СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ЛИПИДОВ ИЗ ЛИПИДСОДЕРЖАЩЕЙ БИОМАССЫ Российский патент 2025 года по МПК C11B1/00 C11B1/02 C11B1/04 C11B1/10 

Настоящее изобретение относится к способу выделения липидов, содержащих полиненасыщенные жирные кислоты, из липидсодержащей биомассы.

Липиды, содержащие PUFA (полиненасыщенные жирные кислоты), представляют высокий интерес в кормовой, пищевой и фармацевтической промышленности. Вследствие чрезмерного вылова рыбы существует большая необходимость в альтернативных источниках липидов, содержащих PUFA, помимо рыбьего жира. Кроме того, некоторые штаммы дрожжей и водорослей, в частности, клетки микроводорослей, например из отряда Thraustochytriales, являются очень хорошим источником липидов, содержащих PUFA.

Ранее выделение масла из клеток осуществляли путем использования органических растворителей, таких как гексан. Но применение органических растворителей приводит к опасным условиям работы, требует применения дорогостоящего взрывобезопасного оборудования, и для него необходимо осуществление дорогостоящего способа извлечения растворителя во избежание загрязнения окружающей среды.

Таким образом, в качестве альтернативного метода выделения масла разработали высаливание масла с использованием больших количеств хлорида натрия. Но применение больших количеств хлорида натрия приводит к образованию побочного продукта, представляющего собой делипидизированную биомассу, который по причине высокого содержания соли невозможно применять в качестве кормового ингредиента, поэтому способ является недостаточно рациональным. Кроме того, высокая концентрация соли приводит к быстрой коррозии применяемого оборудования из стали.

Таким образом, существует потребность в разработке способа эффективного выделения масла из биомассы, который осуществляется без применения органических растворителей, а также без применения больших количеств соли. Такие способы описаны в WO 2018/011275, WO 2018/011286, WO 2018/013670 и WO 2018/122057. В настоящем документе может быть, в частности, показано, что, если соответствующее количество эквивалентов основания добавляют в суспензию биомассы, содержащую PUFA-содержащий липид, эффективное отделение масла от биомассы можно реализовать без необходимости в добавлении органических растворителей или больших количеств солей.

Исходя из уровня техники, целью настоящего изобретения является дополнительное повышение эффективности процесса выделения масла.

Неожиданно выяснилось, что общая эффективность процесса выделения масла может быть дополнительно повышена, если перед механическим отделением масляной фазы от водной фазы соотношение масла и общего содержания сухого вещества (TDM) составляет по меньшей мере 0,5, предпочтительно в диапазоне от 0,5 до 0,9.

Таким образом, первой целью настоящего изобретения является способ выделения липида, содержащего полиненасыщенные жирные кислоты (PUFA), из биомассы, который предусматривает следующие стадии:

a) обеспечение суспензии биомассы, содержащей клетки, которые содержат липид, содержащий PUFA;

b) лизирование клеток биомассы, по меньшей мере частичное;

c) концентрирование суспензии до общего содержания сухого вещества (TDM), составляющего от 20 до 60 вес. %, если суспензия характеризуется более низким содержанием TDM;

d) регулирование температуры в суспензии от 20°C до 100°C;

e) поддержание температуры в диапазоне, указанном в (d), в течение по меньшей мере 0,5 часа при добавлении всего от 7,5 до 25 моль эквивалента основания к 10 кг всего сухого вещества, содержащегося в суспензии;

f) регулирование значения pH от 5,0 до 8,5 и инкубирование в течение периода от 0,1 до 6 часов;

g) отделение содержащей масло легкой фазы от содержащей воду, соль, оставшееся масло и клеточный дебрис тяжелой фазы путем центрифугировния;

характеризующийся тем, что в суспензию иногда после стадии (b), но перед стадией (g), добавляют масло, вследствие чего соотношение масла и общего содержания сухого вещества (TDM) достигает значения по меньшей мере 0,5.

Масло, которое добавляют для увеличения соотношения масла и TDM, может представлять собой любой вид съедобного масла, в частности микробное масло, растительное масло, масло животного происхождения или их смеси. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения масло представляет собой масло, которое содержит также PUFA.

Масло животного происхождения предпочтительно представляет собой масло морского организма. Согласно настоящему изобретению «масло морского организма» или «масло морского происхождения» следует в целом понимать как масло, полученное из морского организма, предпочтительно из морского животного. Помимо рыбьего жира, который является предпочтительным согласно настоящему изобретению, оно также относится к маслам, выделенным из других морских организмов, в частности из морских животных, например, из криля, двустворчатых моллюсков, кальмаров или креветок. Предпочтительно масло морского происхожения, которое следует использовать согласно настоящему изобретению, представляет собой рыбий жир, в частности жирное масло из рыбы, в частности предпочтительно жирное масло из рыбы семейств Engraulidae, Carangidae, Clupeidae, Osmeridae, Scombridae и/или Ammodytidae.

Применение масел морского происхождения, в частности рыбьего жира, и растительных масел, в частности масла канолы и соевого масла, оказалось очень подходящим для улучшения отделения масла согласно настоящему изобретению.

Поскольку биомасса по настоящему изобретению предпочтительно представляет собой микробную биомассу, в частности биомассу представителей класса Labyrinthulea, добавление масла морского происхождения предпочтительно обеспечивает получение продукта, который содержит смесь PUFA-содержащего микробного масла, в частности представителей класса Labyrinthulea, и масла морского происхождения. Таким образом, дополнительным объектом настоящего изобретения являются масляные композиции, содержащие микробное масло, в частности представителей класса Labyrinthulea, предпочтительно рода Aurantiochytrium или Schizochytrium, и масло морского происхождения, в частности рыбий жир, с соотношением (вес./вес.) от 30:1 до 1:30, предпочтительно с соотношением (вес./вес.) от 20:1 до 1:20, более предпочтительно с соотношением (вес./вес.) от 10:1 до 1:10, от 5:1 до 1:5 или от 2:1 до 1:2.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, в частности когда получают смесь микробного масла и масла морского происхождения, количество DHA является приблизительно таким же, что и количество EPA. Т.е. предпочтительный вариант осуществления настоящего изобретения представляет собой липид, который содержит DHA и EPA в соотношении от 2:1 до 1:2, более предпочтительно от 3:2 до 2:3, наиболее предпочтительно в соотношении от 4:3 до 3:4, причем липид предпочтительно представляет собой смесь микробного масла, в частности представителей класса Labyrinthulea, более предпочтительно рода Aurantiochytrium или Schizochytrium, и масла морского происхождения, в частности рыбьего жира.

Анизидиновое число (AV) определяют согласно официальному методу AOCS Cd 18-90. AV представляет собой меру для вторичных продуктов реакции жирных кислот, таких как альдегиды и кетоны, которые возникают при окислении масла.

Пероксидное число (PV) определяют согласно официальному методу AOCS CD 8-53. PV представляет собой меру для первичных продуктов реакции, таких как пероксид и гидропероксиды, которые возникают при окислении масла. Согласно настоящему изобретению PV измеряют в мэкв/кг.

Содержание свободных жирных кислот определяют согласно официальному методу AOCS: AOCS Ca 5a-40. Содержание влаги определяют согласно официальному методу AOCS: AOAC 930.15, 935.29. Содержание нерастворимых примесей определяют согласно официальному методу AOCS: AOCS 3a-46. Количество DHA и EPA определяют согласно официальному методу AOCS: AOCS Ce 1b-89. Количество общего жира определяют согласно официальному методу AOCS: AOCS 996.06. Количество сырого жира определяют согласно официальным методу AOCS: AOAC 920.39, 954.02.

В дополнительном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения масло представляет собой PUFA-содержащее масло, которое получено из того же вида микроорганизма, что и масло, содержащееся в (деэмульгированной) суспензии.

В очень предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения масло, которое добавляют, представляет собой масло, которое получено посредством самого применяемого способа, т.е. это масло, которое было получено ранее указанным способом. Иными словами, масло, которое получают механическим отделением масляной фазы от водной фазы, отчасти рециркулируют на предыдущую стадию способа выделения для повышения соотношения масла и TDM.

В особенно предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения рециркуляцию масла осуществляют как непрерывный процесс, т.е. масло, которое получают на последней стадии способа после механического отделения водной фазы, непрерывно отчасти рециркулируют в процесс, предпочтительно иногда после стадии (b), более предпочтительно после стадии (e) или после стадии (f).

Альтернативно получение деэмульгированной PUFA-содержащей композиции осуществляют путем ферментирования продуцирующих PUFA клеток, пока соотношение масла и TDM не достигнет значения по меньшей мере 0,5, предпочтительно по меньшей мере 0,5-0,9.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения способ выделения липида, содержащего полиненасыщенные жирные кислоты (PUFA), из биомассы, предусматривает следующие стадии:

a) ферментирование продуцирующих PUFA клеток, пока соотношение масла и общего содержания сухого вещества (TDM) в ферментационном бульоне не достигнет значения по меньшей мере 0,5;

b) лизирование клеток биомассы, по меньшей мере частичное;

c) концентрирование суспензии до общего содержания сухого вещества (TDM), составляющего от 20 до 60 вес. %, если суспензия характеризуется более низким содержанием TDM;

d) регулирование температуры в суспензии от 20°C до 100°C;

e) поддержание температуры в диапазоне, указанном в (d), в течение по меньшей мере 0,5 часа при добавлении всего от 7,5 до 25 моль эквивалента основания к 10 кг всего сухого вещества, содержащегося в суспензии;

f) регулирование значения pH от 5 до 8,5 и инкубирование в течение периода от 0,1 до 6 часов;

g) отделение содержащей масло легкой фазы от содержащей воду, соль, оставшееся масло и клеточный дебрис тяжелой фазы путем центрифугирования.

В способах, раскрытых ранее, стадия (e), т.е. добавление эквивалентов основания, приводит к разрушению эмульсии, содержащейся в суспензии, на содержащую масло легкую фазу и тяжелую фазу, содержащую воду, клеточный дебрис и соли. Данное разрушение эмульсии также называется «деэмульгированием» в контексте данного применения.

Если не указано иное, то в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно на стадии деэмульгирования pH поддерживают на уровне ниже 11,5. Это осуществляют путем добавления основания на стадии деэмульгирования не сразу, а либо непрерывно, либо последовательно, в результате чего можно избежать превышения указанных значений pH.

В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения деэмульгирование осуществляют при относительно низком pH – ниже 9,0, в частности при pH от 7,0 до 9,0, предпочтительно при pH от 7,0 до 8,5, в частности от 7,5 до 8,5.

В дополнительном конкретном варианте осуществления настоящего изобретения деэмульгирование осуществляют при температуре ниже 80°C, в частности при температуре от 20 до 80°C, предпочтительно при температуре от 25 до 75°C, от 30 до 75°C, от 40 до 75°C, от 50 до 75°C или от 60 до 75°C. Т.e., в частности, температуру в способах, раскрытых ранее, регулируют на стадии (d) соответственно.

В дополнительном конкретном варианте осуществления настоящего изобретения стадию деэмульгирования осуществляют в течение менее чем 12 часов, в частности в течение от 0,5, 1, 2 или 4 до 10 часов, предпочтительно от 0,5, 1, 2 или 4 до 8 или от 0,5, 1, 2 или 4 до 6 часов.

В дополнительном конкретном варианте осуществления настоящего изобретения деэмульгирование осуществляют без предварительного лизиса клеток биомассы, т.е. стадия (b) в способах, упомянутых выше, исключена.

Предпочтительно для получения деэмульгированной композиции суспензию непрерывно перемешивают с применением мешалки и/или перемешивающего устройства. В частности, можно использовать перемешивание с низким усилием сдвига и/или перемешивание в аксиальном направлении, в частности, как раскрыто в WO 2015/095694. Импеллеры, подходящие для перемешивания, включают импеллеры с прямыми лопастями, лопастные импеллеры Раштона, аксиально-поточные мешалки, радиально-поточные мешалки, импеллеры с вогнутыми лопастями на диске, высокоэффективные импеллеры, пропеллерные мешалки, лопастные мешалки, турбинные мешалки и их комбинации.

Термин «эквивалент основания» принимает во внимание факт, что в действительности существуют не только одновалентные, а также двух- или поливалентные основания, и они могут применяться в соответствии с настоящим изобретением. В случае, если применяют двухвалентное основание вместо одновалентного основания или в дополнение к нему, то лишь половина молярного количества данного двухвалентного основания подлежит применению, чтобы воспроизвести то же количество эквивалентов основания по сравнению с количеством одновалентного основания, которое подлежало бы применению; в случае, если применяют трехвалентное основание, то лишь третья часть молярного количества одновалентного основания подлежит применению и т.д. В случае, если применяют одновалентное основание, например, гидроксид натрия, количество эквивалентов основания является идентичным количеству основания.

Весовое количество основания можно легко рассчитать на основании молярного количества путем применения молярного веса основания. Например, в случае очень предпочтительного основания в виде гидроксида натрия молярный вес равняется 40 г/моль. Это означает, что один моль гидроксида натрия соответствует 40 г гидроксида натрия.

Предпочтительные основания, применяемые в соответствии с настоящим изобретением, выбраны из гидроксидов, карбонатов и/или бикарбонатов. В очень предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения основание, применяемое в соответствии с настоящим изобретением, исключительно или почти исключительно представляет собой гидроксид натрия. Вследствие легкости использования основания предпочтительно применяют в жидкой форме, в частности, в виде концентрированных растворов, где концентрация основания в растворе предпочтительно находится в диапазоне от 10 до 60 вес. %, в частности в диапазоне от 20 до 50 вес. %.

Согласно настоящему изобретению после обеспечения содержащей биомассу суспензии предпочтительно осуществляют стадию лизирования. Стадия лизирования может быть исключена, если, например, из-за применяемых условий ферментации клетки или их большая часть уже лизированы или легко разрушаемы на одной последующих стадий процедуры без какой-либо определенной стадии лизирования.

Лизирование клеток биомассы можно осуществлять с помощью способов, известных специалистам в данной области техники, в частности ферментативно, механически, физически или химически, или путем применения их комбинаций.

В зависимости от времени воздействия и/или степени применяемой силы, может быть получена композиция, содержащая исключительно лизированные клетки, или композиция, содержащая смесь клеточного дебриса и интактных клеток. Термин «лизированная липидсодержащая биомасса» в такой мере относится к суспензии, которая содержит воду, клеточный дебрис и масло, высвобожденные клетками биомассы, но, помимо этого, также может предусматривать дополнительные компоненты, в частности соли, интактные клетки, дополнительные количества лизированных клеток, а также компоненты ферментационной среды, в частности питательные вещества. Согласно настоящему изобретению «лизирование клеток, по меньшей мере частичное» означает, что по меньшей мере 20%, предпочтительно по меньшей мере 40, 60 или 80% клеток, содержащихся в суспензии, подвергаются лизису.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения лишь небольшие количества интактных клеток, в частности менее 20%, предпочтительно менее 10%, более предпочтительно менее 5%, клеток (относительно общего количества интактных клеток, присутствующих перед лизированием клеток биомассы) присутствуют в лизированной биомассе или суспензии биомассы после осуществления стадии лизирования клеток.

Лизирование клеток можно осуществлять, например, с применением пресса Френча для клеток, ультразвукового диспергатора, гомогенизатора, микрофлюидизатора, шаровой мельницы, стержневой мельницы, шаровой мельницы с галькой, бисерной мельницы, измельчающих валков с усиленной подачей, центробежно-ударной мельницы, промышленного измельчителя, смесителя с высоким усилием сдвига, лопастного смесителя и/или политронного гомогенизатора.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения лизирование клеток включает ферментативную обработку клеток с помощью применения фермента, разрушающего клеточные стенки.

В соответствии с настоящим изобретением фермент, разрушающий клеточные стенки, предпочтительно выбран из протеаз, целлюлаз (например, Cellustar CL (Dyadic), Fibrezyme G2000 (Dyadic), Celluclast (Novozymes), Fungamyl (Novozymes), Viscozyme L (Novozymes)), гемицеллюлаз, хитиназ, пектиназ (например, Pectinex (Novozymes)), сахараз, мальтаз, лактаз, альфа-глюкозидаз, бета-глюкозидаз, амилаз (например, Alphastar Plus (Dyadic); Termamyl (Novozymes)), лизоцимов, нейраминидаз, галактозидаз, альфа-маннозидаз, глюкуронидаз, гиалуронидаз, пуллуланаз, глюкоцереброзидаз, галактозилцерамидаз, ацетилгалактозаминидаз, фукозидаз, гексозаминидаз, идуронидаз, мальтаз-глюкоамилаз, ксиланаз (например, Xylanase Plus (Dyadic), Pentopan (Novozymes)), бета-глюканаз (например, Vinoflow Max (Novozymes), Brewzyme LP (Dyadic)), маннаназ и их комбинаций. Протеаза может быть выбрана из сериновых протеаз, треониновых протеаз, цистеиновых протеаз, аспартат-протеаз, металлопротеаз, глутаминовых протеаз, алкалаз (субтилизинов) и их комбинаций. Хитиназа может представлять собой хитотриозидазу. Пектиназа может быть выбрана из пектолиаз, пектозимов, полигалактуроназ и их комбинаций.

Соответствующий уровень pH для использования фермента зависит от pH-оптимума фермента.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения применяют фермент с pH-оптимумом от 7,0 до 8,0, в частности приблизительно 7,5, таким образом, уровень pH, применяемый на данной стадии, составляет от 7,0 до 8,0, предпочтительно от 7,3 до 7,7. Предпочтительный фермент, который можно применять в данном диапазоне pH, представляет собой алкалазу.

Фермент предпочтительно добавляют в виде концентрированного ферментного раствора, в частности в количестве от 0,01 до 1,5 вес. %, предпочтительно в количестве от 0,03 до 1,0 вес. %, более предпочтительно в количестве от 0,05 до 0,5 вес. % применительно к количеству добавляемого концентрированного ферментного раствора относительно общего количества суспензии после добавления концентрированного ферментного раствора.

В очень предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения лизирование клеток осуществляют следующим образом:

i) нагревание суспензии биомассы до температуры от 50°C до 70°C, предпочтительно до температуры от 55°C до 65°C, и добавление фермента, разрушающего клеточные стенки, к суспензии, в частности ферментационному бульону, и регулирование при необходимости pH до соответствующего значения, при котором фермент работает надлежащим образом;

ii) поддержание температуры и pH в диапазонах, указанных в (i), в течение по меньшей мере одного часа, предпочтительно в течение по меньшей мере двух часов, более предпочтительно в течение периода от двух до четырех часов.

На стадии (i) фермент можно добавлять до или после нагревания суспензии и/или до или после регулирования уровня pH. Аналогично нагревание суспензии можно осуществлять до или после регулирования уровня pH. Однако в предпочтительном варианте осуществления фермент добавляют после нагревания суспензии и после регулирования уровня pH, если регулирование уровня pH вообще является необходимым. В очень предпочтительном варианте осуществления все действия проводят более или менее одновременно.

Предпочтительно на стадиях (i) и (ii) суспензию непрерывно перемешивают с использованием мешалки и/или перемешивающего устройства.

В соответствии с настоящим изобретением деэмульгирование предпочтительно осуществляют в отношении суспензии, характеризующейся содержанием сухого вещества от 20 до 60 вес. %, более предпочтительно от 25 до 60 вес. %, в частности от 30 до 55 вес. % или от 30 до 45 вес. %. Это можно осуществлять либо путем обеспечения суспензии с соответственно высоким содержанием биомассы, либо путем концентрирования суспензии биомассы, в частности, после лизиса клеток биомассы. Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения после необязательного лизирования клеток биомассы и перед стадией деэмульгирования суспензию концентрируют до общего содержания сухого вещества, составляющего от 20 до 60 вес. %, более предпочтительно от 25 до 60 вес. %, в частности от 30 до 55 вес. %, наиболее предпочтительно от 30 до 50 вес. % или от 30 до 45 вес. %.

Концентрирование суспензии предпочтительно осуществляют путем выпаривания воды при температуре не выше 100°C, предпочтительно от 70°C до 100°C, более предпочтительно от 80°C до 90°C, до достижения общего содержания сухого вещества от 20 до 60 вес. %, более предпочтительно от 25 до 60 вес. %, в частности от 30 до 55 вес. % или от 30 до 45 вес. %.

Концентрирование суспензии предпочтительно осуществляют в выпарном аппарате с принудительной циркуляцией (например, доступном от GEA, Германия) с обеспечением быстрого удаления воды. Альтернативно или в дополнение концентрирование можно осуществлять с помощью выпаривания с падающей пленкой, тонкопленочного выпаривания и/или ротационного выпаривания.

В целом регулирование значения pH можно осуществлять в соответствии с настоящим изобретением путем применения либо оснований, либо кислот, известных специалистам в данной области техники. Уменьшение уровня pH можно проводить, в частности, путем применения органических или неорганических кислот, таких как серная кислота, азотная кислота, фосфорная кислота, борная кислота, хлористоводородная кислота, бромистоводородная кислота, перхлорная кислота, гипохлористая кислота, хлористая кислота, фторсерная кислота, гексафторфосфорная кислота, уксусная кислота, лимонная кислота, муравьиная кислота, или их комбинаций. Поскольку желательно избегать высокого содержания хлорида, в предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения в способе по настоящему изобретению не применяют хлористоводородную кислоту или применяют лишь небольшие ее количества. В соответствии с настоящим изобретением серная кислота представляет собой предпочтительное вещество для уменьшения значения pH. Увеличение значения pH можно осуществлять, в частности, путем применения органических или неорганических оснований, таких как гидроксиды, в частности гидроксид натрия, гидроксид лития, гидроксид калия и/или гидроксид кальция, карбонаты, в частности карбонат натрия, карбонат калия или карбонат магния, и/или бикарбонаты, в частности бикарбонат лития, бикарбонат натрия и/или бикарбонат калия. Вследствие легкости использования кислоты и основания предпочтительно применяют в жидкой форме, в частности в виде концентрированных растворов, при этом концентрация кислоты или основания в растворе предпочтительно находится в диапазоне от 10 до 55 вес. %, в частности в диапазоне от 20 до 50 вес. %. В частности, серную кислоту также предпочтительно применяют в концентрированной форме.

Способ в соответствии с настоящим изобретением предусматривает в качестве дополнительной стадии – собирание липида, содержащего PUFA, из деэмульгированной композиции.

Собирание липида, содержащего PUFA, предпочтительно включает «нейтрализацию» деэмульгированной суспензии и последующее отделение полученной таким образом маслосодержащей легкой фазы от тяжелой фазы, содержащей воду, соли, клеточный дебрис и остаточное масло.

«Нейтрализацию» деэмульгированной композиции (стадия (f) в способах по настоящему изобретению) предпочтительно осуществляют путем добавления кислоты, предпочтительно серной кислоты, с регулированием значения pH от 5,0 до 8,5, в частности от 5,0 до 7,5, предпочтительно от 5,0 до 7,0. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения регулируют pH ниже 7, предпочтительно pH от 5,0 до 6,5, от 5,5 до 6,5 или от 5,0 до 6,0, поскольку более высокие выходы масла наблюдали при значениях pH ниже 7.

Перед исходным отделением легкой фазы от тяжелой фазы нейтрализованную композицию можно перемешивать при данном нейтрализованном значении pH от нескольких минут до нескольких часов, предпочтительно от 0,1 до 6 часов, более предпочтительно от 0,5 до 4 часов.

«Нейтрализация» деэмульгированной композиции, как описано ранее, является необходимой если только деэмульгированная композиция, полученная согласно стадии (e) способов по настоящему изобретению, характеризуется значением pH, выходящим за пределы данного диапазона.

Отделение маслосодержащей легкой фазы от тяжелой фазы, содержащей воду, соли и клеточный дебрис, предпочтительно осуществляют с помощью механических средств и предпочтительно при температуре 60-90°C, более предпочтительно 70-80°C и предпочтительно при значении pH 6-9, более предпочтительно 7-8,5. Согласно настоящему изобретению «механические средства», в частности, относятся к способам фильтрации и центрифугирования, известным специалистам в данной области техники. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения отделение содержащей масло легкой фазы от водной фазы осуществляют с помощью двухстадийного процесса центрифугирования, в частности как описано в WO 2019/032880.

После отделения маслосодержащей легкой фазы масло, содержащее PUFA, полученное таким образом, можно дополнительно обрабатывать с применением способов, известных специалистам в данной области техники, в частности путем применения рафинирования, обесцвечивания, дезодорирования и/или вымораживания.

Особенное преимущество способа по настоящему изобретению заключается в том, что его можно осуществлять без применения какого-либо органического растворителя, в частности без применения какого-либо полярного или неполярного органического растворителя. Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения не применяют органические растворители, в частности полярные или неполярные органические растворители, или применяют лишь небольшие их количества для выделения масла, содержащего PUFA, из биомассы. Традиционные органические растворители представляют собой гексан и этанол.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения применяют менее 2 вес. % неполярных органических растворителей, более предпочтительно менее 1, 0,5 или 0,1 вес. %. В особенно предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения вообще не применяют неполярный органический растворитель. В очень предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения применяют менее 2 вес. % органических растворителей, как правило, особенно предпочтительно менее 1, 0,5 или 0,1 вес. %. В особенно предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения вообще не применяют органических растворителей.

Дополнительное преимущество способа по настоящему изобретению заключается в том, что можно реализовать очень эффективное отделение масла от оставшейся биомассы без добавления хлорида натрия, который обычно применяют для высаливания масла из биомассы. Предпочтительно способ можно осуществлять вообще без добавления хлоридных солей, наиболее предпочтительно без добавления каких-либо солей для высаливания масла. Однако небольшие количества хлоридных солей, в частности хлорида натрия, могут присутствовать в суспензии из-за ферментационной среды, применяемой для выращивания биомассы.

Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения для улучшения выделения масла не применяют хлорид натрия или применяют лишь небольшие его количества. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения для выделения масла из биомассы применяют менее 1 вес. % хлорида натрия, более предпочтительно применяют менее 0,5 или 0,2 вес. % хлорида натрия, наиболее предпочтительно менее 0,1 или 0,05 вес. %, при этом вес. % относится к общему весу композиции после добавления хлорида натрия.

В особенно предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения вообще не применяют хлоридных солей или применяют лишь небольшие их количества для улучшения выделения масла. В данном варианте осуществления для выделения масла из биомассы применяют предпочтительно менее 1 вес. % хлоридных солей, более предпочтительно менее 0,5 или 0,2 вес. % хлоридных солей, наиболее предпочтительно менее 0,1 или 0,05 вес. %, при этом вес. % относится к общему весу композиции после добавления хлоридных солей.

В очень предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, как правило, не применяют солей или применяют лишь небольшие их количества для улучшения выделения масла. В данном варианте осуществления для выделения масла из биомассы применяют предпочтительно менее 1 вес. % солей, более предпочтительно применяют менее 0,5 или 0,2 вес. % солей, наиболее предпочтительно менее 0,1 или 0,05 вес. %, при этом вес. % относится к общему весу композиции после добавления солей.

Способы по настоящему изобретению обеспечивают очень эффективное отделение масла, содержащегося в биомассе, от клеточного дебриса и других веществ, содержащихся в суспензии, в частности ферментационном бульоне. С помощью способов по настоящему изобретению предпочтительно более 90 вес. %, в частности более 95, 98 или 99 вес. % масла, содержащегося в биомассе, может быть отделено от биомассы и выделено путем применения очень экономичных и рациональных условий.

«Хлорид» в соответствии с настоящим изобретением относится к количеству выявляемого хлора. Количество присутствующего хлора можно определять с помощью, например, элементного анализа в соответствии с DIN EN ISO 11885. Хлор присутствует в форме солей, которые называются «хлоридами». Содержание хлорида, упомянутого в соответствии с настоящим изобретением, также называемого «хлорид-ионами», – относится исключительно к количеству выявляемого хлора, а не к количеству всей хлоридной соли, которая содержит, помимо хлорид-иона, также катионный противоион.

Общее содержание сухого вещества (TDM), в частности суспензии, относится к остаточному весу суспензии после выполнения высушивания, т.е. после удаления воды. Таким образом, TDM не только относится к клеточному дебрису и солям, но и также, в частности, к маслу, содержащемуся в суспензии.

Содержание TDM предпочтительно определяют с помощью гравиметрического анализа. Для осуществления этого гомогенный образец с определенным объемом взвешивают до и после лиофилизации. Остаточный вес высушенного образца соответствует общему содержанию сухого вещества, содержащегося в этом определенном объеме. Содержание TDM в образце представляет результат деления массы образца после лиофилизации на массу образца до лиофилизации.

Количество масла в образце предпочтительно определяют с помощью анализа сложного метилового эфира жирной кислоты (FAME). Для осуществления этого липиды в образце сначала омыляют с помощью KOH. После этого свободные жирные кислоты метилируют с помощью MeOH. Метилированные жирные кислоты затем можно определять и количественно характеризовать посредством газовой хроматографии с применением внутреннего стандарта.

В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения водную фазу, содержащую воду, соли, остаточное масло и клеточный дебрис, которую получают в качестве побочного продукта на стадии собирания масла, описанной выше, превращают в высушенную биомассу путем высушивания биомассы до обеспечения общего содержания сухого вещества более 90 вес. %.

Превращение тяжелой фазы, содержащей воду, соли, оставшееся масло и клеточный дебрис, которую получают в качестве побочного продукта на стадии сбора масла, в высушенную биомассу путем высушивания биомассы до обеспечения общего содержания сухого вещества более 90 вес. % можно осуществлять различными путями.

В очень предпочтительном варианте превращение проводят путем концентрирования тяжелой фазы до обеспечения содержания сухого вещества, составляющего 30-50 вес. %, предпочтительно 35-45 вес. %, и путем последующей распылительной грануляции биомассы посредством грануляции в псевдоожиженном слое. Путем осуществления этого – очень эффективным образом можно получать биомассу с предпочтительными свойствами. Распылительная грануляция, осуществляемая с применением средств для грануляции в псевдоожиженном слое, более подробно раскрыта в EP 13176661.0.

Концентрирование тяжелой фазы до обеспечения содержания сухого вещества 30-50 вес. % предпочтительно проводят путем выпаривания растворителей, в частности путем выпаривания под вакуумом, и/или путем использования роторного испарителя, тонкопленочного испарителя или испарителя с падающей пленкой. Пригодной альтернативой выпариванию растворителей является обратный осмос.

В качестве альтернативы распылительной грануляции другие способы высушивания, в частности, другие способы конвективной сушки, такие как туннельная сушка или распылительная сушка, в частности сушка с форсуночным распылением, или способы контактной сушки, такие как барабанная сушка, или способы сушки излучением, такие как инфракрасная сушка, концентрированной тяжелой фазы будут выступать в качестве применимых альтернатив, при этом путем применения данных способов обычно получают частицы с меньшим или большим диаметром.

В соответствии с настоящим изобретением в ходе процесса высушивания для предотвращения слеживания к биомассе можно необязательно добавлять средство против слеживания, в частности диоксид кремния, предпочтительно гидрофобный или гидрофильный диоксид кремния. Для этой цели суспензию, в частности ферментационный бульон, содержащий биомассу, равно как и диоксид кремния предпочтительно распыляют в определенную зону сушки. Альтернативно или дополнительно биомассу можно смешивать с средством против слеживания после проведения процесса высушивания. В отношении применения диоксида кремния в качестве средства против слеживания представлена ссылка, в частности, на заявку на патент EP 13187631.0.

Превращение мелкозернистого порошка в крупнозернистый не содержащий пыли продукт можно осуществлять с помощью способов грануляции. Традиционные органические или неорганические вспомогательные средства или носители, такие как крахмал, желатин, производные целлюлозы или подобные вещества, которые, как правило, применяются в пищевой переработке или кормовой переработке в качестве связующих средств, гелеобразующих средств или загустителей, необязательно можно применять в данном последовательном способе грануляции. Дополнительные вспомогательные средства, которые предпочтительно применяются в соответствии с настоящим изобретением, раскрыты в WO 2016/050560, при этом карбоксиметилцеллюлоза представляет собой особенно предпочтительное связующее средство.

После высушивания и необязательно гранулирования и/или просеивания биомассы высушенную биомассу предпочтительно хранят или упаковывают.

Биомасса в виде частиц по настоящему изобретению также как и водные суспензии по настоящему изобретению могут использоваться различными путями. Например, их можно применять с целью получения пищевого продукта или кормового продукта. Альтернативно их можно применять непосредственно в качестве пищевого продукта или кормового продукта.

Дополнительным объектом настоящего изобретения, таким образом, кроме того, является способ получения кормового продукта или пищевого продукта, в котором применяют биомассу в виде частиц и/или водную суспензию в соответствии с настоящим изобретением, и их предпочтительно смешивают с дополнительными ингредиентами кормового продукта или пищевого продукта.

Клетки биомассы, содержащие PUFA, предпочтительно представляют собой микробные клетки или клетки растений. Предпочтительно клетки способны к продуцированию PUFA благодаря поликетидсинтазной системе. Поликетидсинтазная система может представлять собой эндогенную систему или, благодаря генетической инженерии, экзогенную систему.

Клетки растений, в частности, могут быть выбраны из клеток организмов из семейств Brassicaceae, Elaeagnaceae и Fabaceae. Клетки организмов семейства Brassicaceae могут быть выбраны из таковых рода Brassica, в частности из таковых масличного рапса, масличной репы и горчицы сарептской; клетки организмов семейства Elaeagnaceae могут быть выбраны из таковых рода Elaeagnus, в частности из таковых вида Oleae europaea; клетки организмов семейства Fabaceae могут быть выбраны из таковых рода Glycine, в частности из таковых вида Glycine max.

Микробные организмы, которые содержат липид, содержащий PUFA, широко описаны в уровне техники. В данном контексте применяемые клетки могут, в частности, представлять собой клетки, которые естественным образом уже продуцируют PUFA (полиненасыщенные жирные кислоты); однако они также могут представлять собой клетки, которые в результате осуществления подходящих способов генетической инженерии или вследствие случайного мутагенеза демонстрируют улучшенное продуцирование PUFA, или их вообще сделали способными к продуцированию PUFA. Продуцирование PUFA может быть ауксотрофным, миксотрофным или гетеротрофным.

Биомасса предпочтительно содержит клетки, которые продуцируют PUFA гетеротрофно. Клетки в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно выбраны из водорослей, грибов, в частности, дрожжей, бактерий или простейших. Более предпочтительно клетки представляют собой одноклеточные водоросли или грибы.

Подходящие клетки продуцирующих масло дрожжей представляют собой, в частности, клетки штаммов Yarrowia, Candida, Rhodotorula, Rhodosporidium, Cryptococcus, Trichosporon и Lipomyces.

Подходящие клетки продуцирующих масло микроводорослей и подобных водорослям микроорганизмов представляют собой, в частности, клетки микроорганизмов, выбранных из типа Stramenopiles (также называемого Heterokonta). Микроорганизмы типа Stramenopiles, в частности, могут быть выбраны из следующих групп микроорганизмов: Hamatores, протеромонады, опалины, Developayella, Diplophrys, лабиринтулиды, траустохитриды, Biosecids, оомицеты, гифохитриомицеты, Commation, Reticulosphaera, Pelagomonas, Pelagococcus, Ollicola, Aureococcus, Parmales, диатомовые водоросли, ксантофиты, феофиты (бурые водоросли), эустигматофиты, рафидофиты, синуриды, аксодины (включая Rhizochromulinales, Pedinellales, Dictyochales), Chrysomeridales, Sarcinochrysidales, Hydrurales, Hibberdiales и Chromulinales. Другие предпочтительные группы микроводорослей включают членов группы зеленых водорослей и динофлагеллятов, включая членов из рода Crypthecodinium.

Биомасса в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно содержит клетки организмов из таксона Labyrinthulomycetes (Labyrinthulea, лабиринтуломицетовые грибы, лабиринтулы), в частности клетки организмов из семейства Thraustochytriaceae, и предпочтительно по сути состоит из таких клеток. Семейство Thraustochytriaceae (траустохитридиевые) включает роды Althornia, Aplanochytrium, Aurantiochytrium, Botryochytrium, Elina, Japonochytrium, Oblongichytrium, Parietichytrium, Schizochytrium, Sicyoidochytrium, Thraustochytrium и Ulkenia. Биомасса, в частности, предпочтительно содержит клетки организмов из родов Aurantiochytrium, Oblongichytrium, Schizochytrium или Thraustochytrium, главным образом организмы из рода Schizochytrium.

В соответствии с настоящим изобретением полиненасыщенная жирная кислота (PUFA) предпочтительно представляет собой высоконенасыщенную жирную кислоту (HUFA).

Клетки, присутствующие в биомассе, предпочтительно характеризуются тем, что они содержат по меньшей мере 20% по весу, предпочтительно по меньшей мере 30% по весу, в частности по меньшей мере 35% по весу PUFA, в каждом случае в пересчете на сухое вещество клеток.

В соответствии с настоящим изобретением термин «липид» включает фосфолипиды; свободные жирные кислоты; сложные эфиры жирных кислот; триацилглицерины; стерины и сложные эфиры стеринов; каротиноиды; ксантофилы (например, оксикаротиноиды); углеводороды; полученные из изопреноидов соединения и другие липиды, известные специалисту в данной области техники. Термины «липид» и «масло» применяют взаимозаменяемо в соответствии с настоящим изобретением.

В предпочтительном варианте осуществления большинство липидов в данном случае присутствует в форме триглицеридов, при этом предпочтительно по меньшей мере 50% по весу, в частности по меньшей мере 75% по весу, и в особенно предпочтительном варианте осуществления по меньшей мере 90% по весу присутствующих липидов присутствуют в клетке в форме триглицеридов.

В соответствии с настоящим изобретением подразумевается, что полиненасыщенные жирные кислоты (PUFA) означают жирные кислоты, имеющие по меньшей мере две, в частности, по меньшей мере три двойные C-C-связи. В соответствии с настоящим изобретением высоконенасыщенные жирные кислоты (HUFA) являются предпочтительными среди PUFA. В соответствии с настоящим изобретением подразумевается, что HUFA означают жирные кислоты, имеющие по меньшей мере четыре двойные C-C-связи.

PUFA могут присутствовать в клетке в свободной форме или в связанной форме. Примеры наличия в связанной форме представляют собой фосфолипиды и сложные эфиры PUFA, в частности моноацил-, диацил- и триацилглицериды. В предпочтительном варианте осуществления большинство PUFA присутствует в форме триглицеридов, при этом предпочтительно по меньшей мере 50% по весу, в частности по меньшей мере 75% по весу, и в особенно предпочтительном варианте осуществления по меньшей мере 90% по весу присутствующих PUFA присутствуют в клетке в форме триглицеридов.

Предпочтительными PUFA являются омега-3 жирные кислоты и омега-6 жирные кислоты, при этом омега-3 жирные кислоты являются особенно предпочтительными. Предпочтительные омега-3 жирные кислоты представляют собой эйкозапентаеновую кислоту (EPA, 20:5ω-3), в частности (5Z,8Z,11Z,14Z,17Z)-эйкозa-5,8,11,14,17-пентаноевую кислоту, и докозагексаноевую кислоту (DHA, 22:6ω-3), в частности (4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-докоза-4,7,10,13,16,19-гексаноевую кислоту.

В очень предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения применяют клетки, в частности клетки штамма Schizochytrium, которые продуцируют одновременно значительное количество EPA и DHA, при этом DHA предпочтительно продуцируется в количестве по меньшей мере 20 вес. %, предпочтительно в количестве по меньшей мере 30 вес. %, в частности в количестве от 30 до 50 вес. %, и EPA продуцируется в количестве по меньшей мере 5 вес. %, предпочтительно в количестве по меньшей мере 10 вес. %, в частности в количестве от 10 до 20 вес. % (относительно общего количества липида, содержащегося в клетках, соответственно). Продуцирующие DHA и EPA штаммы Schizochytrium могут быть получены с помощью последовательного мутагенеза с последующим соответствующим отбором мутантных штаммов, которые демонстрируют преимущественное продуцирование EPA и DHA и конкретное соотношение EPA:DHA. Любое химическое или нехимическое (например, ультрафиолетовое (UV) излучение) средство, способное индуцировать генетическое изменение в клетке дрожжей, может применяться в качестве мутагена. Такие средства могут применяться отдельно или в комбинации друг с другом, и химические средства могут применяться в чистом виде или с растворителем.

Предпочтительные виды микроорганизмов рода Schizochytrium, которые продуцируют одновременно EPA и DHA в значительных количествах, как указано выше, депонированы под № доступа ATCC PTA-10208, PTA-10209, PTA-10210 или PTA-10211, PTA-10212, PTA-10213, PTA-10214, PTA-10215.

Суспензия биомассы в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно характеризуется плотностью биомассы, составляющей по меньшей мере 80 или 100 г/л, в частности плотностью биомассы, составляющей от 80 до 250 г/л, в частности от 80 до 200 г/л, более предпочтительно плотностью биомассы, составляющей по меньшей мере 120 или 140 г/л, в частности 120 или 140-250 г/л, наиболее предпочтительно плотностью биомассы, составляющей по меньшей мере 160 или 180 г/л (в пересчете на содержание сухого вещества), и предпочтительно представляет собой ферментационный бульон. Таким образом, суспензия может быть получена путем культивирования и выращивания подходящих клеток в ферментационной среде в условиях, при которых PUFA продуцируются микроорганизмом.

Способы получения биомассы, в частности биомассы, которая содержит клетки, содержащие липиды, в частности PUFA, в частности организмов из отряда Thraustochytriales, подробно описаны в уровне техники (см., например, WO 91/07498, WO 94/08467, WO 97/37032, WO 97/36996, WO 01/54510). Как правило, продуцирование происходит у клеток, которые культивируют в ферментере в присутствии источника углерода и источника азота, вместе с рядом дополнительных веществ, таких как минералы, которые обеспечивают рост микроорганизмов и продуцирование PUFA. В данном контексте могут быть достигнуты значения плотности биомассы, составляющие более 100 грамм на литр, и значения скорости продуцирования, составляющие более 0,5 грамм липида на литр в час. Способ предпочтительно осуществляют с помощью процесса, известного как периодический способ с подпиткой, т.е. осуществляется постепенная подпитка источниками углерода и азота в ходе ферментации. Когда необходимое количество биомассы получено, продуцирование липидов может быть индуцировано различными действиями, например путем ограничения источника азота, источника углерода или содержания кислорода или комбинаций данных действий.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения клетки выращивают до тех пор, пока они не достигнут плотности биомассы, составляющей по меньшей мере 80 или 100 г/л, более предпочтительно по меньшей мере 120 или 140 г/л, в частности, по меньшей мере 160 или 180 г/л (в пересчете на общее содержание сухого вещества). Такие способы раскрыты, например, в US 7732170.

Предпочтительно клетки подвергают ферментации в среде с низкой соленостью, в частности, чтобы избежать коррозии. Этого можно достичь с применением не содержащих хлора солей натрия в качестве источника натрия вместо хлорида натрия, таких как, например, сульфат натрия, карбонат натрия, гидрокарбонат натрия или кальцинированная сода. Предпочтительно при ферментации хлорид применяют в количествах менее 3 г/л, в частности, менее 500 мг/л, особенно предпочтительно менее 100 мг/л.

Подходящие источники углерода представляют собой как спиртовые, так и неспиртовые источники углерода. Примеры спиртовых источников углерода представляют собой метанол, этанол и изопропанол. Примеры неспиртовых источников углерода представляют собой фруктозу, глюкозу, сахарозу, мелассу, крахмал и кукурузную патоку.

Подходящие источники азота представляют собой как неорганические, так и органические источники азота. Примеры неорганических источников азота представляют собой нитраты и соли аммония, в частности сульфат аммония и гидроксид аммония. Примеры органических источников азота представляют собой аминокислоты, в частности глутамат и мочевину.

Кроме того, для обеспечения положительного эффекта в отношении ферментации также можно добавлять неорганические или органические соединения фосфора и/или известные стимулирующие рост вещества, такие как, например, дрожжевой экстракт или жидкий кукурузный экстракт.

Предпочтительно клетки подвергают ферментации при значении pH от 3 до 11, в частности от 4 до 10, и предпочтительно при температуре, составляющей по меньшей мере 20°C, в частности от 20 до 40°C, особенно предпочтительно по меньшей мере 30°C. Типичный процесс ферментации занимает до примерно 100 часов.

После завершения ферментации клетки можно пастеризовать с целью уничтожения клеток и деактивации ферментов, которые могут способствовать разрушению липидов. Пастеризации предпочтительно достигают путем нагревания биомассы до температуры от 50 до 121°C, предпочтительно от 50 до 70°C, в течение периода от 5 до 150 минут, в частности от 20 до 100 минут.

Аналогично после завершения ферментации могут быть добавлены антиоксиданты с целью защиты PUFA, присутствующих в биомассе, от окислительного разрушения. В данном контексте предпочтительные антиоксиданты представляют собой BHT, BHA, TBHA, этоксихин, бета-каротин, витамин E, в частности токоферол, и витамин C. Антиоксидант, если применяется, предпочтительно добавляют в количестве от 0,001 до 0,1 вес. %, предпочтительно в количестве от 0,002 до 0,05 вес. % относительно общего количества ферментационного бульона после добавления антиоксиданта.

Демонстрационные примеры

Пример 1. Получение суспензии для применения в испытаниях в отношении деэмульгирования

Непромытый клеточный бульон, содержащий микробные клетки (Schizochytrium sp.) при плотности биомассы более 100 г/л, нагревали до 60°C в перемешиваемом сосуде. После нагревания суспензии уровень pH доводили до 7,5 путем применения каустической соды (50 вес. % раствор NaOH) перед добавлением алкалазы (Alcalase® 2.4 FG (Novozymes)) в жидкой форме в количестве 0,5 вес. % (по весу бульона). Смешивание продолжали в течение 3 часов при 60°C. После этого смесь лизированных клеток переносили в роторный испаритель и нагревали до температуры 80°C при пониженном давлении 400 мбар. Смесь концентрировали в роторном испарителе, пока не было достигнуто общее содержание сухого вещества приблизительно 35 вес. %.

В качестве следующей стадии осуществляли деэмульгирование концентрированной суспензии. Все эксперименты осуществляли с применением приблизительно одного литра ферментативно обработанного и затем концентрированного ферментационного бульона с использованием биореактора с четырьмя 2-л перемешиваемыми сосудами BIOSTAT® B-DCU (Sartorius, Германия). Деэмульгирование осуществляли в течение 24 часов при температуре 90°C. Суспензию перемешивали при 300 об./мин. 1,5 моль каустической соды на кг TDM добавляли непрерывно в течение периода, составляющего 3 часа. Через 24 часа деэмульгированные композиции нейтрализовали либо до pH 5,5, либо до pH 7,5. После нейтрализации содержание TDM и содержание масла определяли для обнаружения соотношения масла и TDM. Затем различные количества масла добавляли для исследования влияния соотношения масла и TDM на конечный выход масла. В качестве масла добавляли либо масло из Schizochytrium, полученное посредством способа по настоящему изобретению ранее, либо растительное масло (масло канолы или соевое масло). Через два часа после необязательного добавления масла 50-г образец гомогенизированной суспензии отбирали и осуществляли отделение клеточного дебриса путем центрифугирования при 13,500 g. Затем определяли количество EPA и DHA в супернатанте.

Таблица 1. Влияние соотношения TDM и масла на выход масла

Первоначальная масса
[г] Исходное масло [г] Добавленное масло [г] Все масло [г] Соотношение масла и TDM Извлечение масла при pH 7,5 Извлечение масла при pH 5,5 Выход при pH 7,5 Выход при pH 5,5 1004 205,1 0 205,1 0,54 193,0 201,0 94,1% 98,0% 1000 204,3 21,5 225,8 0,57 214,8 221,1 94,6% 97,7% 1009 206,1 48,5 254,6 0,61 243,8 250,7 94,8% 98,1% 1002 204,7 119 323,7 0,70 313,3 319,8 94,9% 98,1% 1007 205,7 0 205,7 0,44 192,1 198,0 93,4% 96,2% 1011 206,5 30,1 236,6 0,49 223,9 228,8 93,8% 96,2% 1008 205,9 0 205,9 0,44 193,6 197,8 94,0% 96,0% 1012 206,7 107,2 313,9 0,60 302,3 308,5 94,4% 97,4%

Экспериментальные данные показывают, что если соотношение масла и TDM превышает значение 0,5, общий выход масла повышался значительно. В данном случае не играет роли, достигается ли это значение ферментацией клеток, пока соотношение масла и TDM превышает это значение, или путем рециркуляции масла из Schizochytrium при деэмульгировании перед тем, как происходит отделение содержащей масло легкой фазы от водной фазы. Кроме того, можно увидеть, что если после деэмульгирования значение pH устанавливается на уровне 5,5, выход масла намного выше по сравнению со случаем, когда значения pH устанавливается на уровне 7,5.

Таблица 2. Влияние соотношения TDM и масла на выход масла; добавление масла канолы

Первоначальная масса
[г] Исходное масло [г] Добавленное масло [г] Все масло [г] Соотношение масла и TDM Извлечение масла при pH 7,5 Выход при pH 7,5 1008 134,1 0 134,1 0,42 125,7 93,7% 1008 134,1 171,2 305,3 0,60 290,4 95,1%

Экспериментальные данные демонстрируют, что эффект, который достигался посредством рециркуляции масла из Schizochytrium, можно также осуществлять посредством добавления растительных масел, в частности масла канолы.

Таблица 3. Влияние соотношения TDM и масла на выход масла; добавление соевого масла

Первоначальная масса
[г] Исходное масло [г] Добавленное масло [г] Все масло [г] Соотношение масла и TDM Извлечение масла при pH 7,5 Выход при pH 7,5 1004 133,9 0 133,9 0,42 125,3 93,6% 1000 133,9 173,2 305,3 0,60 291,7 95,0%

Экспериментальные данные демонстрируют, что эффект, который достигался посредством рециркуляции масла из Schizochytrium, можно также осуществлять посредством добавления соевого масла.

Изобретение относится к пищевой промышленности. Способ выделения липида, содержащего полиненасыщенные жирные кислоты (PUFA), из биомассы, предусматривающий следующие стадии: a) обеспечение суспензии биомассы, содержащей клетки, которые содержат липид, содержащий PUFA; b) лизирование клеток биомассы, по меньшей мере частичное; c) концентрирование суспензии до общего содержания сухого вещества (TDM), составляющего от 20 до 60 вес. %, если суспензия характеризуется более низким содержанием TDM; d) регулирование температуры в суспензии от 20°C до 100°C; e) поддержание температуры в диапазоне, указанном в (d), в течение по меньшей мере 0,5 часа при добавлении всего от 7,5 до 25 моль эквивалента основания к 10 кг всего сухого вещества, содержащегося в суспензии; f) регулирование значения pH от 5,0 до 8,5 и инкубирование в течение периода от 0,1 до 6 часов; g) отделение содержащей масло легкой фазы от содержащей воду, соль, оставшееся масло и клеточный дебрис тяжелой фазы путем центрифугирования. При этом в суспензию после стадии (b), но перед стадией (g), добавляют масло, вследствие чего соотношение масла и общего содержания сухого вещества (TDM) достигает значения по меньшей мере 0,5. Способ выделения липида, содержащего полиненасыщенные жирные кислоты (PUFA), из биомассы, предусматривающий следующие стадии: a) ферментирование продуцирующих PUFA клеток, пока соотношение масла и общего содержания сухого вещества (TDM) в ферментационном бульоне не достигнет значения по меньшей мере 0,5; b) лизирование клеток биомассы, по меньшей мере частичное; c) концентрирование суспензии до общего содержания сухого вещества (TDM), составляющего от 20 до 60 вес. %, если суспензия характеризуется более низким содержанием TDM; d) регулирование температуры в суспензии от 20°C до 100°C; e) поддержание температуры в диапазоне, указанном в (d), в течение по меньшей мере 0,5 часа при добавлении всего от 7,5 до 25 моль эквивалента основания к 10 кг всего сухого вещества, содержащегося в суспензии; f) регулирование значения pH от 5,0 до 8,5 и инкубирование в течение периода от 0,1 до 6 часов; g) отделение содержащей масло легкой фазы от содержащей воду, соль, оставшееся масло и клеточный дебрис тяжелой фазы путем центрифугирования. 11 з.п. ф-лы, 3 табл.

1. Способ выделения липида, содержащего полиненасыщенные жирные кислоты (PUFA), из биомассы, предусматривающий следующие стадии:

a) обеспечение суспензии биомассы, содержащей клетки, которые содержат липид, содержащий PUFA;

b) лизирование клеток биомассы, по меньшей мере частичное;

c) концентрирование суспензии до общего содержания сухого вещества (TDM), составляющего от 20 до 60 вес. %, если суспензия характеризуется более низким содержанием TDM;

d) регулирование температуры в суспензии от 20°C до 100°C;

e) поддержание температуры в диапазоне, указанном в (d), в течение по меньшей мере 0,5 часа при добавлении всего от 7,5 до 25 моль эквивалента основания к 10 кг всего сухого вещества, содержащегося в суспензии;

f) регулирование значения pH от 5,0 до 8,5 и инкубирование в течение периода от 0,1 до 6 часов;

g) отделение содержащей масло легкой фазы от содержащей воду, соль, оставшееся масло и клеточный дебрис тяжелой фазы путем центрифугирования;

характеризующийся тем, что в суспензию иногда после стадии (b), но перед стадией (g), добавляют масло, вследствие чего соотношение масла и общего содержания сухого вещества (TDM) достигает значения по меньшей мере 0,5.

2. Способ по п. 1, где масло, которое добавляют в суспензию, представляет собой микробное масло, или растительное масло, или их смесь.

3. Способ выделения липида, содержащего полиненасыщенные жирные кислоты (PUFA), из биомассы, предусматривающий следующие стадии:

a) ферментирование продуцирующих PUFA клеток, пока соотношение масла и общего содержания сухого вещества (TDM) в ферментационном бульоне не достигнет значения по меньшей мере 0,5;

b) лизирование клеток биомассы, по меньшей мере частичное;

c) концентрирование суспензии до общего содержания сухого вещества (TDM), составляющего от 20 до 60 вес. %, если суспензия характеризуется более низким содержанием TDM;

d) регулирование температуры в суспензии от 20°C до 100°C;

e) поддержание температуры в диапазоне, указанном в (d), в течение по меньшей мере 0,5 часа при добавлении всего от 7,5 до 25 моль, эквивалента основания к 10 кг всего сухого вещества, содержащегося в суспензии;

f) регулирование значения pH от 5,0 до 8,5 и инкубирование в течение периода от 0,1 до 6 часов;

g) отделение содержащей масло легкой фазы от содержащей воду, соль, оставшееся масло и клеточный дебрис тяжелой фазы путем центрифугирования.

4. Способ по п. 1 или 3, где pH на стадии (e) поддерживают на уровне ниже 11,5.

5. Способ по любому из предыдущих пунктов, где основание выбрано из гидроксидов, и/или карбонатов, и/или бикарбонатов.

6. Способ по п. 1, где суспензия, полученная на стадии (a), уже характеризуется общим содержанием сухого вещества, составляющим от 20 до 60 вес. %.

7. Способ по любому из предыдущих пунктов, где для лизирования клеток не применяют солей или применяют лишь малые их количества, где термин «малые количества» означает, что соли добавляют в количестве менее 0,1 г/л ферментационного бульона.

8. Способ по любому из предыдущих пунктов, где для лизирования клеток не применяют органических растворителей или применяют лишь малые их количества, где термин «малые количества» означает, что органические растворители добавляют в количестве менее 0,1 г/л ферментационного бульона.

9. Способ по любому из предыдущих пунктов, где суспензию обеспечивают в виде ферментационного бульона.

10. Способ по любому из предыдущих пунктов, где клетки, которые содержат липид, содержащий PUFA, выбраны из водорослей, грибов, простейших, бактерий, микроводорослей, растительных клеток и их смесей.

11. Способ по п. 10, где микроводоросли выбраны из царства Stramanopiles.

12. Способ по п. 11, где микроводоросли из царства Stramanopiles выбраны из семейства Thraustochytrids.