ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЙ ГИДРОГЕЛЬ ДЛЯ ДЕТЕКЦИИ БИОЛОГИЧЕСКИХ МОЛЕКУЛ Российский патент 2024 года по МПК G01N21/64 C09K11/56 

Изобретение относится к области создания гибридных наноматериалов, предназначенных для детектирования органических и неорганических молекул, в частности, для создания флуоресцентных гидрогелей из флуоресентных нанокристаллов и биологических распознающих молекул в ходе фазового перехода золь-гель, что позволяет детектировать исследуемые аналиты с высокой чувствительностью и специфичностью.

Флуоресцентные гидрогели являются многообещающим компонентом биосенсоров следующего поколения. Они позволяют, в ответ на взаимодействие с аналитом, детектировать изменение флуоресцентного сигнала, что является более чувствительным методом, чем детекция хромогенного сигнала. Благодаря своей пористости и гидрофильности они позволяют иммобилизовать в них аффинные молекулы по всему объему, что, во-первых, позволяет лучше сохранить их нативную конформацию, а во-вторых, позволяет добиться того, все связывающие эпитопы аффинных молекул смогут связывать детектируемые аналиты. При этом флуоресцентные гидрогели должны обладать высокой фотостабильностью, то есть сохранять максимальную интенсивность флуоресценции во время проведения анализа и хранения, а также их флуоресцентые свойства должны быть гомогенными в структуре гидрогеля, чтобы не вносить дополнительные флуктуации в детектируемое изменение флуоресцентного сигнала.

Известен композитный гелевый матрикс и способ его получения, описанный в [1]. В известном гелевом матриксе используют нанокристаллы (НК) состава CdSe, CdS, CdTe, ZnSe, ZnS и другие, поверхность которых содержит силановые соединения, имеющие реакционную группу для фазового перехода золь-гель. Полученную смесь нанокристаллов наносят на подложку, например, методом вращающейся подложки, инициируют фазовый переход золь-гель с помощью катализатора и прогревают получившуюся подложку при температуре 250°С в течение 72 часов, в результате чего получают известный гелевый матрикс. К недостаткам известного гелевого матрикса стоит отнести то, что он не обладает пористостью, для прохождения жидкости с исследуемыми аналитами и, следовательно, не может применяться для анализа биологических образцов. Также прогрев подложки при 250°С инактивирует органические распознающие молекулы, что ограничивает использование данного флуоресцентного гелевого матрикса в биосенсорах.

Известен гидрогель и способ его получения, описанный в [2]. Известный гидрогель состоит из тетрапептидных мономеров, которые представляют собой последовательность из четырех аминокислотных остатков, каждый из которых конъюгирован с флуоресцентным органическим красителем родамин Б. Гелеобразование проходит с помощью добавления сшивающего агента и облучения смеси ультрафиолетовым излучением. К недостаткам известного гидрогеля стоит отнести то, что в его составе используется органический флуоресцентный краситель, который имеет низкую фотостабильность, то есть его флуоресценция быстро снижается под действием возбуждающего излучения. Это не позволяет использовать его в составе биосенсоров, так как общее снижение его флуоресценции будет снижать чувствительность и специфичность детекции аналитов. Это известный гидрогель выбран в качестве ближайший аналог к предлагаемому нами флуоресцентному гидрогелю для детекции биологических молекул не обнаружен.

Технический результат предлагаемого изобретения заключается в создании флуоресцентного гидрогеля для детекции биологических молекул, который обеспечивает равномерное распределение флуоресцентных неорганических низкотоксичных нанокристаллов структуры ядро/оболочка и биологических распознающих молекул на базе однодоменных антител, что позволяет повысить чувствительность детекции аналитов и использовать его в составе биосенсоров биологических молекул.

Технический результат достигается тем, что предложен флуоресцентный гидрогель для детекции биологических молекул, состоящий из флуоресцентных неорганических низкотоксичных нанокристаллов структуры ядро/оболочка, поверхность которых содержит тиол-содержащие лиганды, способные к гелебразованию за счет фазового перехода золь-гель, а также содержит лиганды с которыми конъюгированы однодоменные антитела, которые специфически связывают исследуемый аналит, конъюгированные пространственно-ориентированным образом так, чтобы их антигенсвязывающие участки были ориентированы во вне от поверхности нанокристаллов.

Флуоресцентные гидрогели являются идеальными кандидатами для использования в биосенсорах органических молекул. Флуоресцентные свойства гидрогелям придаются за счет иммобилизации в них флуоресцентных меток, которыми могут выступать флуоресцентные белки, органические флуоресцентные красители или флуоресцентные нанокристаллы. При этом органические флуорофоры заметно уступают флуоресцентным НК, что обусловлено более высоким квантовым выходом флуоресценции НК, позволяющим повысить чувствительность детекции, их большей фотостабильностью, необходимой для накопления сигнала или исследования протяженных процессов и более узким пиком флуоресценции, позволяющим повысить прецизионность детекции и осуществлять одновременную детекцию нескольких различных аналитов. При этом важным свойством флуоресцентных гидрогелей является равномерность их флуоресцентных свойств во всем объеме гидрогеля. Традиционно для равномерного распределения флуоресцентных меток применяется активное перемешивание компонентов гидрогеля и флуоресцентных меток или обработка ультразвуком, но при этом данные подходы не обеспечивают полностью равномерного распределения флуоресцентных меток в объеме гидрогеля. Предлагаемый нами подход, использования для гелеобразования фазового перехода золь-гель за счет свойств поверхностных лигандов НК, позволяет добиться истинно гомогенного распределения НК в гидрогеле, так как в этом случае в каждом узле, образовавшегося гидрогеля, будут иммобилизованы НК. Также стоит отметить, что подобное гомогенное распределение требуется не только для флуоресцентных меток, но и для распознающих молекул, которые селективно связывают детектируемые аналиты. Иммобилизация распознающих молекул, в качестве которых могут выступать ферменты, антитела или другие биологические распознающие молекулы, может проводиться как на этапе синтеза гидрогеля, так и после его полного или частичного формирования. При этом данные подходы также не гарантируют равномерного распределения распознающих молекул в объеме гидрогеля. В предлагаемом нами гидрогеле для его создания используются флуоресцентные НК поверхность которых одновременно покрыта как лигандами необходимыми для фазового перехода золь-гель, так и распознающими метками на основе однодоменных антител (одАТ). Размер одАТ составляет порядка 2,5-4 нм, что сопоставимо с размерами флуоресцентных НК. Так как одАТ конъюгированы с поверхностью НК пространственно ориентированным образом из расчета 1-2 молекулы антител на один НК, то это позволяет использовать оставшееся место для иммобилизации лигандов для фазового перехода золь-гель и для образования гидрогеля.

Существует первый частный случай, когда в качестве флуоресцентных неорганических низкотоксичных нанокристаллов структуры ядро/оболочка применяют нанокристаллы состава CuInS₂/ZnS и/или AgInS₂/ZnS, и/или InP/ZnS.

Существует второй частный случай, когда в качестве тиол-содержащих лигандов применяют 16-меркаптогексадекановую, тиогликолевую или 3-меркаптопропионовую кислоту.

Существует третий частный случай, когда относительное количество однодоменных антител и тиол-содержащих лигандов находится в диапазоне от 1 к 100000 до 1 к 500.

На фиг. 1 представлена принципиальная схема, иллюстрирующая конкретный пример строения флуоресцентного гидрогеля для детекции биологических молекул. На фиг. 1 цифрами обозначены следующие элементы: флуоресцентный нанокристалл - 1; лиганд для гелеобразования в ходе фазового перехода золь-гель - 2; однодоменное антитело - 3; лиганд для конъюгации флуоресцентного нанокристалла с однодоменным антителом - 4.

Пример 1. Способ детекции белка зеленого флуоресцентного белка (GFP)

Принцип применения, предлагаемого флуоресцентного гидрогеля для детекции биологических молекул, раскрывается следующим примером детекции белка зеленого флуоресцентного белка (GFP). Изготовление флуоресцентного гидрогеля для детекции биологических молекул проводят следующим образом. На первом этапе известным способом изготавливают флуоресцентные нанокристаллы состава AgInS₂ с максимумом флуоресценции на 490 нм, что соответствует пику поглощения GFP. Для этого при комнатной температуре 2,5 мл деионизированной воды помещают в сосуд емкостью 50 мл. При постоянном перемешивании содержимого сосуда добавляют 2,4 мл 0,5 М раствора глутатиона и 0,8 мл 1 М раствора InCl₃, содержащего 0,25 М HNO₃. Затем медленно добавляют 1 мл 5 М раствора NH₄OH, чтобы образовавшийся белый осадок полностью растворился. Затем добавляют 2 мл 0,1 М AgNO₃. В конце процедуры добавляют 1 мл 1 М раствора Na₂S и 0,25 мл 2 М раствора лимонной кислоты. Полученный реакционный раствор перемешивают на кипящей водяной бане 60 мин, после чего охлаждают до комнатной температуры. Затем на полученные ядра НК состава AgInS₂ наращивается оболочка из ZnS, для чего при комнатной температуре смешивают 3 мл 0,5 М раствора глутатиона с 0,4 мл 5 М раствора NH₄OH и 2,67 мл 0,6 М раствора ацетата цинка в отдельном сосуде при постоянном перемешивании. Полученную смесь добавляют к ядрам AgInS₂ при перемешивании при комнатной температуре. Затем смесь ядер НК и раствора прекурсора оболочки перемешивают на кипящей водяной бане в течение 10 мин. Полученный раствор сначала охлаждают до комнатной температуры, а затем добавляют 0,4 мл 5 М раствора NH₄OH, в результате чего получается раствор НК с ядрами состава AgInS₂ и оболочкой из ZnS. Затем поверхностные лиганды НК были заменены на смесь тиогликолиевой кислоты, для фазового перехода золь-гель, и ОН-полиэтиленгликоль-SH, для пространственно ориентированного конъюгирования однодоменных антител. Однодоменные антитела к GFP, содержащие С-концевой аминокислотный остаток цистеина, известным способом были конъюгированы с НК с помощью р-малеимидофенил изоцианата из расчета 1-2 одАТ на один НК. Инициация гелеобразования проводилась добавлением 10 мМ раствора MgCl₂ из расчета чтобы гелеобразование завершилось за сутки. Таким образом был получен опытный флуоресцентный гидрогель (ОФГ) с иммобилизованными в нем одАТ к GFP. Контрольный флуоресцентный гидрогель 1 (КФГ1) был получен аналогичным образом, но содержал одАТ к PD-L1, которые соответственно не могут связывать GFP. Также в качестве контроля был использован флуоресцентный гидрогель, в котором одАТ к GFP добавлялись не путем их конъюгирования с поверхностью НК, а добавлялись в гель на этапе его синтеза (КФГ2). Для этого синтезированный флуоресцентный гель, полученный из НК не конъюгаированных с одАТ разрушался ультразвуком, после чего к нему добавлялся раствор одАТ к GFP и формирование гидрогеля происходило заново. И аналогичный КФГ2 гидрогель в котором применялись полноразмерные IgG к GFP (КФГ3). Использование полноразмерных IgG к GFP обусловлено тем, что из размер в 5 раз больше размера одАТ и они надежнее иммобилизуются в порах флуоресцентного гидрогеля. Затем проводилось сравнение предлагаемого гидрогеля с контрольными гидрогелями, для чего GFP в фосфатном буфере инкубировался вместе с ОФГ, КФГ1, КФГ2 и КФГ3 в течение 1 часа при легком перемешивании. Затем проводилась промывка от несвязавшегося GFP путем трех последовательных шагов инкубирования ОФГ, КФГ1, КФГ2 и КФГ3 в фосфатном буфере по 15 минут каждый при легком перемешивании. Оптические свойства полученных гидрогелей были исследованы в флуоресцентном микроскопе. Облучение флуоресцентного гидрогеля широкополосным источником излучения с фильтром, отсекающим излучение с длиной волны более 450 нм, приводит к возбуждению НК и их флуоресценции на длине волны 490 нм, при этом связавшийся с одАТ GFP будет поглощать флуоресцентное излучение НК и флуоресцировать на 507 нм. В результате детекции излучения на 507 нм было показано, что уровень флуоресцентного сигнала ОФГ составляет 100 относительных оптических единиц, у КФГ1 - 3, у КФГ2 - 12, а у КФГ3 - 27 относительных оптических единиц, что свидетельствует о значительном повышении чувствительности детекции с помощью предлагаемого гидрогеля. При этом предлагаемый флуоресцентный гидрогель обладает равномерной флуоресценцией НК и GFP, что свидетельствует о равномерном распределении как НК, так и одАТ в структуре гидрогеля.

Предложенный флуоресцентный гидрогель для детекции биологических молекул обладает гомогенным распределением флуоресцентных нанокристаллов и однодоменных антител во всем объеме гидрогеля, что обеспечивает чувствительную детекцию биологических молекул.

Источники информации

1. Jin Heong Yim, Eun Joo Jang, Tae Kyung Ahn. Method for producing quantum dot silicate thin film for light emitting device. Патент US 6869864 B2.

2. Zhang Rong, Xu Liang, Sheng Yang, Duan Zongquan. Preparation method of tetrapeptide fluorescent hydrogel. Патент CN 106699840 B.

Изобретение относится к области создания гибридных наноматериалов, предназначенных для детектирования органических и неорганических молекул, в частности, для создания флуоресцентных гидрогелей из флуоресцентных нанокристаллов и биологических распознающих молекул в ходе фазового перехода золь-гель. Флуоресцентный гидрогель для детекции биологических молекул состоит из флуоресцентных неорганических низкотоксичных нанокристаллов структуры ядро/оболочка, поверхность которых содержит тиол-содержащие лиганды, способные к гелебразованию за счет фазового перехода золь-гель, а также содержит лиганды, с которыми конъюгированы однодоменные антитела, которые специфически связывают исследуемый аналит, конъюгированные пространственно-ориентированным образом так, чтобы их антигенсвязывающие участки были ориентированы во вне от поверхности нанокристаллов. Техническим результатом является создание флуоресцентного гидрогеля для детекции биологических молекул, обеспечивающего равномерное распределение флуоресцентных неорганических низкотоксичных нанокристаллов структуры ядро/оболочка и биологических распознающих молекул на базе однодоменных антител, что позволяет повысить чувствительность детекции аналитов и использовать его в составе биосенсоров биологических молекул. 3 з.п. ф-лы, 1 ил.

1. Флуоресцентный гидрогель для детекции биологических молекул, состоящий из флуоресцентных неорганических низкотоксичных нанокристаллов структуры ядро/оболочка, поверхность которых содержит тиол-содержащие лиганды, способные к гелебразованию за счет фазового перехода золь-гель, а также содержит лиганды, с которыми конъюгированы однодоменные антитела, которые специфически связывают исследуемый аналит, конъюгированные пространственно-ориентированным образом так, чтобы их антигенсвязывающие участки были ориентированы во вне от поверхности нанокристаллов.

2. Флуоресцентный гидрогель по п. 1, отличающийся тем, что в качестве флуоресцентных неорганических низкотоксичных нанокристаллов структуры ядро/оболочка применяют нанокристаллы состава CuInS₂/ZnS, и/или AgInS₂/ZnS, и/или InP/ZnS.

3. Флуоресцентный гидрогель по п. 1, отличающийся тем, что в качестве тиол-содержащих лигандов применяют 16-меркаптогексадекановую, тиогликолевую или 3-меркаптопропионовую кислоту.

4. Флуоресцентный гидрогель по п. 1, отличающийся тем, что относительное количество однодоменных антител и тиол-содержащих лигандов находится в диапазоне от 1 к 100000 до 1 к 500.