СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФЕРМЕНТОЛИЗАТА БИОМАССЫ МЕТАНОКИСЛЯЮЩИХ БАКТЕРИЙ Российский патент 2025 года по МПК C12N1/00 C12N9/00 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в промышленности для получения кормовых добавок и биологически активных добавок к пище, содержащих белок, биологически активные пептиды, аминокислоты, нуклеотиды, витамины и микроэлементы.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Биомасса метанокисляющих бактерий используется как источник белка для кормления животных, а также может быть использована для получения биологически активных добавок к пище в рационах спортивного и специализированного питания человека.

Биологическая ценность биомассы метанокисляющих бактерий обусловлена, в первую очередь, высоким содержанием белка (около 70% от сухой массы), незаменимых аминокислот, а также нуклеиновых кислот, витаминов группы B и микроэлементов. Тем не менее, эффективное использование биомассы метанокисляющих бактерий затруднено по следующим причинам:

1) Прочная клеточная стенка метанокисляющих бактерий содержит трудно перевариваемый пептидогликан (муреин), что затрудняет доступность и усвоение внутриклеточных веществ.

2) Биомасса метанокисляющих бактерий содержит минимальные количества свободных аминокислот, короткоцепочечных биологически активных пептидов и олигонуклеотидов, выполняющих не только структурную, но и регуляторную функцию в организме.

Для повышения биодоступности питательных веществ биомассы метанокисляющих бактерий в настоящее время используют процесс ферментативного гидролиза (ферментолиза), в котором к биомассе добавляют богатые ферментами компоненты (ферментные препараты).

Известен способ получения ферментолизатов бактерий Methylococcus capsulatus, характеризующийся тем, что суспензию бактерий Methylococcus capsulatus помещают в реактор и добавляют ферментный препарат, в качестве которого используют протосубтилин в количестве 4500-6000 единиц активности на 1 кг абсолютно сухой биомассы бактерий, при этом процесс ферментативного гидролиза ведут при температуре от 55°C до 60°C в течение 2 часов (патент RU 700079 C1, A23J 3/20, опубликован 12.09.2019). Как указано в этом документе, способ обеспечивает расщепление клеточной стенки бактерий, в результате чего повышается доступность внутриклеточных веществ, а именно белков, пептидов, аминокислот, витаминов, и повышается выход водорастворимых веществ до 80 масс.%.

Известен способ получения ферментативных гидролизатов бактерий Methylococcus capsulatus, включающий ферментативный гидролиз суспензии бактерий Methylococcus capsulatus в присутствии протосубтилина совместно с липазой, при этом протосубтилин используют в количестве 1500-2000 единиц активности на 1 кг абсолютно сухой биомассы бактерий, а липазу – в количестве 5000-6000 единиц активности на 1 кг абсолютно сухой биомассы бактерий. Процесс ферментативного гидролиза осуществляют при температуре от 37°C до 45°С и pH от 6,0 до 6,5 в течение 1 часа (патент RU 2769286 C1, A23J 3/20, опубликован 30.03.2022). Как указано в этом документе, способ обеспечивает повышение эффективности ферментативного гидролиза бактерий Methylococcus capsulatus за счет разжижения липидного слоя внешней мембранной оболочки бактерий, а также за счет снижения затрат на нагрев и термостатирование культуры на стадии гидролиза.

Известен также способ получения микробного протеина (белка) из микробной биомассы продуцента метанокисляющих бактерий ферментативным методом (патент RU 2781287 C1, A23J 3/20, опубликован 11.10.2022), включающий ряд следующих этапов. На первом этапе получают концентрат денуклеинизированной биомассы из нативной биомассы в виде суспензии метанокисляющих бактерий с содержанием сухого вещества (СВ) 10-12%, рН которой доводят до 3,0-3,5 серной кислотой, имеющей концентрацию от 45% до 50%. Суспензию нагревают, доводят до рН от 8,5 до 9,5 добавлением щелочного раствора, выдерживают при температуре от 85°С до 95°С до получения щелочного экстракта, фильтруют под давлением и промывают осмотической водой для удаления нуклеиновых компонентов с получением концентрата денуклеинизированной биомассы (ДНБМ). На втором этапе осуществляют гидролиз комплексным ферментным препаратом, включающим амилазы, липазы и протеазы из расчета 7000 ед. по амилазе комплексного ферментного препарата на 30-35 г сухого вещества концентрата. На третьем этапе проводят инактивацию полученной суспензии путем повышения температуры с последующей фильтрацией и высушиванием концентрата и фильтрата до получения порошкообразного продукта с содержанием белка не менее 88%. Этот сложный многостадийный процесс направлен на получение специфического высокобелкового продукта с минимальным содержанием других необходимых организму питательных веществ, таких как биологически активные пептиды, аминокислоты, нуклеотиды, витамины и микроэлементы.

Недостатком известных способов является использование дорогостоящих бактериальных препаратов. Применяемые препараты бактериальных протеаз содержат смеси ферментов, однако условия оптимальной активности каждого из их компонентов очень сильно различаются. Нейтральная протеаза протосубтилина наиболее активна при рН, равном от 5,5 до 6,5, а щелочная сериновая протеаза того же препарата – при рН от 9,2 до 11,0, поэтому в ходе технологического процесса трудно реализовать протеолитический потенциал каждого из ферментных компонентов подобной смеси. Ферментный препарат протосубтилин содержит только щелочные и нейтральные протеиназы, что не позволяет провести высокоэффективный гидролиз содержащегося в бактериальных клетках белка. Добавление к протосубтилину липазы не изменяет содержания протеаз, но позволяет увеличить степень гидролиза за счет частичного разрушения липидной оболочки клетки и увеличения доступного для протеаз белка. Используемые препараты высокоселективны, но не способны обеспечить высокую степень расщепления белкового субстрата, необходимую для получения значительного количества короткоцепочечных пептидов в конечном продукте. Ни один из известных способов не обеспечивает гидролиза нуклеиновых кислот и, как следствие – повышения возможности их усвоения.

Определения

Если не указано иное, все термины, используемые при описании изобретения, включая технические и научные термины, имеют значения, обычно известные специалистам в области техники, к которой относится настоящее изобретение.

Употребление в настоящей работе формы единственного числа относится как к единственному, так и множественному числам, если из контекста не следует иное.

Употребляемые в настоящей работе термины «включает», «включают», «включающий» являются синонимами терминов «содержит», «содержат», «содержащий» и имеют неисключающее или допускающее изменения значение, которое указывает на присутствие перечисленных далее объектов, например, этапов, операций, компонентов, и не исключает или не предотвращает присутствия дополнительных, не названных этапов, операций, компонентов, признаков, элементов, известных в данной области техники или описанных в настоящей работе.

Если не указано иное, употребляемый в настоящем описании термин «масс.%» (массовый процент) относится к относительной массе соответствующего компонента в пересчете на общую массу композиции или соответствующего элемента композиции.

Указание числовых диапазонов в виде граничных значений включает все числа и дробные величины, заключенные внутри диапазона, а также указанные граничные значения, если явно не указано или иным образом не обозначено иное.

При использовании в настоящей работе термин «и/или» относится к любым возможным комбинациям и охватывает любые возможные комбинации одного или более соответствующих указанных элементов, а также отсутствие комбинаций при интерпретации в альтернативной форме («или»).

В контексте настоящего изобретения термины «ферментативный гидролиз» и «ферментолиз» используются взаимозаменяемо.

В контексте настоящего изобретения термин «ферментолизат» означает продукт ферментативного гидролиза субстрата микробного происхождения.

В контексте настоящего изобретения термины «метанокисляющие бактерии», «метанотрофные бактерии», «метанутилизирующие бактерии», «метанфиксирующие бактерии» являются взаимозаменяемыми и обозначают группу бактерий, способную использовать метан в качестве единственного источника как углерода, так и энергии.

В контексте настоящего изобретения термины «поджелудочная железа», «фермент поджелудочной железы», «ферментный препарат поджелудочной железы», «панкреатин» и «препарат панкреатина» используются взаимозаменяемо и относятся к любому из типов ферментов, присутствующих в секрете поджелудочной железы, или к их смеси, или к любому экстракту, имеющему происхождение от поджелудочной железы и включающее панкреатические ферменты, как более подробно описано ниже.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Задачей предлагаемого изобретения является разработка способа, обеспечивающего эффективный гидролиз белков, нуклеиновых кислот и липидов, содержащихся в клетках метанокисляющих бактерий с получением в конечном продукте максимального количества короткоцепочечных пептидов с молекулярной массой до 1000 Да.

Техническим результатом, на достижение которого направлено предлагаемое изобретение, является повышение эффективности ферментативного гидролиза биомассы метанокисляющих бактерий за счет применения ферментного препарата, полученного из поджелудочной железы, и/или панкреатина, с получением ферментолизата с максимальным содержанием короткоцепочечных пептидов молекулярной массой до 1000 Да. Предложенный способ получения ферментолизата биомассы метанокисляющих бактерий предусматривает решение проблем, препятствующих эффективному перевариванию, усвоению и обеспечению физиологического действия ее ценных нутриентов.

Способ согласно изобретению включает ферментативный гидролиз биомассы метанокисляющих бактерий ферментным препаратом, который представляет собой ферментный препарат, полученный из поджелудочной железы, и/или панкреатин, полученные от крупного рогатого скота или свиней.

Поджелудочная железа и получаемый из неё панкреатин представляют собой комплексный ферментный препарат, содержащий протеолитические ферменты (трипсин, хемотрипсин, карбоксипептидазы, эластазу, аминопептидазу, коллагеназу, дипептидазу), нуклеолитические ферменты (нуклеазы – ДНКазу и РНКазу), амилолитические ферменты (амилазу, мальтазу, лактазу, инвертазу) и липолитические ферменты (липазу, фосфолипазу, холинэстеразу, карбоксиэстеразу, моноглицеридлипазу, щелочную фосфатазу).

Панкреатин является ферментной системой, включающей несколько протеолитических ферментов различной селективности, которые способны функционировать одновременно, при одних и тех же условиях и параметрах среды. Панкреатин менее селективен, чем отдельные бактериальные ферменты или их комплексы, но способен к гораздо более глубокому расщеплению белкового субстрата. Панкреатин содержит несколько эндопротеаз с довольно обширным перечнем гидролизуемых ими аминокислотных пар. Одна из протеаз панкреатина – трипсин – гидролизует связи между остатками лизина и аргинина. Другая протеаза – химотрипсин – разрушает пептидные связи многих аминокислот: тирозина, фенилаланина, триптофана, лейцина, метионина, аспарагиновой и глутаминовой кислот. Таким образом, две основные эндопротеазы панкреатина при рН, составляющем от 7 до 8, способны разрушить более половины всех пептидных связей белка. Панкреатин включает и другие протеолитические ферменты: эластазы, которые расщепляют связи, образованные алифатическими аминокислотами, и карбоксипептидазы, которые отщепляют фрагменты нескольких мономерных аминокислот с С-конца пептидной последовательности. По этой причине препараты панкреатина, в отличие от препаратов бактериальных протеаз, позволяют получить ферментолизаты с высокой степенью расщепления – с максимальным содержанием ди-, три- и тетрапептидов в конечном продукте. Содержащиеся в панкреатине непротеолитические ферменты обеспечивают гидролиз нуклеиновых кислот до моно- и олигонуклеотидов, а гидролиз фосфолипидов, гликолипидов и липидов – до жирных кислот, глицерина и углеводного остатка, что в целом позволяет увеличить эффективность усваивания клеточных компонентов метанокисляющих бактерий организмом и уменьшить нагрузку на пищеварительную систему (А.В. Ариповский, В.Н. Титов. «Биологически активные пептиды в регуляции метаболизма: олигопептиды, пептоны, инсулин и артериальное давление». Клиническая лабораторная диагностика. 2019, т. 64, с.14.).

Согласно настоящему изобретению способ получения ферментолизата биомассы метанокисляющих бактерий включает следующие этапы:

- добавление ферментного препарата к суспензии метанокисляющих бактерий;

- осуществление ферментативного гидролиза суспензии биомассы метанокисляющих бактерий ферментным препаратом; и

- распылительную сушку полученного продукта,

причем ферментный препарат представляет собой поджелудочную железу или панкреатин, полученные от крупного рогатого скота или свиней, в количестве от 5000 до 7000 единиц протеолитической активности на 1 кг абсолютно сухого вещества биомассы бактерий, и

процесс ферментативного гидролиза осуществляют при рН от 7 до 9 и температуре от 45°С до 55°С при постоянном перемешивании в течение периода времени от 4 до 12 часов.

Для обеспечения более длительного срока хранения предпочтительно способ дополнительно включает этап термической инактивации ферментов, осуществляемый для остановки процесса ферментативного гидролиза перед этапом распылительной сушки. При этом ферментативный гидролиз предпочтительно останавливают путем инактивации ферментов в биомассе нагреванием до температуры от 85°С до 95°С в течение периода времени от 15 до 20 минут. Если инактивация не осуществляется, то после высушивания в высушенном продукте сохраняется остаточная активность ферментов, что может способствовать более глубокому расщеплению компонентов биомассы и еще большему повышению их усвояемости. Однако при использовании в составе кормов в этом случае увеличивается риск повышенной бактериальной обсемененности корма.

Ферментный препарат предпочтительно добавляют в виде измельчённой поджелудочной железы или панкреатина (который обычно поставляется в виде порошка), суспендированных в воде.

Ферментный препарат может быть добавлен либо единовременно в начале гидролиза, либо равными порциями через одинаковые промежутки времени в течение процесса ферментативного гидролиза.

За счет широкого спектра ферментов, входящих в состав поджелудочной железы и/или панкреатина, способ согласно изобретению позволяет осуществлять ферментативный гидролиз различных метанокисляющих бактерий, в частности, бактерии рода Methylocystis (таких как Methylocystis echinoides, Methylocystis rosea, Methylocystis parvus), рода Methylosinus (таких как Methylosinus trichosporium, Methylosinus sporium), рода Methylomonas (таких как Methylomonas methanica), рода Methylobacter, рода Methylocaldum, рода Methylotuvimicrobium (таких как Methylomicrobium buryatense 5G, Methylotuvimicrobium alkaliphilum 20Z), и рода Methylococcus (таких как Methylococcus capsulatus), с получением продукта, содержащего компоненты, обладающие высокой биологической доступностью, что позволяет использовать их для получения эффективных кормовых добавок и биологически активных добавок к пище.

При этом способ является простым, не требующим использования сложного оборудования, дорогостоящих или токсичных реагентов.

Еще одним объектом изобретения является продукт, полученный описанным выше способом, а именно, ферментолизат биомассы метанокисляющих бактерий. Благодаря описанным выше преимуществам способа, согласно изобретению, получаемый продукт обладает высоким содержанием олигопептидов (короткоцепочечных пептидов) с молекулярной массой от 150 до 1000 Да. Их содержание может составлять 48% и более от общего количества пептидов с молекулярной массой до 5000 Да. Такое высокое содержание олигопептидов не могло быть получено способами предшествующего уровня техники в силу описанных выше недостатков и особенностей этих способов.

Продукт согласно изобретению может быть использован для получения кормовых добавок и биологически активных добавок к пище. Указанные добавки могут быть изготовлены обычными способами, известными специалистам в данной области.

Далее изобретение описано со ссылками на иллюстративные примеры, демонстрирующие осуществление изобретения, но не предназначенные для ограничения заявленного объема изобретения, определенного в прилагаемой формуле изобретения.

СВЕДЕНИЯ, ПОДТВЕРЖДАЮЩИЕ ВОЗМОЖНОСТЬ
ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Пример 1

Способ согласно изобретению осуществляли следующим образом.

В реактор с возможностью контроля рН и температуры при перемешивании загружали суспензию метанокисляющих бактерий и измельченную поджелудочную железу или панкреатин крупного рогатого скота или свиней, суспендированные в воде, в соотношении от 5000 до 7000 единиц протеолитической активности поджелудочной железы или панкреатина на 1 кг абсолютной сухого вещества (АСВ) биомассы метанокисляющих бактерий, доводили рН до 7-9 и инкубировали при постоянном перемешивании при температуре от 45°С до 55°С в течение промежутка времени от 4 до 12 часов.

Добавление к биомассе метанокисляющих бактерий поджелудочной железы или панкреатина крупного рогатого скота или свиней проводили единовременно в начале гидролиза или порциями в течение всего процесса.

Ферментативный гидролиз бактериальной биомассы на первом этапе сопровождался увеличением вязкости, которая затем уменьшалась, и снижением рН в течение всего времени гидролиза.

Гидролиз останавливали, инактивируя ферменты путем нагревания смеси до температуры в диапазоне от 85°С до 95°С в течение 15-20 минут и направляли на распылительную сушку.

Ряд конкретных примеров получения ферментолизата приведен ниже.

Пример 2

Суспензию биомассы метанокисляющих бактерий с массовой долей абсолютно сухого вещества 25% объемом 20 л в слабощелочной среде при рН 7,5-8,5 поместили в термостатируемый реактор, добавили панкреатин в количестве 5000 единиц протеолитической активности на 1 кг АСВ биомассы метанокисляющих бактерий. Процесс ферментативного гидролиза проводили 8 часов при температуре 55°С. Ферментативный гидролиз остановили, биомассу инактивировали нагреванием (85-95°С в течение 15-20 минут). Ферментолизат высушили в распылительной сушилке. Получили 4,3 кг ферментолизата со следующими показателями:

- α - степень расщепления белка – 0,21,

- доля короткоцепочечных пептидов с молекулярной массой от 150 Да до 1000 Да – 31% от суммы пептидов с молекулярной массой до 5000 Да.

Пример 3

Ферментативный гидролиз проводили при температуре 55°С и рН 7,5-8,5 в течение 8 часов, как описано в Примере 2. В качестве ферментного препарата использовали панкреатин в количестве 6000 единиц протеолитической активности на 1 кг АСВ биомассы метанокисляющих бактерий. Ферментативный гидролиз остановили, биомассу инактивировали нагреванием (85-95°С в течение 15-20 минут). Ферментолизат высушили в распылительной сушилке. Получили 4,25 кг ферментолизата со следующими показателями:

- α - степень расщепления белка – 0,36,

- доля короткоцепочечных пептидов с молекулярной массой от 150 Да до 1000 Да – 37,1% от суммы пептидов с молекулярной массой до 5000 Да.

Пример 4

Ферментативный гидролиз проводили при температуре 55°С и рН 7,5-8,5 в течение 8 часов, как описано в Примере 2. В качестве ферментного препарата использовали панкреатин в количестве 7000 единиц протеолитической активности на 1 кг АСВ биомассы метанокисляющих бактерий. Ферментативный гидролиз остановили, биомассу инактивировали нагреванием (85-95°С в течение 15-20 минут). Ферментолизат высушили в распылительной сушилке. Получили 4,18 кг. ферментолизата со следующими показателями:

- α - степень расщепления белка – 0,39,

- доля короткоцепочечных пептидов с молекулярной массой от 150 Да до 1000 Да – 47,4% от суммы пептидов с молекулярной массой до 5000 Да.

Аналогичным образом получили продукт при использовании различных параметров способа согласно настоящему изобретению. Параметры процесса ферментативного гидролиза биомассы метанокисляющих бактерий и характеристики полученных продуктов приведены в Таблице 1, где α – степень расщепления белка, представляющая собой отношение числа расщепленных пептидных связей к общему числу всех пептидных связей субстрата.

Таблица 1

Количество поджелудочной железы/панкреатина (единиц протеолитической активности) на 1 кг абсолютно сухого вещества биомассы метанокисляющих бактерий Продолжи-тельность
фермента-тивного гидролиза (час) α - степень расще-пления белка Пептидный состав
(% от суммы пептидов) Молекулярная масса, Да ˃1000 от 150 до 1000 ˂150 (свободные амино-кислоты) 5000 4 0,13 52,0 26,5 21,5 8 0,21 41,6 31,0 27,4 12 0,38 33,8 36,4 29,8 6000 4 0,23 40,2 35,2 24,6 8 0,36 35,9 37,1 27,0 12 0,48 25,4 43,4 31,3 7000 4 0,25 29,4 42,0 28,6 8 0,39 20,6 47,4 32,0 12 0,56 18,7 48,2 33,1

Из полученных результатов видно, что способ согласно изобретению обеспечивает получение продукта с высоким содержанием короткоцепочечных пептидов с молекулярной массой до 1000 Да, обладающих высокой биологической доступностью, что позволяет увеличить эффективность усваивания клеточных компонентов метанокисляющих бактерий организмом и уменьшить нагрузку на пищеварительную систему.

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способу получения ферментолизата биомассы метанокисляющих бактерий, включающему ферментативный гидролиз суспензии бактерий с использованием ферментного препарата, представляющего собой ферментный препарат, полученный из поджелудочной железы, и/или панкреатин, полученные от крупного рогатого скота или свиней, в количестве от 5000 до 7000 единиц протеолитической активности на 1 кг абсолютно сухого вещества бактерий при рН от 7 до 8,5, температуре от 45 до 55°С в течение периода времени от 4 до 12 часов. Изобретение также относится к продукту, получаемому указанным способом. Изобретение позволяет получать продукт с высоким содержанием короткоцепочечных пептидов с молекулярной массой от 150 до 1000 Да, который может быть эффективно использован для получения кормовых добавок и биологически активных добавок к пище. 2 н. и 5 з.п. ф-лы, 1 табл., 4 пр.

1. Способ получения ферментолизата биомассы метанокисляющих бактерий, включающий:

- добавление ферментного препарата к суспензии метанокисляющих бактерий;

- осуществление ферментативного гидролиза суспензии биомассы метанокисляющих бактерий ферментным препаратом; и

- распылительную сушку полученного продукта,

отличающийся тем, что

ферментный препарат представляет собой ферментный препарат, полученный из поджелудочной железы, и/или панкреатин, полученные от крупного рогатого скота или свиней, в количестве от 5000 до 7000 единиц протеолитической активности на 1 кг абсолютно сухого вещества биомассы бактерий, и

процесс ферментативного гидролиза осуществляют при рН от 7 до 8,5 и температуре от 45 до 55°С при постоянном перемешивании в течение периода времени от 4 до 12 часов.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что перед этапом распылительной сушки способ дополнительно включает термическую инактивацию ферментов для остановки ферментативного гидролиза.

3. Способ по п. 2, отличающийся тем, что ферментативный гидролиз останавливают путем термической инактивации ферментов нагреванием до температуры от 85 до 95°С в течение периода времени от 15 до 20 минут.

4. Способ по любому из пп. 1, 2 или 3, отличающийся тем, что ферментный препарат добавляют в виде измельчённой поджелудочной железы или панкреатина, суспендированных в воде.

5. Способ по любому из пп. 1, 2, 3 или 4, отличающийся тем, что ферментный препарат добавляют единовременно в начале гидролиза.

6. Способ по любому из пп. 1, 2, 3 или 4, отличающийся тем, что ферментный препарат добавляют равными порциями через одинаковые промежутки времени в течение процесса ферментативного гидролиза.

7. Ферментолизат биомассы метанокисляющих бактерий для получения кормовых добавок и биологически активных добавок к пище, имеющий общее содержание свободных аминокислот и короткоцепочечных пептидов с молекулярной массой до 1000 Да, составляющее не менее 48% от суммы аминокислот и пептидов с молекулярной массой до 5000 Да, полученный способом по любому из пп. 1-6.