Способ получения микробного белка на основе углеводородного сырья Российский патент 2020 года по МПК C12N1/20 C12P21/00 

Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно: к получению микробной белковой массы из штамма метанокисляющих бактерий Methylococcus capsulatus ГБС-15, который может быть использован в сельском хозяйстве для кормления животных.

На сегодняшний день общая картина в России по производству кормовых белков не благоприятна. Дефицит кормовых продуктов составляет не менее 2 млн тонн в год.

Одним из перспективных путей получения полноценного белкового кормового продукта являются метанотрофные бактерии, продуцирующие белок. Метанотрофные бактерии в подходящих условиях активно перерабатывают природный газ, быстро размножаются и наращивают свою биомассу, богатую ценным белком, витаминами и иными биологически активными веществами.

Использование метана для получения белка одноклеточных имеет ряд преимуществ по сравнению с жидкими углеводородами: большие запасы природного газа, хорошая его транспортабельность, возможность получения готового продукта без дополнительной очистки от субстрата.

Учитывая, что в России большие газовые запасы недр, по некоторым данным, они составляют до 40% мировых. Внедрение микробиологического производства белка одноклеточных на российских предприятиях сулит не только экономический эффект, но и способно обеспечить продовольственную безопасность страны.

Известны различные штаммы бактерий, продуцирующие кормовой белок, относящиеся к различным видам метанокисляющих бактерий (метанотрофы), например, штаммы Methylococcus capsulatus ВKМ В-2116, Methylocystis parvus ВKМ В-2129, Methylosinus sporium ВKМ В-2123, Methylosinus trichosporium ВKМ В-2117, Methylomonas rubra ВСБ-901, Methylococcus sp. ЧМ-9, Methylococcus capsulatus ВСБ-874, Methylococcus minimus, Methylomonas methanica.

Они являются продуктами микробиального синтеза, получаемыми в результате культивирования метанокислящих бактерий на природном газе как единственном источнике углерода и энергии. Эти штаммы характеризуются различными скоростями роста и выходом биомассы.

К недостаткам указанных штаммов относится невысокая скорость роста и нестабильное содержание белка, которое в большинстве случаев ниже 70%, а также потребность в повышенных количествах биостимулятора, в частности автолизата, которая проявляется при выращивании штамма в асептических лабораторных условиях.

Известен штамм - продуцент биомассы Methylococcus capsulatus ВСБ-874. Хранится в музее культур института «ВНИИгенетика» под коллекционным номером ЦМПМ В-1743 (авт. свид. СССР №770200). Штамм использует в качестве источника углерода метан, как чистый, так и в составе природного газа. Недостатком данного штамма является невозможность его культивирования при возврате отработанной культуральной жидкости.

Известен штамм бактерий Cupriavidus eutrophus ВКПМ В-10646 - продуцент полигидроксиалканоатов и способ их получения (РФ №2439143). Способ заключается в культивировании штамма-продуцента в условиях аэрации и перемешивания на жидкой солевой среде, содержащей ростовой субстрат с дополнительным источником углерода, при лимите азота, с использованием в качестве штамма-продуцента штамм бактерий Cupriavidus eutrophus ВКПМ В-10646, в качестве ростового субстрата используют глюкозу или фруктозу, или 3-масляную кислоту, или газовую смесь водород, кислород и двуокись углерода, или синтез-газ в смеси с кислородом, а в качестве дополнительного источника углерода используют раствор 3-валерата калия, или растворы 3-валерата калия и 3-гексаноата калия, или растворы 3-валерата калия, 3-гексаноата калия и акрилата, или растворы 3-гексаноата калия и акрилата, или растворы 3-масляной кислоты и 4-буторолактона, или растворы 3-масляной кислоты, 4-буторолактона и 3-валерата калия, или растворы 3-масляной кислоты, 4-буторолактона и 3-гексаноата калия, или растворы 3-масляной кислоты, 4-буторолактона, 3-валерата калия и 3-гексаноата калия.

Наиболее близкий по технической сущности и достигаемому результату является способ выращивания штамма культуры Methylococcus capsulatus ГБС-15 (РФ №2613365) в непрерывном режиме в ферментере эжекционного типа объемом 40 л (рабочий объем - 25 л) с непрерывной подачей питательной среды, содержащей следующие компоненты (на 1 л среды):

Фосфорная кислота Н₃РО₄ (70%) - 0,35 мл

Хлористый калий КСl - 0,125 г

Сульфат магния MgSO₄×7H₂O - 0,105 г

Сульфат железа FeSO₄×7H₂O - 10,75 мг

Сульфат меди CuSO₄×5H₂O - 10 мг

Сульфат марганца MnSO₄×5H₂O - 9,5 мг

Борная кислота Н₃ВО₃ - 6,25 мг

Сульфат цинка ZnSO₄×7H₂O - 1,5 мг

Сульфат кобальта CoSO₄×7H₂O - 0,25 мг

Натрий молибденовокислый Na₂MoO₄×2H₂O - 0,25 мг

Процесс выращивания осуществляется при температуре 42°С и рН среды выращивания 5,6-5,8. Значение рН поддерживали 10%-ным раствором аммиачной воды. Регулирование температуры процесса осуществляется подачей охлаждающей воды в теплообменник аппарата. Расход природного газа и воздуха на 1 л культуральной среды составляли 15 и 45 л/час соответственно. Культуру выращивают при атмосферном давлении, температуре 42°С и при перепаде температур от 40° до 45°С, величине рН 5,6 и при коэффициенте скорости протока 0,25 ч^-1, концентрация биомассы в ферментере составляла 10-11 г/л. При использовании такого режима культивирования в течение длительного времени, с использованием природного газа различного состава (с содержанием метана от 85% об. до 99,9% об.) и воды из разных источников, фаголизиса культуры не наблюдалось.

Задача предлагаемого изобретения - создание способа выращивания метанокисляющего штамма культуры Methylococcus capsulatus ГБС-15, обладающего более высоким технологическим потенциалом, в частности:

- с возвратом в процесс с отработанной культуральной жидкости различного состава вместо подготовленной воды, что позволит повысить выход готового продукта, повысить продуктивность процесса ферментации, уменьшить расход солей для ферментации, снизить расход подготовленной воды, подаваемой в процесс.

Полученным техническим результатом в результате использования предлагаемого технического решения являются: повышение продуктивности процесса получения микробного белка на основе углеводородного сырья от 10 до 30%, решение проблемы очистки и полной утилизации отработанной культуральной жидкости. При этом качество получаемого продукта соответствует всем требованиям, предъявляемым к микробному белку на основе углеводородного сырья, производимом с использованием очищенной воды.

Поставленная цель достигается за счет использования способа получения микробного белка на основе углеводородного сырья из штамма метанокисляющих бактерий Methylococcus capsulatus ГБС-15, включающего приготовление питательной среды, состоящей из калия, магния, железа (II), меди, марганца, цинка, кобальта и молибдата натрия заданной концентрации с добавлением фосфорной кислоты, ферментацию бактериальных культур с постоянной подачей отработанной жидкости, раствора аммиака, и газовой смеси при температуре 40-45°С в непрерывном протоке 0,2-0,3 объема ферментера в час, сепарацию, получение готовой биомассы и ее сушки. При этом отработанную культуральную жидкость после сепарации возвращают через накопительную емкость на стадию ферментации в объеме от 10 до 95% от общего количества используемой воды, обогащают недостающими минеральными солями до заданных концентраций в культуральной жидкости, затем продолжают ферментацию бактериальной культуры до получения готового продукта.

Получение микробного белка на основе природного газа представляет ферментативный процесс на минеральной питательной среде. Процесс приготовления питательной среды состоит из нескольких стадий (см. схему процесса на рисунке 1):

- приготовление индивидуальных растворов минеральных солей заданной концентрации на подготовленной воде (сульфаты калия, магния, железа (II), меди, марганца, цинка, кобальта, борной кислоты и молибдата натрия);

- приготовление концентрированного раствора солей путем дозирования в отдельную емкость расчетного количества готовых индивидуальных растворов минеральных солей, фосфорной кислоты и подготовленной воды;

- подготовку воды осуществляют путем очистки ее от механических примесей, отдельных нежелательных компонентов и микроорганизмов.

Засев ферментера осуществляют штаммом культуры Methylococcus capsulatus ГБС-15 ассоциацией микроорганизмов, которые позволяют утилизировать органические продукты метаболизма основной культуры.

Процесс ведут в протоке (0,2-0,3 объема ферментера в час) с непрерывной подачей раствора минеральных солей и фосфорной кислоты, раствора аммиака, растворов солей кальция, натрия и газовой смеси при температуре 40-45°С.

Образующуюся в процессе ферментации суспензию сепарируют, разделяя биомассу и отработанную культуральную жидкость, состоящую из непотребленных элементов минерального питания, продуктов жизнедеятельности бактерий, таких как пептиды, аминокислоты, растворимые углеводы и др.

Разработан процесс возврата отработанной культуральной жидкости от 10 до 95% в процесс ферментации вместо воды. При этом контролируется как подача отработанной культуральной жидкости, так и подача концентрированного раствора солей для сбалансированности состава минерального питания. Кроме того, оставшаяся после сепарации живая микрофлора, состоящая как из основной культуры, так и спутников, перерабатывающих метаболиты основной культуры, позволяют повысить продуктивность процесса на 10-30%. Качество получаемого продукта соответствует всем требованиям, предъявляемым к микробному белку на основе углеводородного сырья, производимого с использованием очищенной воды.

В таблице 1 приведены показатели готового продукта микробного белка, полученного при возврате различного количества отработанной культуральной жидкости.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Возврат 10% отработанной культуральной жидкости

Осуществляли выращивание культуры штамма Methylococcus capsulatus ГБС-15 в непрерывном режиме в ферментере эжекционного типа объемом 40 л (рабочий объем - 25 л) с непрерывной подачей концентрированного раствора солей, подготовленной воды и отработанной культуральной жидкости в количестве 0,625 л/час.

Процесс выращивания осуществляли при температуре 41-43°С и рН среды выращивания 5,6-5,8. Значение рН поддерживали 10%-ным раствором аммиачной воды. Регулирование температуры процесса осуществляли подачей охлаждающей воды в теплообменник аппарата.

Расход природного газа и воздуха на 1 л питательной среды в ферментере составляли 15 и 45 л/час соответственно.

Культуру выращивали при атмосферном давлении, при коэффициенте скорости протока 0,25 ч^-1, концентрация биомассы в ферментере составляла 10-11 г/л.

При использовании такого режима культивирования в течение длительного времени, с использованием природного газа различного состава (с содержанием метана от 85% об. до 99,9% об.) процесс шел стабильно и качество получаемой биомассы соответствовало по составу биомассе, получаемой при культивировании без возврата отработанной культуральной жидкости.

Пример 2. Возврат 95% отработанной культуральной жидкости

Процесс проводили аналогично примеру 1, количество возвращаемой отработанной культуральной жидкости составляло 95%.

Осуществляли выращивание культуры штамма Methylococcus capsulatus ГБС-15 в непрерывном режиме в ферментере эжекционного типа объемом 40 л (рабочий объем - 25 л) с непрерывной подачей концентрированного раствора солей, отработанной культуральной жидкости в количестве 5,9 л/час.

Процесс шел стабильно, качество получаемой биомассы соответствовало по составу биомассе, получаемой при культивировании без возврата отработанной культуральной жидкости.

Результаты отображены в таблице 1.

Использование ассоциации бактериальных культур совместно со штаммом Methylococcus capsulatus ГБС-15, позволяет проводить процесс ферментации с возвратом отработанной культуральной жидкости от 10 до 95% от общего количества используемой подготовленной воды. Это дает возможность решить проблему очистки и полной утилизации отработанной культуральной жидкости. Коррекция минеральных компонентов, подаваемых в ферментер в составе отработанной культуральной жидкости позволяет повысить продуктивность процесса получения микробного белка на основе природного газа (метан с примесью его низкомолекулярных гомологов) от 10 до 30% при атмосферном давлении. Качество получаемого продукта соответствует всем требованиям, предъявляемым к микробному белку на основе природного газа.

Изобретение относится к микробиологической промышленности. Способ получения микробного белка на основе метанокисляющих бактерий Methylococcus capsulatus ГБС-15 предусматривает приготовление питательной среды, состоящей из калия, магния, железа (II), меди, марганца, цинка, кобальта и молибдата натрия заданной концентрации с добавлением фосфорной кислоты, ферментацию бактериальных культур с постоянной подачей культуральной жидкости, раствора аммиака и газовой смеси при температуре 40-45°С в непрерывном протоке 0,2-0,3 объема ферментера в час. Затем осуществляют сепарацию с получением готового продукта. При этом отработанную культуральную жидкость после сепарации возвращают через накопительную емкость на стадию ферментации в объеме от 10 до 95% от общего количества используемой воды, обогащают недостающими минеральными солями до заданных концентраций в культуральной жидкости с последующим продолжением ферментации бактериальной культуры. Изобретение позволяет повысить выход готового продукта. 1 табл., 2 пр.

Способ получения микробного белка на основе метанокисляющих бактерий Methylococcus capsulatus ГБС-15, включающий приготовление питательной среды, состоящей из калия, магния, железа (II), меди, марганца, цинка, кобальта и молибдата натрия заданной концентрации с добавлением фосфорной кислоты, ферментацию бактериальных культур с постоянной подачей культуральной жидкости, раствора аммиака и газовой смеси при температуре 40-45°С в непрерывном протоке 0,2-0,3 объема ферментера в час, сепарацию, получение готовой биомассы и ее сушки, отличающийся тем, что отработанную культуральную жидкость после сепарации возвращают через накопительную емкость на стадию ферментации в объеме от 10 до 95% от общего количества используемой воды, обогащают недостающими минеральными солями до заданных концентраций в культуральной жидкости, затем продолжают ферментацию бактериальной культуры до получения готового продукта.