемых липоплексов (липосом загруженных дуплексом) с клеточной мембраной в условиях in vitro. А также, в серии специальных экспериментов по оценке эффективности РНК интерференции при использовании различных концентраций препарата по дуплексу. Оценивался диапазон концентраций от 10 до 50 нМ. Кроме того, с помощью метода динамического лазерного светорассеяния были определены размеры получаемых частиц, которые находились в интервале105,8±17,9 нм, что соответствует требованиям.

Способ применения композиции (фиг. 4) в качестве таргетного иммуностимулятора при анти-PD-L1 терапии включал в себя использование заявленного препарата для усиления Т-клеточного иммунного ответа путем блокирования функции гена LGALS9 в клетках злокачественных опухолей, полученного на основе описанной композиции с добавлением препарата авелумаб (анти-PD-L1), вносимого через 24 часа после трансфекции в среду для культивирования из расчета, что конечная концентрация антител составляет 15 мкг/мл (пример 3 и пример 4).

Действие авелумаба направлено против лиганда программируемой клеточной смерти 1 (PD-L1). Авелумаб непосредственно связывается с PD-L1 и блокирует его взаимодействие с рецепторами PD-1. Таким образом, авелумаб устраняет подавляющие эффекты PD-L1 в отношении цитотоксических Т-лимфоцитов CD8+, что приводит к восстановлению противоопухолевого Т-клеточного ответа. Авелумаб индуцирует опосредуемый натуральными клетками киллерами прямой лизис клетки опухоли с помощью активации антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности. С рецепторами PD-1 также связывается и Gal-9 (LGALS9), эффект тот же, что и при PD-L1. Возможность совместного применения препарата авелумаб на основе человеческого моноклонального антитела IgG1 и препарата на основе РНК интерференции обсуждается впервые.

Примеры осуществления. Для подтверждения эффективности разработанной композиции прототипа лекарственного средства была проведена серия специальных экспериментов с использованием клинического материала. Все исследования проведены в соответствии с Хельсинкской декларацией и одобрены Комитетом по биомедицинской этике ФТБНУ «Медико-генетический научный центр имени академика Н.П. Бочкова». Все пациенты подписали информированное согласие.

Пример 1. Оценка эффективности подавления экспрессии гена LGALS9 в первичной культуре клеток рака почки. Первичную культуру опухолевой ткани почки получали в стандартных стерильных условиях клеточного бокса, общепринятым методом с использованием коллагеназы из биологического материала, полученного в ходе хирургического лечения. Клетки культивировали в ростовой среде RPMI-1640, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS), добавки: 1% инсулин-трансферрин-селенит, EGF 5 нг/мкл и 1% пенициллин/стрептомицин. Перед трансфекцией клетки первичной культуры высевали в 24-ти луночные плашки (концентрации 4,0*10⁴ клеток в 1 мл среды) за 24 часа до обработки. Перед внесением препарата питательную среду с 10% сывороткой заменяли на ту же среду с 1% сывороткой без антибиотиков. В каждую лунку вносили 15 пикомоль дуплекса, загруженного на липосомальный вектор. Эффективность РНК-интерференции оценивали через 24 часа по изменению относительного числа копий РНК в клетке, методом количественной полимеразной цепной реакции. В качестве контролей сравнения использовали те же клетки без обработки тестируемым препаратом и клетки, обработанные липоплексами, загруженными случайными (non-targeting) миРНК CON1 (стандартный отрицательный контроль). Результаты эксперимента представлены на фиг. 5. Таким образом, разработанный композиционный состав эффективно подавляет экспрессию гена. LGALS9 в клетках опухоли почки.

Пример 2. Активация антиген-опосредованного цитолиза клеток первичной опухоли почки в результате одновременного подавление экспрессии генов CD274 и LGALS9. Клетки первичного рака почки получали и культивировали так, как это изложено в примере 1. Дополнительно, из периферической крови того же пациента, полученной, в ходе рутинной подготовки к хирургическому лечению, получали фракцию Т-клеток. Для этого использовали набор «EasySep™ Human Т Cell Isolation Kit», STEMCELL Technologies, США, в строгом соответствии с рекомендациями производителя. Обработку клеток опухоли двумя тестируемыми препаратами проводили так, как это изложено в примере 1. Т-клетки вносили в среду через 24 часа после обработки липоплексами. Оценку цитотоксического эффекта проводили с использованием биосенсорной технологии RTCA xCELLigence (ACEA Biosciences). Анализировали изменения показателя «клеточный индекс» с течением времени. Регистрацию сигнала и статистическую обработку данных осуществляли при помощи пакета программ RTCA Software Lite version 2.2.5. Полученные результаты представлены на фиг 6. В качестве контроля сравнения использовали: необработанные клетки опухоли, клетки опухоли, обработанные двумя липоплексами, содержащими миРНК к генам CD274 и LGALS9 и контроль совместного культивирования Т-клеток и клеток опухоли без внесения липоплексов. Таким образом, двойное подавление экспрессии генов CD274 и LGALS9 способствовало активации антиген-опосредованного цитолиза опухолевых клеток, что проявляется в изменении пролиферативных свойств тестируемой популяции клеток опухоли.

Пример 3. Изменение числа клеток первичной опухоли в результате активация антиген-опосредованного цитолиза, активированного в результате комбинированного действия препаратов на основе антител (анти PD-L1) и миРНК (к мРНК гена LGALS9). Клетки первичного рака почки получали и культивировали так, как это изложено в примере 1. Фракцию Т-клеток периферической крови получали с использованием набора «EasySep™ Human Т Cell Isolation Kit», STEMCELL Technologies, США, в строгом соответствии с рекомендациями производителя. Перед трансфекцией клетки первичной культуры высевали в 24-ти луночные планшеты (концентрации 4,0*10⁴ клеток в 1 мл среды) за 24 часа до обработки. Перед внесением препарата, питательную среду с 10% сывороткой заменяли на ту же среду с 1% сывороткой без антибиотиков. В каждую лунку вносили 15 пикомоль дуплекса, загруженного на липосомальный вектор. Через 24 часа питательную среду сменяли на среду с содержанием 10% сыворотки и 15 мкг/мл препарата авелумаб (анти-PD-L1) и вносили активированные Т-клетки. Мониторинг изменения количества клеток опухоли в ходе культивирования проводили с использованием проточной цитометрии. В качестве маркера использовали антитела к цитокератину 7, 8 меченные FITC (Ex/Em=495/519 нм). Измерения проводили через 24 часа после внесения Т-клеток в культуру. В качестве контроля сравнения использовали популяцию клеток, обработанную липоплексами, загруженными случайным набором миРНК CON1. Результаты исследования представлены на фиг. 7. Достоверность различий между показателями в независимых группах оценивали с применением t-критерия Стьюдента (р<0,01). Таким образом, действие авелумаба (анти-PD-L1) может быть усилено за счет обработки клеток опухоли почки тестируемым средством.

Пример 4. Активация антиген-опосредованного цитолиза клеток первичной опухоли в результате подавление экспрессии гена LGALS9 в присутствии препарата авелумаб. Клетки первичного рака почки получали и культивировали так, как это изложено в примере 1. Дополнительно, из периферической крови того же пациента, полученной, в ходе рутинной подготовки к хирургическому лечению, получали фракцию Т-клеток. Фракцию Т-клеток периферической крови получали из мононуклеарных клеток с использованием стандартного набора «EasySep™ Human Т Cell Isolation Kit», STEMCELL Technologies, США, в строгом соответствии с рекомендациями производителя. Активацию проводили при помощи антител к CD3 (functional grade, Cat. No. 16-0037-81) и CD28 (functional grade, Cat. No. 16-00289-81) компании Invitrogen. Вкратце, в 12-ти луночный планшет вносили антитела к CD3 (1 мкг/мл) в стерильном PBS, инкубировали при 37°С в течение 2 часов. Затем из лунок удаляли раствор и вносили суспензию Т-клеток в среде RPMI-1640, содержащей 10% FBS, 2 мМ L-глутамина, 1% пенициллина/стрептомицина и антитела к CD28 (5 мкг/мл). Инкубировали клетки в течение 72-х часов. Перед трансфекцией клетки первичной культуры высевали в 16-ти луночные плашки (концентрации 4,0*10⁴ клеток в 1 мл среды) за 24 часа до обработки. Перед внесением препарата, питательную среду с 10% сывороткой заменяли на ту же среду с 1% сывороткой без антибиотиков. В каждую лунку вносили 5 пикомоль дуплекса, загруженного на липосомальный вектор. Через 24 часа питательную среду сменяли на среду с содержанием 10% сыворотки и 15 мкг/мл препарата авелумаб (анти-PD-L1) и вносили активированные Т-клетки. Оценку цитотоксического эффекта проводили с использованием биосенсорной технологии RTCA xCELLigence (ACEA Biosciences). Анализировали изменения показателя «клеточный индекс» с течением времени. Регистрацию сигнала и статистическую обработку данных осуществляли при помощи пакета программ RTCA Software Lite version 2.2.5. Полученные результаты представлены на фиг. 8.

В качестве контроля сравнения использовали: необработанные клетки опухоли, контроль липоплексов со случайным набором миРНК CON1, контроль токсичности липоплексов с миGal9 и контроль совместного культивирования активированных Т-клеток и клеток опухоли без внесения липоплексов. Таким образом, цитотоксическое действие авелумаба (анти-PD-L1) может быть усилено за счет обработки клеток опухоли почки тестируемым средством (образцы 5, 6, 7).

Группа изобретений относится к области фармацевтики и медицины. 1 объект представляет собой композицию для усиления Т-клеточного иммунного ответа путем блокирования функции гена LGALS9 в клетках рака почки, содержащую средство для доставки коротких интерферирующих РНК (миРНК) в клетки-мишени, представляющее собой липосомы 1,26-бис(холест-5-ен-3β-илоксикарбониламино)-7,11,16-2-тетраазагексакозан тетрагидрохлорид (2X3):1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин (DOPE) в мольном соотношении 1:2, и дуплекс к гену LGALS9, образованный двумя олигонуклеотидами и содержащий нуклеотидные последовательности коротких интерферирующих РНК. 2 объект – соответствующий препарат на основе вышеуказанной композиции, характеризующийся тем, что он содержит дуплекс к гену LGALS9, катионные липосомы 2Х3:DOPE в мольном соотношении 1:2, хлорид натрия и полисорбат 80. 3 объект – применение композиции для усиления Т-клеточного иммунного ответа при терапии авелумабом. Технический результат заключается в усилении Т-клеточного иммунного ответа в результате увеличения числа эффективных Т-клеток, способных инициировать разрушение клеток опухоли, а также доставке нуклеиновых кислот в клетки и подавлении экспрессирующегося в клетках опухоли гена LGALS9 как в монорежиме, так и при лечении авелумабом. 3 н. и 3 з.п. ф-лы, 8 ил., 2 табл., 4 пр.

1. Композиция для усиления Т-клеточного иммунного ответа путем блокирования функции гена LGALS9 в клетках рака почки, содержащая средство для доставки коротких интерферирующих РНК (миРНК) в клетки-мишени, представляющее собой липосомы 1,26-бис(холест-5-ен-3β-илоксикарбониламино)-7,11,16-2-тетраазагексакозан тетрагидрохлорид (2X3):1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин (DOPE) в мольном соотношении 1:2, и дуплекс к гену LGALS9, образованный двумя олигонуклеотидами и содержащий нуклеотидные последовательности коротких интерферирующих РНК:

5’-G-G-A-U-C-U-U-G-U-G-U-G-A-A-G-C-U-C-A-dT-dT-3’ в качестве прямой цепи

и

5’-U-G-A-G-C-U-U-C-A-C-A-C-A-A-G-A-U-C-C-dT-dT-3’ в качестве обратной цепи,

где G, С, A, U - рибонуклеотиды;

dT - 2'-дезокситимидин-3'-фосфат.

2. Композиция по п. 1, отличающаяся тем, что в качестве средства для доставки миРНК в клетки-мишени она содержит липосомы, содержащие 2X3 в качестве компонента, связывающего и упаковывающего нуклеиновую кислоту, и DOPE в качестве структурообразующего и промотирующего компонента, при соотношении дуплекс:липосомы по заряду P/N от 1:2 до 1:8.

3. Композиция по п. 2, отличающаяся тем, что средство для доставки миРНК в клетки-мишени выполнено в форме липидной пленки, состоящей из 2X3 и DOPE, гидратированных в воде с получением эмульсионно-дисперсионной системы, подвергнутой ультразвуковой обработке или экструзии.

4. Композиция по п. 3, отличающаяся тем, что средство для доставки миРНК в клетки-мишени получено с использованием полиоксиэтилен(20)-сорбитанмоноолеата (полисорбата 80).

5. Препарат для усиления Т-клеточного иммунного ответа путем блокирования функции гена LGALS9 в клетках рака почки на основе композиции по любому из пп. 1-3, характеризующийся тем, что он содержит дуплекс к гену LGALS9 в количестве 1,74 мкМ, катионные липосомы 2Х3:DOPE в мольном соотношении 1:2 – 73,0 мкМ, хлорид натрия – 15,4 мМ, полисорбат 80 – 0,25%.

6. Применение композиции по любому из пп. 1-3 для усиления Т-клеточного иммунного ответа при терапии авелумабом.