СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛИПИДОВ (ВАРИАНТЫ) И ЛИПИДЫ, ПОЛУЧЕННЫЕ ЭТИМ СПОСОБОМ Российский патент 2008 года по МПК C12P7/64 C12P1/02 C12N1/14 C12N1/00 C12R1/00 

Область применения настоящего изобретения

Настоящее изобретение касается процесса экстракции липидов из микроорганизмов, который проводят без использования какого-либо значительного количества неполярного органического растворителя.

Предпосылки настоящего изобретения

Стандартный процесс получения липидов из микроорганизмов, типа получения сильно ненасыщенной жирной кислоты омега-3, в частности липидной смеси с большим содержанием докозагексаеновой кислоты (ДГК), включает: культивирование микроорганизмов, способных продуцировать в ферментере, водоеме или биореакторе требуемый липид, выделение полученной биомассы микроорганизмов, ее высушивание и экстракцию внутриклеточных липидов неполярным органическим растворителем, например гексаном. Обычно внутриклеточные липиды микроорганизмов экстрагируют после захвата (а именно лизиса) высушенных клеток микроорганизмов. Потом эти экстрагированные липиды можно очистить с тем, чтобы получить липиды высокой степени чистоты и/или качества. Обычно микроорганизмы выделяют в течение первого разведения водой ферментационного бульона и центрифугирования полученной смеси (для выделения микроорганизмов). Полученные клетки затем высушивают, а если липиды не экстрагируются тотчас или вскоре после этого, то для предотвращения деструкции липидов эти клетки упаковывают, например, в герметичные пакеты.

Однако при таком процессе сушки микроорганизмы подвергают нагреванию, которое может причинить вред, а именно при неправильном его проведении снизить качество липидов. В герметичных пакетах могут возникнуть протечки, что в дальнейшем из-за воздействия на микроорганизмы воздуха может снизить качество липидов. Помимо этого, если высушенные микроорганизмы не обработать антиоксидантом, то под воздействием воздуха или света деструкция липидов может продолжиться. Например, каротеноиды, ксантофиллы и жирные кислоты с длинной цепью (типа докозагексаеновой кислоты) могут подвергаться деструкции из-за окисления воздухом и/или светом. Далее, в некоторых случаях у операторов, подвергающихся воздействию указанных высушенных микроорганизмов, могут появляться аллергические реакции, которые создают риск безопасности и здоровью операторов.

Более того, большие количества летучего и горючего неполярного органического растворителя, используемые для экстракции липидов в промышленном производстве, могут создать опасные условия эксплуатации. При использовании в процессе экстракции неполярного органического растворителя может потребоваться взрывостойкая система регенерации масла, что увеличит стоимость извлечения липидов. Помимо этого, применение неполярного органического растворителя для экстракции липидов из микроорганизмов создает отработанный поток указанного растворителя, что требует надлежащий способ утилизации, а это дополнительно увеличивает общую стоимость процесса экстракции липидов.

Следовательно, существует необходимость в таком процессе экстракции липидов из микроорганизмов, который бы не требовал применения неполярного органического растворителя. Необходим также такой процесс экстракции липидов из микроорганизмов, который бы не требовал дорогостоящей стадии высушивания этих микроорганизмов перед проведением экстракции.

Краткое содержание настоящего изобретения

Один вариант настоящего изобретения обеспечивает процесс получения липидов из микроорганизмов, включающий:

(а) лизис клеток микроорганизмов в целях получения смеси растворенных клеток;

(б) обработку указанной смеси растворенных клеток в целях получения смеси с разделенными фазами, включающей тяжелый слой и легкий слой с большим содержанием липидов;

(в) отделение указанного тяжелого слоя от легкого слоя с большим содержанием липидов; а также

(г) получение липида и/или липидных фракций из указанного легкого слоя.

Другой вариант настоящего изобретения обеспечивает процесс получения липидов из микроорганизмов, включающий:

(а) культивирование микроорганизмов в культуральной среде;

(б) обработку указанной культуральной среды и клеток микроорганизмов для высвобождения внутриклеточных липидов;

(в) воздействие на указанную культуральную среду, содержащую высвобожденные внутриклеточные липиды, методом гравитационного разделения в целях получения легкой фракции, содержащей липиды, и тяжелой фракции;

(г) отделение указанной легкой фракции от указанной тяжелой фракции;

(д) обработку указанной легкой фракции в целях разрушения эмульсии, образованной указанными липидами и водой; а также

(е) извлечение сырого липида.

В соответствии с другим вариантом настоящего изобретения обеспечивается процесс извлечения липидов из микроорганизмов, включающий стадии:

(а) культивирования микроорганизмов в культуральной среде;

(б) обработки клеток микроорганизмов из указанной культуральной среды без высушивания указанных клеток для высвобождения внутриклеточных липидов;

(в) воздействие на культуральную среду, содержащую высвобожденные внутриклеточные липиды, методом гравитационного разделения в целях получения легкой фракции, содержащей липиды, и тяжелой фракции;

(г) отделения указанной легкой фракции от указанной тяжелой фракции;

(д) обработки указанной легкой фракции в целях разрушения эмульсии, образованной указанными липидами и водой; а также

(е) извлечения сырого липида.

Предпочтительно, чтобы указанные микроорганизмы культивировали в ферментационной среде в ферментере. Или же микроорганизмы можно культивировать фотосинтетически в фотобиореакторе или в водоеме. Предпочтительно, чтобы этими микроорганизмами были микроорганизмы с большим содержанием липида; более предпочтительно, чтобы их выбирали из группы, включающей водоросли, бактерии, грибы и простейшие одноклеточные организмы; более предпочтительно, чтобы указанные микроорганизмы выбирали из группы, содержащей золотые водоросли, зеленые водоросли, диножгутиконосцы, дрожжи, грибы рода Mortierella и Stramenopiles. Предпочтительно, чтобы эти микроорганизмы содержали микроорганизмы рода Mortierella, рода Crypthecodinium, и отряда Thraustochytriales, а более предпочтительно, чтобы микроорганизмы выбирали из рода Thraustochytrium, Schizochytrium, или из их смесей; более предпочтительно, чтобы эти микроорганизмы выбирали из группы, содержащей микроорганизмы с идентификационными характеристиками АТСС номер 20888, АТСС номер 20889, АТСС номер 20890, АТСС номер 20891 и АТСС номер 20892, штаммы Mortierella schmuckeri, штаммы Crypthecodinium cohnii, мутантные штаммы, полученные из вышеприведенных штаммов или из их смесей.

Обработка указанных клеток включает обработку типа лизиса, распада или нарушения проницаемости клеточной мембраны, проводимую для высвобождения липидов. Согласно использованию здесь термины "растворение", "разложение", "подвергнутые лизису" и т.д. будут касаться обработки (включая разрушение клеток или нарушение проницаемости клеточной мембраны), целью которой является высвобождение внутриклеточных липидов. Предпочтительно, чтобы такую обработку выбирали из группы процессов, которая включает нагревание клеток, воздействие на них щелочными условиями, действие на клеток хелатными соединениями или их комбинациями. Более предпочтительно, чтобы лизис или разрушение клеток включало нагревание этих клеток по крайней мере до 50°С и чтобы при этом на указанные клетки воздействовали щелочными условиями, хелатными соединениями или их смесями.

Предпочтительно, чтобы гравитационное разделение включало прохождение ферментационного бульона, содержащего высвобожденные внутриклеточные липиды, через центрифугу (типа центрифуги с пакетированным диском, сепараторной или декантирующей центрифуги).

Выделенная и прошедшая лизис смесь клеток состоит из тяжелого слоя, включающего водный раствор, который содержит твердые вещества, полученные из указанных прошедших лизис клеток, а также из содержащего липиды легкого слоя. Эти легкие и тяжелые слои можно разделить центрифугированием. Липиды могут находиться в эмульгированном состоянии. Поэтому в дальнейшем легкий слой можно промывать водным промывочным раствором до тех пор, пока липиды не станут в значительной степени неэмульгированными. Предпочтительно, чтобы обработка по разрушению эмульсии включала смешивание эмульсии с водой, спиртом, ацетоном или их смесями, а также воздействие на эту смесь методом гравитационного разделения. Предпочтительно, чтобы указанный процесс осуществлялся без применения неполярных органических растворителей, таких как гексан.

В случае, если экстракция липида по настоящему изобретению включает использование микроорганизмов из ферментационного процесса, то такая экстракция может также включать солюбилизацию в ферментационном бульоне по крайней мере части белковоподобных соединений. Этот процесс проводят добавлением основания, выбранного из группы, включающей гидроксиды, карбонаты, бикарбонаты, фосфаты и их смеси.

Процесс по настоящему изобретению может также включать нагревание микроорганизмов до температуры, составляющей по крайней мере приблизительно 50°С. Предпочтительно, чтобы для содействия лизису клеток в культуральную среду добавляли химическое соединение, типа основания.

В качестве альтернативы нагреванию указанных клеток их можно подвергнуть лизису с использованием хелатного соединения, такого как этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТК). В дополнение к тому, что указанные хелатные соединения содействуют лизису или разрушению клеток, они способствуют предотвращению окисления липидов путем внутреннего комплексообразования (связывания) свободных радикалов, продуцируемых в ферментационном бульоне ионами металлов (типа железа или меди). Предпочтительными формами хелатов являются такие, которые считаются пищевыми соединениями или официально признаны безопасными. Эффективные хелатные соединения включают этилендиаминтетрауксусную кислоту, лимонную кислоту или цитраты, молочную кислоту, тринатрийфосфат, полифосфат, гексаметафосфат, этиленгликольтетрауксусную кислоту, диэтилентриаминпентауксусную кислоту, фитиновую кислоту или цетилдиметилтетрауксусную кислоту (CDTA) или другие соли этих соединений. В одном варианте настоящего изобретения натрий этилендиаминтетрауксусную кислоту добавляют к клеткам для разрушения их стенок за счет внутреннего комплексообразования двухвалентных катионов, которые способствуют удержанию стенок клеток. Этот процесс можно осуществлять при более высоких температурах с меньшим количеством ЭДТК или при более низких температурах и большем количестве ЭДТК. Например, было установлено, что проницаемость клеточной мембраны клеток Schizochytrium sp., имеющих большое содержание докозагексаеновой кислоты (ДГК), может быть нарушена и/или что эти клетки можно разрушить, добавив к этим культурам в конце процесса ферментации ЭДТК. Концентрация, составляющая 10,000×10^-6 необходима для содействия распаду клеток при 30°С, концентрация в 5,000×10^-6 эффективна при температуре 50°С, а при температурах свыше 70°С - эффективна концентрация ниже 1000×10^-6. Для того чтобы с помощью химических процессов (типа гомогенизации) сделать разрушение клеток более легким, в ферментационный бульон можно добавлять хелатные соединения. Помимо хелатных соединений в целях увеличения внешнего осмотического давления можно также добавлять воду для того, чтобы растворить клетки.

Предпочтительно, чтобы микроорганизмы были способны расти при степени минерализации, составляющей меньше приблизительно 12 г/л хлорида натрия, более предпочтительна степень минерализации меньше приблизительно 5 г/л хлорида натрия, а наиболее предпочтительна степень минерализации меньше приблизительно 3 г/л хлорида натрия. Предпочтительно, чтобы микроорганизмы были способны расти при степени минерализации, составляющей меньше приблизительно 7 г/л натрия и меньше приблизительно 250 мг/л хлорида. Предпочтительно, чтобы содержание хлорида составляло от приблизительно 70 до приблизительно 150 мг/л.

Предпочтительно, чтобы содержание липида по весу в микроорганизмах составляло по крайней мере приблизительно 20%, более предпочтительно по крайней мере приблизительно 30%, а наиболее предпочтительно - по крайней мере приблизительно 40%. Или же, чтобы по крайней мере приблизительно 20% липида составляли: холестерин, фитостерины, десмостерол, токотриенолы, токоферолы, убихиноны, каротеноиды и ксантофиллы, типа β-каротина, лутеина, ликопена, астаксантина, зеаксантина, кантаксантина, и жирные кислоты типа сопряженных линолевых кислот, а также омега-3 и омега-6 сильно ненасыщенные жирные кислоты, типа эйкозапентаеновой кислоты, докозапентаеновой кислоты и докозагексаеновой кислоты, арахидоновой кислоты, стеаридоновой кислоты, дигомо-γ-линоленовой кислоты и γ-линоленовой кислоты или их смеси; предпочтительно, чтобы это количество было по крайней мере приблизительно 30%, а более предпочтительно - по крайней мере приблизительно 40%.

В одном конкретном аспекте настоящего изобретения микроорганизмы способны продуцировать по крайней мере приблизительно 0,1 г на 1 л в час смеси липидов, предпочтительно включающей холестерин, фитостерины, десмостерол, токотриенолы, токоферолы, убихиноны, каротеноиды и ксантофиллы, типа β-каротина, лутеина, ликопена, астаксантина, зеаксантина, кантаксантина, и жирные кислоты типа сопряженных линолевых кислот, а также омега-3 и омега-6 сильно ненасыщенные жирные кислоты, типа эйкозапентаеновой кислоты, докозапентаеновой кислоты и докозагексаеновой кислоты, арахидоновой кислоты, стеаридоновой кислоты, дигомо-γ-линоленовой кислоты и γ-линоленовой кислоты или их смеси; более предпочтительно, чтобы их количество составляло по крайней мере приблизительно 0,2 г/л/ч, еще более предпочтительно - по крайней мере приблизительно 0,3 г/л/ч, а наиболее предпочтительно - приблизительно 0,4 г/л/ч.

В другом аспекте настоящего изобретения микроорганизмы выбирают из группы, включающей водоросли, грибы, бактерии и простейшие одноклеточные организмы. Предпочтительно, чтобы этими микроорганизмами были микроорганизмы рода Thraustochytriales. Более предпочтительно, чтобы эти микроорганизмы выбирали из рода Thraustochytrium, Schizochytrium, или из их смесей. А наиболее предпочтительно, чтобы микроорганизмы выбирали из группы, содержащей микроорганизмы с идентификационными характеристиками АТСС номер 20888, АТСС номер 20889, АТСС номер 20890, АТСС номер 20891 и АТСС номер 20892, мутантные штаммов, полученные из вышеприведенных штаммов или из их смесей. Предпочтительно, чтобы эти микроорганизмы выбрали из группы, включающей микроорганизмы с идентификационными характеристиками АТСС номер 20888, АТСС номер 20889, а более предпочтительно - АТСС номер 20888, штаммы Mortierella schmuckeri, штаммы Crypthecodinium cohnii, мутантные штаммы, полученные из вышеприведенных штаммов и их смесей.

Краткое описание чертежей

На чертеже приведена последовательность технологических операций (технологическая маршрутная карта) для одного из вариантов процесса экстракции без растворителя по настоящему изобретению.

Подробное описание настоящего изобретения

Настоящее изобретение касается процесса экстракции, извлечения или получения липидов из микроорганизмов. Процесс по настоящему изобретению применим для экстракции липидов, содержащих холестерин, фитостерины, десмостерол, токотриенолы, токоферолы, убихиноны, каротеноиды и ксантофиллы, типа β-каротина, лутеина, ликопена, астаксантина, зеаксантина, кантаксантина, и жирные кислоты типа сопряженных линолевых кислот, а также омега-3 и омега-6 сильно ненасыщенные жирные кислоты, типа эйкозапентаеновой кислоты, докозапентаеновой кислоты и докозагексаеновой кислоты, арахидоновой кислоты, стеаридоновой кислоты, дигомо-γ-линоленовой кислоты и γ-линоленовой кислоты или их смеси; более предпочтительны сильно ненасыщенные жирные кислоты омега-3 типа докозагексаеновой кислоты (ДГК), эйкозапентаеновой кислоты (ЭПК) и/или докозапентаеновой кислоты (ДПК) (а именно омега-6 форма ДПК) из микроорганизмов, продуцирующих те же соединения. Примеры микроорганизмов, продуцирующих относительно большие количества омега-3 сильно ненасыщенных жирных кислот раскрыты в патенте США No. 5,340,594 и в патенте США No. 5,340,742 (оба принадлежат Barclay), а примеры микроорганизмов, продуцирующих сравнительно большие количества арахидоновой кислоты раскрыты в патенте США No. 5,583,019 (принадлежит Barclay). Ссылки на все упомянутые выше патенты включены здесь во всей своей полноте.

Однако для краткости детальное описание настоящего изобретение в целях удобства и для иллюстрации приведено для случая экстракции липидов, содержащих омега-3 сильно ненасыщенные жирные кислоты из микроорганизмов, которые продуцируют те же соединения, в частности, для случая экстракции липидов из микроорганизмов, продуцирующих относительно высокое количество докозагексаеновой кислоты (ДГК). Следует однако понимать, что в целом настоящее изобретение не предназначено для такого ограничения, поэтому каждый квалифицированный в данной технологии должен признать, что концепция настоящего изобретения будет применима к другим микроорганизмам, продуцирующим разнообразные липидные составы в соответствии с обсуждаемой здесь технологией. Эти микроорганизмы включают такие микроорганизмы, как грибы, простейшие одноклеточные организмы, водоросли и бактерии, продуцирующие разнообразные липиды, такие как фосфолипиды, свободные жирные кислоты, эфиры жирных кислот, включая триглицериды жирных кислот, стерины, пигменты (например, каротеноиды и оксикаротеноиды) и другие липиды, а также соединения, связанные с липидами, типа фитостеринов, эрготионина, липоевой кислоты и антиоксидантов, включая β-каротин, токотриенолы и токоферол. Предпочтительные липиды и связанные с липидами соединения включают (но ими не ограничены): холестерин, фитостерины, десмостерол, токотриенолы, токоферолы, убихиноны, каротеноиды и ксантофиллы, типа β-каротина, лутеина, ликопена, астаксантина, зеаксантина, кантаксантина, и жирные кислоты, типа сопряженных линолевых кислот, а также омега-3 и омега-6 сильно ненасыщенные жирные кислоты, типа эйкозапентаеновой кислоты, докозапентаеновой кислоты и докозагексаеновой кислоты, арахидоновой кислоты, стеаридоновой кислоты, дигомо-γ-линоленовой кислоты и γ-линоленовой кислоты или их смеси. Для краткости, в случае, если иного не оговорено, термин "липид" относится к липиду и/или связанному с липидом соединению. Другие липиды и микроорганизмы, которые могут быть пригодны для применения в настоящем изобретении, непременно будут очевидны квалифицированным в этой технологии людям.

Стандартный процесс получения микробного липида (в частности масла, содержащего омега-3 сильно ненасыщенную жирную кислоту, типа докозагексаеновой кислоты (ДГК)) включает: культивирование в ферментере микроорганизмов, продуцирующих докозагексаеновую кислоту (ДГК), выделение микроорганизмов, сушку биомассы микроорганизмов и экстракцию полученных внутриклеточных липидов неполярным органическим растворителем (например гексаном). Обычно экстрагированный липид затем подвергают очистке, чтобы получить липид высокой чистоты и/или качества. Выделение микроорганизмов включает разбавление водой ферментационного бульона и центрифугирование полученной смеси для выделения микроорганизмов. Если липиды не экстрагируются тотчас и вскоре после выделения микроорганизмов, то выделенные микроорганизмы обычно высушивают (например, в барабанной сушилке) и герметично упаковывают (например, в герметичные пакеты) для того, чтобы предотвратить деструкцию липидов. Однако при таком процессе сушки микроорганизмы подвергают нагреванию, которое может причинить вред, а именно при неправильном его проведении снизить качество липидов. В герметичных пакетах могут возникнуть протечки, что в дальнейшем, из-за воздействия воздуха на микроорганизмы, может снизить качество липидов. Помимо этого, если высушенные микроорганизмы не обработать антиоксидантом, то под воздействием воздуха или света деструкция липидов может продолжиться.

Извлечение неочищенного масла непосредственно из ферментационного бульона избавляет от этих проблем. Исключение стадии экстракции неполярным растворителем снижает производственные затраты, а также исключает воздействие на оператора высушенных микроорганизмов, которое у некоторых субъектов может вызывать аллергическую реакцию.

Настоящее изобретение обеспечивает способ получения липидов из микроорганизмов при использовании экстракции, в существенной степени свободной от применения неполярного органического растворителя, а именно процесса экстракции без растворителя. Термин "процесс экстракции без растворителя" относится к экстракции, которая проходит с использованием водного или полярного растворителя, причем указанный водный или полярный растворитель содержит менее приблизительно 5% неполярного органического растворителя, предпочтительно менее приблизительно 4%, более предпочтительно менее приблизительно 2%, а наиболее предпочтительно менее приблизительно 1%. Однако на технологических стадиях, типа процесса очистки, использование растворителей возможно. Процесс по настоящему изобретению может включать получение или выделение микроорганизмов предпочтительно из процесса ферментации. В отличие от предыдущих процессов, типа экстракции масла из бобов сои, при которых бобы должны быть высушенными, процесс по настоящему изобретению не требует проведения стадии высушивания до процесса экстракции. Таким образом, процессы по настоящему изобретению применимы к экстракции липидов из биомассы микроорганизмов, которая содержит, по крайней мере, приблизительно 10% по весу захваченной воды, предпочтительно, по крайней мере, приблизительно 20%, более предпочтительно, по крайней мере, приблизительно 30%, а наиболее предпочтительно, по крайней мере, приблизительно 50%. Если микроорганизмы получают из процесса ферментации, то процесс по настоящему изобретению может включать добавление в ферментационный бульон основания в целях растворения любых белковоподобных соединений, присутствие которых в этом бульоне возможно. Основаниями являются вещества, демонстрирующие в водных растворах щелочную (основную) реакцию, а именно они присоединяют протоны и диссоциируют ионы гидроксида. Эти основания могут быть достаточно сильными, чтобы гидролизовать, по крайней мере, часть белковоподобных веществ, которые могут находиться в указанном бульоне, или осуществить их солюбилизацию. Основания, пригодные для солюбилизации белков, хорошо известны имеющим навык в химической технологии людям. Примеры оснований, пригодных для процессов по настоящему изобретению, включают (но ими не ограничены): гидроксиды, карбонаты и бикарбонаты лития, натрия, калия, кальция и карбонат магния. Можно также использовать другие соединения с очень сильными основными свойствами, типа основных фосфатных солей, таких как тринатрийфосфат.

Процесс по настоящему изобретению может также включать захват или лизис клеток микроорганизмов для высвобождения липидов, находящихся внутри этих клеток. Клетки можно подвергнуть лизису любым известным способом, включая химический, термический и механический методы, которые включают применение (но ими не ограничены): французского пресса, мельниц, ультразвуковой обработки, гомогенизации и парового взрыва, а также их комбинации. При термическом лизисе клеток ферментационный бульон, содержащий микроорганизмы, нагревают до тех пор, пока клетки микроорганизмов, а именно стенки их клеток, не подвергнутся деструкции или не разрушатся. Обычно ферментационный бульон нагревают до температуры, составляющей по крайней мере приблизительно 50°С, предпочтительно по крайней мере приблизительно до 75°С, более предпочтительно по крайней мере приблизительно до 100°С, а наиболее предпочтительно - по крайней мере приблизительно до 130°С. Важной чертой указанного процесса является поддержание температуры ниже такого значения, при котором может произойти деструкция экстрагированных липидов. Для микроорганизмов, стенки которых состоят из белков, особенно пригоден термический лизис стенок клеток микроорганизмов. Во время этого процесса в целях предотвращения окисления липидов кислородом верхнюю часть ферментера можно заполнить азотом или другим инертным газом.

Нагревание бульона также денатурирует белки и способствует солюбилизации органических веществ, включая белки. Стадию нагревания ферментационного бульона можно осуществить любым известным способом, включая применение поточного теплообменника, а предпочтительно разбрызгиванием пара внутрь ферментационного бульона и поддерживанием указанного бульона при необходимой температуре в течение времени, меньшего чем приблизительно 90 мин, предпочтительно меньшего чем приблизительно 60 мин. А более предпочтительно - меньшего чем приблизительно 30 мин.

Процесс экстракции без растворителя по настоящему изобретению может включать также, по крайней мере, частичное отделение отработанного ферментационного бульона от липидов. Обычно это достигают центрифугированием (например, пропусканием указанного бульона через центрифугу с пакетированным диском, сепараторную или декантирующую центрифугу) и сбором липидов в виде эмульсионной фазы. Центрифугирование смеси дает двухфазную систему, содержащую тяжелый слой и легкий слой. Обычно тяжелый слой находится в водной фазе, содержащей большее количество клеточных фрагментов. Легкий слой, который содержит эмульгированные липиды, разбавляют водой, вновь выделяют двухфазную смесь, а затем легкий слой снова отделяют. Такое разведение водой, процессы отделения и выделения (а именно процессы промывки) можно проводить в непрерывном режиме, подавая воду и отделяя тяжелый слой на протяжении всего процесса, или же эти процессы можно осуществлять как дискретные стадии. Процесс промывки обычно повторяют до тех пор, пока не будет получен значительный слой неэмульгированного липида, хотя незначительные количества эмульсии могут сохраняться. Полагают, что поверхность раздела масло-вода указанной эмульсии стабилизирует остатки клеточных фрагментов, которые удаляют при промывании. Во время промывания в целях увеличения содержания липида добавляемое избыточное количество воды снижают. Если снижение количества подаваемой воды проводится слишком быстро, то это может привести к потере липидов в водной фазе; слишком медленное снижение подаваемой воды приводит к неэффективности процесса промывки. Определить требуемую скорость снижения подачи воды нетрудно, наблюдая за выделенным водным слоем или при анализе его. Обычно липидный слой, а именно легкий слой, окрашен, поэтому требуемую скорость снижения подачи воды легко определить, просто анализируя окраску водного слоя, который отделили от указанного липидного слоя, или наблюдая за этой окраской.

Или же, и это предпочтительно, эмульсию можно разрушить и извлечь масло, используя процесс обезжиривания, описанный в патенте WO 96/05278, полная ссылка на который приведена. В этом процессе растворимое в воде соединение, например спирт и/или ацетон, добавляют в эмульсию масло-вода для ее разрушения, а полученную в результате этого смесь разделяют центрифугированием. Выделенный липид можно впоследствии очистить, используя процесс, аналогичный процессу, применяемому для очистки обычного растительного масла. Вкратце, процесс очистки липида обычно включает гидратирование фосфолипидов путем добавления к липиду фосфорной кислоты с последующим введением гидроксида натрия для нейтрализации свободных жирных кислот. Эти соединения удаляют центрифугированием. Затем следует стадия промывки водой для того, чтобы продолжить удаление любых оставшихся в липиде количеств гидрированных фосфолипидов ("смолы") и нейтрализованных жирных кислот ("мыльный полупродукт"). Полученный в результате липид отбеливают с помощью Trysil™ и обычной отбеливающей глины. Для того чтобы удалить двухвалентные ионы металла с помощью внутреннего комплексообразования, добавляют также и лимонную кислоту. Затем Trysil™ и отбеливающую глину удаляют фильтрацией с получением очищенного липида. Прошедший отбеливание липид можно отфильтровать на холоде, чтобы удалить соединения с высокой температурой плавления, присутствие которых в указанном липиде возможно; однако эта стадия обычно редко бывает необходима.

Полученный в результате липид можно дополнительно очистить, удалив любые низкомолекулярные компоненты, присутствие которых возможно. Обычно такие соединения удаляют, разбрызгивая пар при высоких температурах и под высоким вакуумом. Этот процесс разрушает также любые пероксидные связи, присутствие которых возможно, а также снижает или удаляет посторонние запахи и помогает улучшить стабильность масла. К полученному при этом дезодорированному липиду в целях увеличения стабильности продукта можно потом добавить антиоксидант.

В процессе очистки выделенный липид можно демаргаринизировать для того, чтобы удалить соединения с высокой температурой плавления, типа насыщенных жирных кислот. Процесс демаргаринизирования обычно включает растворение выделенного липида в органическом растворителе (например, в гексане), охлаждение полученного органического раствора, а также его фильтрование для удаления из липидной или стеариновой фазы компонентов с высокой температурой плавления. В результате процесса демаргаринизирования обычно получают прозрачный липид, особенно если выделенный липид был мутным или непрозрачным.

Следует принять во внимание, что использование такого растворителя, как гексан, приемлемо в процессах типа описанного выше процесса очистки. Или же, выделенный липид можно охладить, а затвердевшие примеси можно отфильтровать без использования растворителя.

Описанный выше процесс очистки, отбеливания и дезодорирования следует использовать для липидных смесей с большим содержанием триглицерида. Или же, в дополнение к этому процессу можно разделить и очистить другие липиды, например пигменты или каротеноиды, это можно сделать, к примеру, методом распределения между различными растворителями, методами хроматографии и т.д.

Наряду с тем, что настоящее изобретение может включать выделение микроорганизмов из процесса ферментации, одним из преимуществ этого изобретения является то, что оно допускает проведение в одной и той же емкости процессов ферментации микроорганизмов и выделения липидов. Например, после ферментации в ферментационную емкость можно добавить основание и нагреть полученную смесь для того, чтобы осуществился лизис клеток. После разделения фазы на тяжелый и легкие слои указанный легкий слой можно перенести в другую емкость для последующей обработки или же указанный тяжелый слой можно удалить из ферментационной емкости (например, дренированием сквозь дно ферментационной емкости), а оставшийся легкий слой можно подвергнуть дальнейшей обработке внутри той же самой ферментационной емкости.

Если концентрация липидов в клетках культуры микроорганизма высока (например, выше приблизительно 20%), но концентрация клеток низкая (например, менее чем приблизительно 40 г/л), как в случае клеток, выросших в системе непрерывной ферментации, или в культурах, затрудненных для роста клеток (например, хрупких), или в культурах, фотосинтетически продуцированных в культуральных системах, то при необходимости эти клетки можно сконцентрировать (например, центрифугированием, фильтрованием или осаждением), прежде чем применять способы по настоящему изобретению.

При изучении приведенных далее примеров, которые не следует считать ограничительными, людям, квалифицированным в этой технологии, должны стать очевидными другие цели, преимущества и новые характеристики настоящего изобретения.

Примеры

Воспроизводимость процесса характеризовали получением из неочищенного масла трех образцов полностью очищенного масла, образцы были приготовлены с использованием нового процесса экстракции без растворителя. Образец, полученный экстракцией гексаном, также подвергли полной очистке с тем, чтобы использовать его как контрольный. Стадии ферментации, экстракции и выделения масла проводили в больших масштабах, в то время как исследование очистки масла осуществляли в небольшом масштабе.

Чтобы показать воспроизводимость процесса были проанализированы полностью очищенные образцы масла.

Ферментация

Чтобы для последующих процессов экстракции приготовить ферментационный бульон, в ферментере объемом 1200 галлонов культивировали микроорганизмы с большим содержанием масла (Schizochytrium sp.). Одну и ту же порцию использовали, чтобы получить исходный бульон для трех процессов экстракции без растворителя. Ферментации дали возможность протекать на протяжении 94 ч, контролируя при этом концентрацию глюкозы на уровне 13 г/л; после этого срока подачу кукурузного сиропа прекратили. Через 4 ч остаточная концентрация глюкозы снизилась до значения менее 5 г/л. Это произошло к конечному сроку, составляющему 98 ч. Конечный объем бульона составил 958 галлонов. Выход клеток по сухому веществу составил 146 г/л. Ни при проверках в ходе самого процесса, ни при анализе образца конечного бульона не удалось выявить никаких признаков наличия примесей.

Контрольный экстрагированный гексаном образец

Незначительную аликвоту бульона ферментационной порции высушили в барабане, а затем провели ее экстракцию гексаном, чтобы эта аликвота могла служить контрольным образцом. Биомассу полупродукта выделили с помощью двойной барабанной сушилки. Анализ полученного липида приведен в таблице 1.

Таблица 1.
Анализ биомассы Schizochytrium sp., высушенной в барабанеПараметрЗначениеСодержание ДГК (на основе метилового эфира жирных кислот)35,7%Содержание жира62,7%Перекисное число (мэкв/кг)2,6Общий чашечный подсчет (КОЕ/г)<50Содержание ДГК*20,3%Содержание метилового эфира жирных кислот56,9%* на основе веса высушенных клеток

Процесс экстракции без растворителя

Неочищенное масло получали обработкой трех аликвот ферментационного бульона, объем каждой из которых составил приблизительно 400 галлонов. Каждую из этих 400 галлоновых аликвот ферментера обрабатывали отдельно, начав со стадий обработки каустиком/теплом. Каждую аликвоту обрабатывали 45% КОН в количестве 20 г на 1 л и нагревали до 130°С в течение приблизительно 30 мин, пропуская пар через ферментационный бульон. Из обработанного таким образом бульона выделили неочищенное масло, используя для этого промышленную центрифугу Westfalia HFA-100 с пакетированным диском. Общие сведения о различных параметрах процесса приведены в таблице 2, а результаты анализа неочищенного масла приведены в таблице 3.

Таблица 2.
Данные процесса экстракции без растворителя SFE-1SFE-2SFE-3Обработка бульона   Объем обрабатываемого бульона288 галлонов288 галлонов258 галлоновКонечное рН после обработки7,58,08,7Конечный объем после тепловой обработки388 галлонов398 галлонов308 галлоновУвеличение объема за счет конденсата34,7%38,2%19,4%Первое прохождение эмульсии   Общий объем, галлоны180133149Оценка концентрации масла, вес/вес12,0%24,5%16,1%Теоретическая плотность, г/мл0,9860,9910,999Выделение масла   Общее количество неочищенного регенерированного масла (Ib)182165174Номер лота, присвоенный маслу ДГКSF1ASF2ASF3A

Таблица 3.
Анализ лотов масла ДГК из процесса экстракции без растворителяПараметрSF1ASP2ASF3AСодержание ДГК, % метилового эфира жирных кислот39,0%38,6%39,2%Перекисное число, мэкв/кг4,61,82,0Кислотное число, мгКОН/гНет данныхНет данныхНет данныхВлажностьНет данныхНет данныхНет данных

Очистка

Образец каждой из аликвот неочищенного масла был демаргаринизирован, очищен, отбелен и дезодорирован в незначительном масштабе, как это делалось для образца неочищенного масла из контрольного, экстрагированного гексаном экземпляра. В таблице 4 приведены общие данные этих мелкомасштабных экспериментов, в них включена эффективность различных стадий обработки при извлечении. Хотя для стендовых процессов трудно объяснить слишком многое в эффективности извлечения, т.к. имеется тенденция к диспропорционально большим потерям, однако приведенные в таблице 4 величины показывают, что значения, полученные для образцов при экстракции без растворителя, имеют тенденцию быть близкими значениям, измеренным для контрольного, экстрагированного гексаном образца (за одним только исключением, а именно стадии демаргаринизации). Хотя для контрольного экстрагированного гексаном образца эффективность извлечения, наблюдаемая на стадии демаргаринизации, была меньше, чем для остальных трех образцов, но со статистической точки зрения эта разница несущественна. Большие потери на стадии демаргаринизации привели к тому, что общая эффективность извлечения контрольного образца также стала ниже. Полагают, что этот уменьшенный выход не окажет значительного влияния на качество масла в целом. В конечном итоге разница обработок различных образцов масла минимальна.

Таблица 4.
Общие данные процесса с разных стадий очистки масла НЕХ-1SF1ASF2ASF3AУсловия обработки    Общая концентрация45,0%52,9%52,8%45,0%Скорость разбрызгивания пара3,4%3,4%2,5%2,2%Эффективности извлечения    Демаргаринизация80,6%92,3%87,7%85,5%Очистка89,4%84,8%91,8%95,0%Промывка водой90,6%94,5%95,8%81,2%Отбеливание86,1%89,2%87,3%84,1%Дезодорирование97,4%96,1%97,2%97,5%Упаковка88,2%89,7%89,3%95,8%Общая48,2%56,9%58,5%51,8%

Были проанализированы полностью очищенные образцы масла из трех опытов по экстракции без растворителя, а также контрольный образец, прошедший экстракцию гексаном; полученные результаты приведены в таблице 5. Показаны также соответствующие характеристики высвобождения для каждого из параметров.

Образец исходного неочищенного масла из опыта по экстракции без растворителя также проанализировали на содержание железа. Содержание железа в указанном образце составило 0,08×10^-6. Концентрации примесей всех других металлов были ниже соответствующего предела чувствительности.

Таблица 5.
Сравнение результатов качества контроля по относительной биологической выявляемости масла ДГК из процесса экстракции без растворителя и масла, экстрагированного гексаномГексанПроцесс экстракции без растворителяОпыт ID #НЕХ-1SFA1SFA2SFA3     Перекисное число, мэкв/кг0,280,690,350,34Кислотное число, мг КОН/г0,170,110,570,24Влажность и легколетучие вещества0,00%0,06%**0,00%0,00%Примеси металлов, ×10^-6    Свинец<0,20<0,20<0,20<0,20Мышьяк<0,20<0,20<0,20<0,20Железо0,220,210,56***0,02Медь<0,05<0,05<0,05<0,05Ртуть<0,20<0,20<0,20<0,20ДГК, % метилового эфира жирных кислот36,937,337,037,7ДГК, мг/г масла342345343351Гексан, ×10^-6<3<3<3<3* После повторения стадий очистки и отбеливания величина была снижена до 0,22 мг КОН/г.
** Образец был проанализирован аналитической группой San Diego Fermentation Sciences Analytical Group.
*** После повторения стадий очистки и отбеливания величина была снижена до значения <0,02×10^-6.

Данные, приведенные в таблице 6, представляют собой более непосредственное сравнение усредненных результатов анализа трех образцов из процесса экстракции без растворителя и контрольного образца, экстрагированного гексаном.

Таблица 6.
Сравнение средних значенийГексанПроцесс экстракции без растворителяПараметрКонтрольСреднеарифметическоеСреднеквадратичное отклонениеКоэффициент вариацииРазность, %Перекисное число, мэкв/кг0,280,460,2043,3%64,3%Кислотное число, мг КОН/г0,170,19*0,0633,3%11,2%Влажность и легколетучие вещества0,00%0,02%0,03%173%Нет данныхПримеси металлов, ×10^-6     Свинец<0,20<0,20Не подсчитаноНе подсчитано0,0%Мышьяк<0,20<0,20Не подсчитаноНе подсчитано0,0%Железо0,220,260,27104%18,2%Медь0,05<0,05Не подсчитаноНе подсчитано0,0%Ртуть<0,20<0,20Не подсчитано Не подсчитано 0,0%ДГК, % метилового эфира жирных кислот36,9%37,3%0,4%0,9%1,1%ДГК, мг/г масла34234641,2%1,2%Гексан, ×10⁶<3<3Не подсчитаноНе подсчитано0,0%* Вычислено с учетом кислотного числа для переработанных образцов

Результаты этого эксперимента ясно показывают, что процесс экстракции без растворителя обладает воспроизводимостью; кроме того, в параметрах характеристики процесса и качества получаемого продукта, липиды, полученные по процессу экстракции без растворителя относительно неразличимы от липидов, полученных экстракцией гексаном. Согласно выявленной тождественности жирных кислот и профилей стерина конечный продукт процесса экстракции без растворителя в существенной степени равноценен липидам, полученным при непрерывном процессе на основе экстракции гексаном.

Настоящее изобретение в своих различных вариантах включает компоненты, способы, процессы, системы и/или устройства в значительной степени изображенные и описанные здесь, включая их различные варианты, сочетания и подгруппы. Квалифицированным в этой технологии людям должно стать ясно, каким образом, после осмысления раскрытия настоящего изобретения, можно его реализовать и использовать. Настоящее изобретение в своих различных вариантах включает обеспечение устройств и процессов при отсутствии объектов, не изображенных или не описанных здесь, или в их различных вариантах, включая отсутствие таких объектов, которые могли быть использованы в более ранних устройствах или процессах (например, для увеличения эксплуатационных характеристик, достижения легкости реализации и/или для снижения ее стоимости).

Приведенное выше обсуждение сделано для описания и иллюстрации настоящего изобретения. Оно не предназначено для ограничения настоящего изобретения по форме или формам, раскрываемым здесь. Хотя описание настоящего изобретения включает описание одного его варианта или большего их числа, а также определенных изменений и модификаций, в границы настоящего изобретения входят другие изменения и модификации, например те, которые находятся в пределах навыков и знаний в данной технологии после осмысления раскрытия настоящего изобретения. Это описание предназначено для приобретения прав на альтернативные до допустимой степени варианты, включая, помимо заявляемых, противоположные, взаимозаменяемые и/или эквивалентные структуры, функции, диапазоны или стадии, вне зависимости от того, раскрываются ли в этом описании указанные противоположные, взаимозаменяемые и/или эквивалентные структуры, функции, диапазоны или стадии; при этом описание не предназначено для публичного раскрытия какого-либо патентоспособного объекта.

Изобретение относится к биотехнологии. Способ получения липидов из микроорганизмов включает обработку клеток микроорганизмов, выращенных в ферментационной среде для высвобождения внутриклеточных липидов, растворение части присутствующих белков. Разделяют ферментационную среду на слои: тяжелый водный и легкий, содержащий липиды, причем разделение проводят в среде, содержащей менее чем 5% неполярного органического растворителя, при этом не позволяют неполярному органическому растворителю экстрагировать липиды. Далее отделяют тяжелый слой от легкого слоя и получают липиды из легкого слоя. Способ экономичен и прост в осуществлении и позволяет получить качественный продукт. 5 н. и 40 з.п. ф-лы, 6 табл.

1. Способ получения липидов из микроорганизмов, включающий:

а) обработку клеток микроорганизмов, выращенных в ферментационной среде, приводящую к высвобождению внутриклеточных липидов в ферментационную среду и растворения, по меньшей мере, части присутствующих белков;

(б) разделение ферментационной среды, содержащей высвобожденные внутриклеточные липиды на слои: тяжелый водный и легкий, содержащий липиды, причем разделение проводят в среде, содержащей менее чем 5% неполярного органического растворителя, при этом не позволяют неполярному органическому растворителю экстрагировать липиды;

(в) отделение тяжелого слоя от легкого слоя; и

(г) получение липидов из легкого слоя.

(i) добавление к легкому слою водного промывочного раствора;

(ii) отделение водного промывочного раствора от легкого слоя; и

(iii) повторение указанных стадий (i) и (ii) до тех пор, пока липиды не станут, по существу, неэмульгированными.

(а) культивирования микроорганизмов в ферментационной среде;

(б) обработки клеток микроорганизмов для высвобождения внутриклеточных липидов посредством:

i) контактирования указанной ферментационной среды с основанием для растворения по меньшей мере части любых присутствующих белков; и

ii) повышения температуры ферментационной среды по меньшей мере приблизительно до 50°С для лизиса клеток микроорганизмов с получением смеси растворенных клеток;

(в) разделение смеси растворенных клеток на слои: тяжелый водный и легкий, содержащий эмульгированные липиды, при этом процесс проводят в среде, которая содержит менее чем 5% неполярного органического растворителя;

(г) отделения тяжелого слоя от легкого слоя;

(д) добавления к легкому слою водного промывочного раствора;

(е) удаления тяжелого слоя из смеси со стадии (в); и

(ж) повторения указанных стадий (д)-(е) до тех пор, пока липиды не станут, по существу, неэмульгированными.

а) обработку клеток микроорганизмов, выращенных в ферментационной среде, приводящую к высвобождению внутриклеточных липидов в ферментационную среду путем добавления основания в ферментационный сосуд и нагревание смеси для лизиса клеток;

(б) разделение ферментационной среды, содержащей высвобожденные внутриклеточные липиды на слои: тяжелый водный и легкий, содержащий липиды;

(в) удаление тяжелого слоя из ферментационного сосуда, с последующим получением липидов из легкого слоя.

(а) культивирование микроорганизмов фотосинтетическим способом в фотобиореакторе или искусственном водоеме;

(б) лизис клеток микроорганизмов для получения смеси растворенных клеток;

(в) обработку указанной смеси растворенных клеток для получения слоев: тяжелого водного слоя и легкого, содержащего указанные липиды;

(г) отделение тяжелого слоя от легкого; и

(д) получение липидов из указанного легкого слоя.