СПОСОБ ПРОФИЛАКТИКИ ПОСЛЕОПЕРАЦИОННЫХ ПЕРИТОНЕАЛЬНЫХ СПАЕК В ГИНЕКОЛОГИЧЕСКОЙ И ТАЗОВОЙ ХИРУРГИИ ПРИ ИХ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ МОДЕЛИРОВАНИИ У КРЫС Российский патент 2025 года по МПК A61B17/00 A61K31/728 A61K31/717 A61P43/00 G09B23/28 

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано при проведении исследований, связанных с экспериментальным моделированием и профилактикой послеоперационных перитонеальных спаек у лабораторных животных.

Уровень техники

Спаечный процесс органов малого таза является одной из актуальнейших нерешенных проблем современной оперативной гинекологии [1-3]. Известно, что брюшина обладает способностью реагировать на любые раздражители (механические, термические и др.), действующие при оперативных вмешательствах путем образования спаек, биологический смысл которых - ограничить место воздействия раздражителя, препятствуя распространению воспаления в брюшной полости. Результатом этого защитного механизма, к сожалению, зачастую являются трубно-перитонеальное бесплодие, хроническая тазовая боль, возникающие вследствие нарушений анатомо-топографического расположения органов малого таза с изменением их морфофункциональной активности [4]. Традиционно образование спаек рассматривают как локальный ответ, возникающий вследствие воздействия на брюшину, в котором участвует ее перитонеальная поверхность, мезотелиальные клетки, базальная мембрана и субэндотелиальная соединительная ткань [5-8]. При этом консервативные методы лечения спаечной болезни в ряде случаев неэффективны, а повторное хирургическое вмешательство зачастую приводит к усугублению процесса спайкообразования [1, 9].

Клинические данные о предотвращении образования спаек всегда будут ограничены, поскольку для оценки спаек требуется повторная лапароскопия [5-6]. Это обуславливает актуальность и необходимость исследования механизмов действия противоспаечных барьеров с применением широкого арсенала методов, что подразумевает изучение этого процесса в экспериментальных условиях на животных-моделях [10-11]. В качестве таких барьеров в практике достаточно часто используют препараты на основе гиалуроновой кислоты, однако, механизм их действия изучен недостаточно.

Раскрытие изобретения

Задачей данного изобретения является разработка способа профилактики послеоперационных перитонеальных спаек в гинекологической и тазовой хирургии при их экспериментальном моделировании у крыс.

Технический результат, достигаемый с помощью предлагаемого изобретения, сводится к снижению доли животных с перитонеальными послеоперационными спайками. В основе предлагаемого изобретения лежит внутрибрюшинное введение геля на основе гиалуроновой кислоты и карбоксиметилцеллюлозы в дозировке 0,5 мг, 2 мг/кг, на травмированные поверхности интраоперационно.

Перечень фигур

Фиг. 1. Макроскопическая картина при вскрытии брюшной полости - контрольная группа (хорошо визуализируются образовавшиеся спайки).

Фиг. 2. Макроскопическая картина при вскрытии брюшной полости - экспериментальная группа.

Фиг. 3. Контрольная группа. Микрофотографии места прикрепления спайки к брюшной стенке. Визуализируются коллагеновые волокна, врастающих в мышечную ткань. Окраска гематоксилином и эозином, × 100.

Фиг. 4. Ультраструктура перитонеальных спаек животных, подвергавшихся хирургическому вмешательству без последующего лечения. В толще спаек определяется большое количество коллагеновых волокон с образованием пучков, большое количество кровеносных сосудов по типу капилляров. ТЭМ - × 14000.

Осуществление изобретения

Моделирование послеоперационных перитонеальных спаек осуществлялось по способу, описанному в источнике [1]. Эксперимент проводился на 20 половозрелых самках крыс стока Вистар массой 200-250 г, полученных из питомника ФГБУН НЦБМТ ФМБА РФ «Столбовая». Все животные содержались в стандартных условиях вивария при соблюдении правил содержания лабораторных животных (время и порядок проведения карантина, маркировка всех особей, постоянный санитарный контроль, стандартный пищевой рацион, свободный доступ к воде и корму, автоматический режим освещения день: ночь 12:12 ч).

Для проведения хирургического моделирования послеоперационных спаек были отобраны самки с регулярным 4-5 дневным эстральным циклом. Отбор самок крыс в экспериментальные группы осуществлялся после определения фазы эстрального цикла по кольпоцитограмме для того, чтобы в эксперимент животные вошли в фазе диэструса.

Операции проводили под общей анестезией животных препаратом Золетил-50 (Virbac, Франция) в дозе 0,5 мг/кг с премедикацией ксилазином при внутримышечном введении. Освобождали место хирургического доступа (брюшную часть туловища) от шерстного покрова и фиксировали животных в положении лежа на спине. Поверхность кожи обрабатывали антисептическим раствором и накрывали стерильной салфеткой.

Для моделирования послеоперационных перитонеальных спаек осуществляли интраоперационное травмирование брюшины, кишечника и рогов матки. Доступ в брюшную полость крыс проводили путем лапаротомии (продольный разрез 3 см). Далее выворачивали края раны, чтобы обнажить париетальную брюшину. С помощью цитологической щеточки на париетальной брюшине с двух сторон проводили травмирование поверхностей (париетальная брюшина, петли кишечника и рога матки) до появления признаков гиперемии. Размер травмы и тяжесть повреждения были идентичными у всех животных.

После моделирования спаечного процесса париетальной брюшины вышеописанным способом интраоперационно крысам экспериментальной группы (n=10) вводили 0,5 мг препарата «Антиадгезин» (Stada, Германия), геля на основе гиалуроновой кислоты и карбоксиметилцеллюлозы на травмированные участки. Животным контрольной группы (n=10) было проведено аналогичное оперативное вмешательство без последующего применения препарата «Антиадгезин».

Для закрытия операционной раны на брюшине накладывали непрерывный шов рассасывающимися хирургическими нитками (ПГА, 4/0 ООО "Линтекс" (Россия)), на коже - отдельные п-образные швы с использованием шовного материала USP 4/0, HR-20, ООО "Линтекс" (Россия).

В день операции и в течение трех последующих дней с целью профилактики послеоперационных гнойно-септических осложнений животные получали антибактериальную терапию, заключавшуюся в пероральном введении амоксикалава с клавулоновой кислотой в виде суспензии в дозировке 20 мг/кг 1 раз в сутки. Введение антибиотика осуществлялось через изогнутую иглу для кормления №12 (1.2×65 3W, Fengshi (Китай)).

Все эксперименты проводили в соответствии с требованиями Женевской Конвенции "International Guiding Principles for Biomedical Research Involving Animals" (Geneva, 1990).

После операции животные содержались в виварии в течение 2 недель в стандартных виварных условиях. Ежедневно осуществлялся осмотр животных, а также оценивалось общее состояние животного и хирургической раны. Гибели животных в послеоперационном периоде и на протяжении всего исследования не было.

Выведение из эксперимента осуществлялось путем передозировки эфирного наркоза на 14-е сутки после операции.

Проводили вскрытие, давали визуальную макроскопическую оценку сформировавшихся внутрибрюшинных спаек.

При вскрытии брюшной полости контрольной группы нами обнаружено наличие плотных тяжей спаек между большим сальником и областью разреза брюшины, а также в зонах повреждения серозного слоя рогов матки толщиной от 0,5 до 1,5 мм, а в 40% наблюдений визуально определялись в толще кровеносные сосуды. Выявленные спайки были плотно сращены с зоной прикрепления и не отделялись при натяжении кожного лоскута (Фиг. 1).

При исследовании брюшной полости крыс из экспериментальной группы в 100% наблюдений отмечено отсутствие спаечного процесса и полная регенерация области операционной раны со стороны париетальной брюшины. В 50% наблюдений между поврежденным серозным слоем рога матки и большим сальником определялись единичные нежные, тонкие пленчатые и нитевидные спайки, легко отделяющиеся при натяжении (Фиг. 2).

Для морфологического исследования были взяты все выявленные спайки от крыс обеих групп.Иссеченный" материал фиксировали в 10% забуференном формалине, обезвоживали в 4 растворах изопропилового спирта по 45 мин, выдерживали в парафине при 57°С 2 ч и заливали в блоки. Приготовляли срезы толщиной 5-7 мкм и проводили окрашивание гематоксилином и эозином, а так же по Маллори по стандартным методикам. Полученные гистологические стеклопрепараты исследовали микроскопически, проводили морфологическую оценку сформировавшихся синехий.

Для электронномикроскопического исследования тканевые образцы спаек фиксировали 2,5% раствором глутарового альдегида на фосфатном буфере (рН 7,4), затем дофиксировали в 1% растворе оксида осмия (OsO₄), обезвоживали в этаноле, в процессе обезвоживания контрастировали 1% уранилацетатом на 70% этаноле и проводили заливку в смесь эпон-аралдит по стандартной методике. Ультратонкие срезы, полученные на ультратоме, дополнительно контрастировали цитратом свинца по Рейнольдсу и просматривали в просвечивающем электронном микроскопе с последующей фотофиксацией.

В ходе проведения трансмиссионной электронной микроскопии оценивали морфологическую картину ткани со спайками, выраженность и характер васкуляризации, интенсивность разрастания коллагеновых волокон.

Микроморфометрически определяли толщину спаек, коллагеновых пучков в каждом образце, также вычисляли отношение эластических волокон к коллагеновым. Для этого определяли площадь, занимаемую каждым типом волокон на площади 100 мкм².

Статистическую обработку результатов выполняли в программе GraphPad Prism v8.41 (США).

При микроскопическом исследовании материала животных контрольной группы в 100% наблюдений отмечались плотные пучки из дезориентированных волокон и пленок, преимущественно представленных колла-геновыми волокнами с наличием фибробластов и сосудов капиллярного типа. (Фиг. 3).

При электронно-микроскопическом исследовании установлено, что у животных, подвергавшихся оперативному вмешательству без последующего лечения (контрольная группа), перитонеальные спайки характеризуются выраженной фибротизацией. В толще спайки наблюдается значительное количество зрелых коллагеновых волокон, образующих толстые организованные пучки, преимущественно ориентированные параллельно друг другу, реже - дезорганизованные. Толщина спаек у животных этой группы равна 1,25±0,17 мм. Средняя толщина коллагеновых волокон составляет 7,54±0,77 мкм. Количество эластических волокон значительно меньше. Соотношение эластических волокон к коллагеновым равно 1:11,6. Доля, занимаемая эластическими волокнами, равна 8,33±1,11%, коллагеновыми -91,67±6,24%. Для образцов характерно выраженное разрастание кровеносных сосудов микроциркуляторного русла с преобладанием артериол. Выявлено присутствие значительного числа активных фибробластов.

В отличие от контрольной группы у животных экспериментальной группы немногочисленные спайки были представлены нежными пленками и нитями, состоящими как из эластических волокон (Фиг. 4), так и разрыхленных неплотных молодых коллагеновых волокон. Мезотелий представлен одно- и двурядным слоем клеток. Кровеносная сеть была в виде единичных капилляров. Очагов грануляционной ткани выявлено не было.

Спайки у животных этой группы более тонкие, чем в контроле -0,82±0,09 мм. Отмечается количественное преобладание эластических волокон, суммарное накопление коллагеновых волокон в ткани перитонеальных спаек у животных данной группы невелико, соотношение эластических волокон к коллагеновым существенно отличается от показателей животных контрольной группы, соответствуя 3,20:1. Доля, занимаемая эластическими волокнами, составляет 66,50±4,27%, коллагеновыми - 33,50±6,22%. Коллагеновый компонент спаек представлен незрелыми волокнами, характеризующимися малой толщиной и неупорядоченной архитектоникой, средней толщиной 1,48±0,22 мкм.

Проведенное исследование свидетельствует о том, что применение препарата «Антиадгезин» вызывает достоверное уменьшение толщины послеоперационных перитонеальных спаек у крыс, существенное снижение доли содержащегося в них коллагена при его неупорядоченном расположении и снижении толщины его волокон. В экспериментальной группе было обнаружено уменьшение воспалительного процесса, усиление регенерации ткани в области повреждения без активации пролиферативных процессов, что предотвращает формирование коллагеновых спаек. При электронно-микроскопическом исследовании установлено, что у животных, подвергавшихся оперативному вмешательству без последующего лечения (контрольная группа), перитонеальные спайки характеризуются выраженной фибротизацией. В толще спайки наблюдается значительное количество зрелых коллагеновых волокон, образующих толстые организованные пучки. В экспериментальной группе животных, подвергшихся лечению, патоморфологически перитонеальные спайки были представлены рыхлой волокнистой соединительной тканью с невысокой и равномерной васкуляризацией капиллярного типа и небольшим количеством активных фибробластов.

Таким образом, эффект уменьшения спайкообразования достигается внутрибрюшинным введением геля на основе гиалуроновой кислоты и карбоксиметилцеллюлозы в дозировке 0,5 мг, 2 мг/кг, на травмированные поверхности интраоперационно.

Предлагаемое изобретение имеет следующие преимущества по сравнению с другими известными техническими решениями:

- снижает толщину послеоперационных перитонеальных спаек у крыс;

- снижает долю содержащегося в перитонеальных спайках коллагена и вызывает неупорядоченность его расположения, а так же снижение толщины волокон;

- снижает интенсивность местного воспалительного процесса, усиливая регенерацию ткани в области повреждения без активации пролиферативных процессов и без формирования коллагеновых спаек.

Источники информации:

1. Кулаков В.И., Адамян Л.В., Мынбаев О.А. Послеоперационные спайки (этиология, патогенез и профилактика). М.: Медицина, 1998 / Kulakov V.I., Adamian L.V., Mynbaev О.A. Posleoperatsionnye spaiki (etiologiia, patogenez i profilaktika). M.: Meditsina, 1998 [in Russian].

2. Мынбаев O.A. Этиология, патогенез и принципы профилактики послеоперационных спаек у гинекологических больных. Авто-реф. дисс. д-ра мед. наук. М., 1997 / Mynbaev O.A. Etiologiia, patogenez i printsipy profilaktiki posleoperatsionnykh spaek и ginekologic-heskikh bol'nykh. Avtoref. dis. d-ra med. nauk. M., 1997 [in Russian].

3. Krielen P., Stommel M.W.J., Pargmae P., Bouvy N.D., Bakkum E.A., Ellis H., Parker M.C., Griffiths E.A., van Goor H., Ten Broek R.P.G. Adhesion-related readmissions after open and laparoscopic surgery: a retrospective cohort study (SCAR update). Lancet. 2020 Jan 4; 395 (10217): 33-41. doi: 10.1016/S0140-6736(19)32636-4. Erratum in: Lancet. 2020 Jan 25; 395 (10220): 272. PMID: 31908284.

4. Адамян Л.В., Козаченко A.B., Кондратович Л.М. Спаечный процесс в брюшной полости: история изучения, классификация, патогенез (обзор литературы). Проблемы репродукции. 2013; (6): 7-13. Adamyan L.V., Kozachenko A.V., Kondratovich L.M. Peritoneal adhesions: the history of researh, classification and pathogenesis (a review). Russian Journal of Human Reproduction. 2013; (6): 7-13. (InRuss.).

5. Koninckx P.R., Gomel V., Ussia A., Adamyan L. Role of the peritoneal cavity in the prevention of postoperative adhesions, pain, and fatigue. Fertil Steril. 2016 Oct; 106 (5): 998-1010. doi:10.1016/j.fertnstert.2016.08.012. Epub 2016 Aug 11. PMID: 27523299.

6. Murat Ekin, Cihan Kaya, Sakir Volkan Erdogan, Ece Bahceci, Sema Baghaki & Levent Ya§ar (2020): The effect of new cross linked hy-aluronan gel on quality of life of patients after deep infiltrating endometriosis surgery: a randomized controlled pilot study, Journal of Obstetrics and Gynaecology, DOI: 10.1080/01443615.2020.1755628

7. Chaichian S., Saadat Mostafavi S.R., Mehdizadehkashi A., Najmi Z., Tahermanesh K., Ahmadi Pishkuhi M, Jesmi F, Moazzami B. Hyaluronic acid gel application versus ovarian suspension for prevention of ovarian adhesions during laparoscopic surgery on endometrioma: a double-blind randomized clinical trial. BMC Womens Health. 2022 Feb 11; 22 (1): 33. doi: 10.1186/s 12905-022-01607-2. PMID: 35148732; PMCID: PMC8832808.

8. Кулаков В.И., Адамян Л.В. Эндоскопия в гинекологии. М: Медицина 2000.

9. Ahmad G., Thompson М., Kim К., Agarwal Р., Mackie F.L., Dias S., Metwally M., Watson A. Fluid and pharmacological agents for adhesion prevention after gynaecological surgery. Cochrane Database Syst Rev. 2020 Jul 17; 7 (7): CD001298. doi: 10.1002/14651858. CD001298.pub5. PMID: 32683695; PMCID: PMC7388178.

10. Guo J., Wei C., Wang X., Hou Y., Guo W. An in situ mechanical adjustable double crosslinking hyaluronic acid/poly-lysine hydrogel matrix: Fabrication, characterization and cell morphology. Int J Biol Macromol. 2021 Jun 1; 180: 234-241. doi: 10.1016/j.ijbi-omac.2021.03.071. Epub 2021 Mar 16. PMID: 33737180.

11. Ghobrial S., Ott J., Parry J.P. An Overview of Postoperative Intraabdominal Adhesions and Their Role on Female Infertility: A Narrative Review. J Clin Med. 2023 Mar 15; 12 (6): 2263. doi: 10.3390/jcml2062263. PMID: 36983263; PMCID: PMC10051311.

Изобретение относится к экспериментальной медицине, а именно к хирургии. Крысам интраоперационно внутрибрюшинно вводят препарат «Антиадгезин» в дозе 0,5 мг на травмированные поверхности. При этом травмирование осуществляют на париетальной брюшине с двух сторон, включая петли кишечника и рог матки до появления признаков гиперемии. Способ позволяет снизить толщину послеоперационных перитонеальных спаек у крыс, снизить долю содержащегося в перитонеальных спайках коллагена и вызывать неупорядоченность его расположения, а также снизить толщину волокон, интенсивность местного воспалительного процесса, усиливая регенерацию ткани в области повреждения без активации пролиферативных процессов и без формирования коллагеновых спаек, что в свою очередь дает возможность разработать способ профилактики послеоперационных перитонеальных спаек в гинекологической и тазовой хирургии. 4 ил., 1 пр.

Способ проведения профилактики послеоперационных перитонеальных спаек у крыс в модельном эксперименте, отличающийся тем, что вводят внутрибрюшинно 0,5 мг препарата «Антиадгезин» на травмированные поверхности интраоперационно, при этом травмирование осуществляют на париетальной брюшине с двух сторон, включая петли кишечника и рог матки до появления признаков гиперемии.