СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МОДИФИЦИРОВАННОГО ПОЛИЭЛЕКТРОЛИТНОГО КОМПЛЕКСА ДЛЯ ДОСТАВКИ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ Российский патент 2025 года по МПК C08B37/04 C08G81/00 C08G85/00 C08J3/03 A61K47/36 A61K47/34 

Область техники

Изобретение относится к области химии полимеров, биохимии и медицины, а именно к способу получения модифицированного полиэлектролитного комплекса (полиплекса), на основе анионного низкомолекулярного Альгината (LMWSA) и катионного L- Лизина Гидрохлорида (L-Lysine HCl).

Уровень техники

Существуют различные методы получения полиэлектролитных комплексов, однако существующие технологии часто имеют ограничения по стабильности, биоактивности и возможности применения в различных областях

Альгинат натрия, линейный гетерополисахарид, содержащийся в клеточных стенках бурых водорослей и выделяемый некоторыми видами бактерий (Formo, Aarstad, Skjåk-Bræk, & Strand, 2014), широко используется в фармацевтической и пищевой промышленности благодаря своим уникальным физико-химическим свойствам, а также полезным эффектам для здоровья (Lee & Mooney, 2012; Liu et al., 2019; Pawar & Edgar, 2012). Однако его потенциальное применение в определенной степени ограничено из-за низкой растворимости в воде и высокой вязкости раствора, когда требуются высокие концентрации (Liu et al., 2019). Кроме того, было обнаружено, что функциональные свойства альгината натрия сильно коррелируют не только с его химической структурой, но и с его молекулярной массой и соотношением M/G (Liu et al., 2019; Schürks, Wingender, Flemming, & Mayer, 2002).

Химические структуры G-блока, М-блока, чередующегося G и M-блока, присутствующего в молекулах альгината можно посмотреть на фигуре 11.

Молекулярная масса различных сортов альгинатов колеблется от 32 000 до 400 000 г/м, что зависит от ресурсов. Молекулярная масса альгината является важным параметром, который следует учитывать при выборе подходящего альгината для конкретного использования. Помимо проблем с растворимостью и вязкостью, низкомолекулярный альгинат натрия (LMWSA) и альгинатные олигомеры обладают более важными физико-химическими и биологическими свойствами, чем высокомолекулярный альгинат натрия (HMWSA). Например, LMWSA с низким соотношением M/G лучше подходит для защиты пробиотиков от жестких условий пищеварения, чем HMWSA с высоким соотношением M/G (Ramos et al., 2018). Сообщалось, что альгинатные олигомеры, полученные путем ферментативной деполимеризации, способствуют росту бифидобактерий и растений, в то время как исходные альгинаты до деполимеризации не оказывают такого действия (Akiyama et al., 1992; Tomoda, Umemura, & Adachi, 1994; Yonemoto et al., 1993).

Гидрогели, сформированные из частично окисленного альгината с низкой молекулярной массой (255 кДа), могут быть использованы для значительного улучшения формирования хрящеподобной ткани in vivo по сравнению с гидрогелями, сформированными из HMWSA (390 кДа) (Bouhadir et al., 2001). Радикальная поглощающая активность LMWSA выше, чем у HMWSA (Falkeborg et al., 2014). Интересно, что олигомеры альгината, полученные путем деполимеризации альгинат-лиазой, эффективно усиливают индуцирующую активность фактора некроза опухоли-α по сравнению с исходным альгинатом (Kurachi et al., 2005). Было обнаружено, что ферментативно деполимеризованные олигомеры альгината эффективно индуцируют выработку цитотоксических цитокинов в лейкемических клетках периферической крови человека U937, хотя исходный альгинат такой активностью не обладал (Iwamoto, Xu, Tamura, Oda, & Muramatsu, 2003).

Альгинат олигосахаридов обладает иммуномодулирующим действием и может быть полезен в качестве функционального пищевого материала (Kuda et al., 2017). Альгинатные олигосахариды являются мощным растительным элиситором и могут смягчать повреждения растений, вызванные абиотическими стрессами, такими как засуха, высокая соль и тяжелые металлы (Liu et al., 2013). Олигосахариды альгината могут ингибировать послеуборочную гниль и продлевать качество плодов, подавляя деградацию клеточной стенки и вызывая действие антиоксидантов (Liu, Ken- nedy, Zhang, Heng, & Wu, 2020). Деградированный альгинат натрия также может способствовать росту корней растений (Hien et al., 2000; Natsume, Kamo, Hir- ayama, & Adachi, 1994; Zhang et al., 2013).

Интересные физико-химические и биологические свойства, которыми обладают LMWSA и альгинатные олигомеры, могут быть обусловлены фундаментальными структурами и свойствами их собственных молекул. LMWSA имеет малый молекулярный объем и быструю молекулярную подвижность по сравнению с HMWSA. Это позволяет LMWSA легче проникать в биологические ткани, чем HMWSA. LMWSA легче поглощается, переваривается и утилизируется организмами, чем HMWSA. По сравнению с LMWSA, HMWSA имеет сложную пространственную структуру молекулярной цепи. Таким образом, многие активные участки HMWSA легко закрываются и трудно полностью раскрываются, по сравнению с LMWSA

Для получения LMWSA и альгинатных олигомеров используется множество методов, включая ферментативный процесс (Belik, Silchenko, Kusaykin, Zvyagintseva, & Ermakova, 2018; Kim, Lee, & Lee, 2011; Murata, Inose, Hisano, Abe, & Imanaka, 1993), химический подход (Gomez, Rinaudo, & Villar, 2007; Ikeda, Takemura, & Ono, 2000; Kristiansen, Tomren, & Christensen, 2011; Li et al., 2010; Yang, Li, & Guan, 2004), и физический метод (Aida, Yamagata, Watanabe, & Smith, 2010; Burana-osot et al., 2009; Dodero, Vicini, & Castellano, 2020; Lee et al., 2003; Nagasawa, Mitomo, Yoshii, & Kume, 2000; Watthanaphanit & Saito, 2013), были использованы для деградации альгината натрия. Однако некоторые методы, используемые для деградации альгината натрия, могут в определенной степени приводить к изменению химической структуры деградированного альгината натрия (Li et al., 2010; Zhou et al., 2017). После деградации альгината натрия наблюдалось изменение его цвета (Lee et al., 2003; Nagasawa et al., 2000; Watthanaphanit & Saito, 2013). Также было обнаружено, что соотношение M/G изменяется при деградации альгината натрия под действием гамма-облучения (Lee et al., 2003).

Хотя деградация альгината натрия различными методами, упомянутыми выше, уже изучалась, исследований по получению LMWSA с помощью озонирования относительно мало. Было обнаружено, что низкомолекулярный альгинат натрия (LMWSA) может быть получен в результате деградации альгината натрия, вызванной озонированием в водном растворе. Так например в US20190345184 by Zhongping Xiao et.al. “Method of degrading polysaccharide using ozone” by GREEN VALLEY (SHANGHAI) PHARMACEUTICALS CO., LTD. Озонирование полисахарида происходит в 20% водном растворе в течении 3-4 часов, предпочтительно в присутствии катализаторов (основания, УФ, пероксиды, ионы металлов), температура поддерживается в диапазоне 20-50С, с концентрацией озона до 10 г в час, степень деградации предпочтительно до 5 кДа, “Ozonolytic depolymerization of polysaccharides in aqueous solution” by Ying Wang et.al где описывается «одноэтапный» метод, при котором полисахариды, растворенные в воде или основных растворах, де-полимеризуются путем озонолиза. WO/1997/032903 by Kesselmans, Ronald et.al. “Method of oxidizing polysaccharides using ozone in the presence of halogenide-containing catalyst” by COÖPERATIEVE VERKOOP (NL) Согласно вышеупомянутому способу, полисахарид окисляется в водной суспензии, и после реакции водную фазу с катализатором можно отделить от продукта реакции простым и известным способом и вернуть в цикл. Концентрация полисахарида в реакционной смеси может варьироваться (в пересчёте на сухое вещество) и предпочтительно составляет от 10 до 40%., в качестве катализатора используются соединения йода.

Процессы описанные в этих работах достаточно сложны и не экологичны для производственных процессов и носят в основном лабораторный характер. До сих пор было мало известно о вызванном озонированием изменении молекулярной массы и молекулярно-массового распределения альгината натрия. Имеется мало информации об изменении цвета и соотношения M/G LMWSA, полученного озонированием. До сих пор неизвестно, происходят ли изменения в химической структуре LMWSA, полученного в результате озонирования.

Наиболее близкий процесс к настоящему изобретению на стадии озонирования полимеров продемонстрирован в патенте РФ № 2404997 С2, автор Болдуев В.С, ООО «ГРАФТ-ПОЛИМЕР» (RU), где газохимическую модификацию осуществляют при температуре не выше 30°С и при концентрации озона 5-15 мас.% с продувкой реакционно-способными газами, что подразумевает целый спектр газов, уже имеющихся в воздухе либо специально введенных в реакторв. Порошок полимера, находящийся в «псевдоожиженном» состоянии, в реакторе, работающем в режиме «сухой» газовой схемы озонируют в течении 10-30 мин, и где озон разлагается до кислорода в каталитическом деструкторе перед выхлопом в атмосферу. В результате модификации

на поверхности полимера образуются гидроксильные, карбоксильные, карбонильные и перекисные функциональные группы. Однако, в данном процессе нет упоминания о натуральных биополимерах (полисахаридах) - и в частности об альгинате или его производных. Также можно предположить что такой процесс (при температуре не выше 30С и времени 10-30 мин) будет не достаточно эффективен для промышленного получения низкомолекулярного полисахарида.

Полиэлектролиты - это высокомолекулярные материалы, которые имеют несколько ионизируемых функциональных групп с разной молекулярной массой и химическим составом. Заряд на макромолекулах создается за счет частичной или полной диссоциации ПЭК в водных растворах. В растворе одновременно смешиваются противоположно заряженные полиэлектролиты с образованием ПЭК (фиг. 1). Электронейтральность полиэлектролитов в растворе поддерживается за счет нейтрализации заряда для повторяющейся единицы противоположным зарядом. Повторяющиеся единицы, например, положительно заряженные электролиты сопровождаются меньшими ионами отрицательного заряда.

Частицы ПЭК образуются в результате нековалентных электростатических взаимодействий между различными поликатионами и полианионами. При смешивании противоположно заряженных полиэлектролитов в водной среде раствора в контролируемых условиях ионной силы, рН, концентрации полиэлектролитов, распределения ионных групп в зависимости от молекулярной массы полимеров и соотношения смешивания, плотная фаза отделяется от растворителя. Кроме того, порядок полиэлектролитической реакции также влияет на степень ионизации, что, в свою очередь, влияет на образование наночастиц. Комплексообразование полиэлектролитов происходит между противоположно заряженными частицами и называются соответственно (например, комплексы полиэлектролитных поверхностно-активных веществ, комплексы полиэлектролитных нуклеиновых кислот, ПЭК, полиэлектролитные лекарственные комплексы). Полиэлектролиты представляют собой интересный класс макромолекул, которые содержат диссоциированные ионные группы. Эти молекулы обладают макромолекулярными цепями и содержат высокие заряды, которые отвечают за их увлекательные бехавиоры. Различные классы полиэлектролитов в зависимости от их природы приведены в таблице 1. Как правило, при приготовлении ПЭК химические сшивающие агенты не используются (за исключением химически сшитых ПЭК), поэтому они нетоксичны, биосовместимы и хорошо переносятся. Они обладают многочисленными уникальными характеристиками, которые подходят в качестве идеальных фармацевтических вспомогательных веществ для контроля кинетики высвобождения лекарств

Таблица 1. Некоторые полиэлектролиты и их ионная природа

Типы натуральных полиэлектролитов Полианионы Поликатионы Нуклеиновые кислоты, поли(L-глутамикацида), полигалактуроновая кислота, каррагинан, натриималгинат, лоуметоксипектин, геллангум, стеркулиагум гумкондагогу, хондроитинсульфат и т. д. Хитозан, декстран, желатин, поли(L-лизин), лизоцим и т.д.

Полилизин (PL) широко используется в кондитерских изделиях, хлебе, продуктах с низким содержанием сахара и калорий, а также в низкотемпературных мягких консервах, которые могут эффективно подавлять размножение термостойких спор, улучшать эффективность консервации и предотвращать появление запаха после стерилизации. Будучи катионным полимером, PL содержит большое количество аминных групп с хорошей биосовместимостью и биоразлагаемостью (Chen, Yu, & Li, 2017; Diamanti et al., 2016; Lu, Zou, Xu, & Li, 2018). PL может взаимодействовать с поливалентными анионами, образуя сшитые сложные системы, которые имеют перспективное применение при проектировании транспортных средств с контролируемым выбросом (Vernon, Gooden, Preisinger, & Gebe, 2018). L-лизин является разновидностью основной аминокислоты, содержащей одну карбоксильную и две аминогруппы. Известно, что карбоксил может соединяться с α или ε аминогруппой другого катионного гомополмера, а именно поли-L L-лизина, образуя -лизин. Этот вид катионного хомополимера может быть использован в качестве эмульгирующих или доставочных агентов, средств против ожирения, гидрогелей, биоразлагаемых материалов, пищевых консервантов и так далее (Jia et al., 2009; Li et al., 2019).

Lysine HСl, гидрохлорид L-лизина, L-лизин HСl, лизингидрохлорид Pharma Grade, лизиновый гидрохлорид показан на фигуре 13.

Упомянутые сложные системы на самом деле представляют собой разновидность полиэлектролитного комплекса (ПЭК), который был впервые изготовлен методом самосборки Ямамото и его коллегами (Wasupalli & Verma, 2018). Полиэлектролитные комплексы обычно относятся к сложным системам, образующимся между противоположно заряженными материалами (например, полимер-полимер, полимер-лекарство и полимер-лекарство-полимер) в результате электростатического притяжения (Murakami & Takashima, 2003; Wasupalli & Verma, 2018). Благодаря своим превосходным свойствам, полиэлектролитные комплексы имеют потенциальное применение в защите окружающей.

Полиэлектролитные комплексы широко представлены в научной литературе и патентах. Так например в патенте РФ № 2445118 С2 Мустафин и др. «Способ получения носителя биологически активных соединений на основе интерполиэлектролитного комплекса.

Носитель получают путем смешения растворов сополимера катионного характера диметиламиноэтилметакрилата, бутилметакрилата и метилметакрилата в соотношении 2:1:1, доведенного до значения рН 2,0-7,0, и геля редкосшитой полиакриловой кислоты со значением рН 2,0-7,0, в качестве растворителей используют воду.

Патент РФ 2283848С1 Понеделькина и др. «Способ получения конъюгатов альгиновой кислоты» раскрывает способ получения конъюгатов альгиновой кислоты путем взаимодействия ее с аминосодержащими соединениями (RNH 2) в присутствии конденсирующего реагента.

Патент US 10,342,228 B2, van der Krieken et.al, “Polyelectrolyte Complexes for biocide enhancements “CERADIS B. V, Wageningen (NL). Настоящее изобретение относится к композициям, содержащим биоцид и полиэлектролитный комплекс полианиона, такой электролитный комплекс полианиона, как лигносульфонат, и поликатион, такой как хитозан для доставки биоцидов.

Патент US 8435787B2 Tim Maguire et.al. Rutgers State University of New Jersey (USA) “Alginate polyelectrolyte encapsulation of embryonic stem cells” Изобретение направлено на использование альгинатной микрокапсуляции поли-L-лизина в контролируемой дифференцировке эмбриональных стволовых клеток.

Можно привести примеры наиболее близких исследований к тематике настоящего изобретения, такие как: “Antibacterial dialdehyde sodium alginate/ε-polylysine microspheres for fruit preservation” Liming Ge et.al. В данном исследовании были разработаны антибактериальные диальдегидные альгинатные микросферы натрия/ε-полилизиновые микросферы (DSA-PL MPs) для эффективного продления срока хранения фруктов. DSA были получены путём пероксидного окисления альгината натрия. Затем PL был присоединен к основе DSA с помощью реакции Шиффа для синтеза конъюгатов DSA-PL, после чего последовали эмульгирование и сшивание ионами Ca²⁺ для получения DSA-PL МПА. Результаты показывают, что DSA-PL МПА представляют собой гладкие сферические частицы с относительно узким распределением по размерам и хорошей дисперсностью.

“Lysine-Sodium Alginate Conjugates as controlled drug delivery vehicle for 5-fluoracil nanoparticle system” Ruchi Gaikwad et al. Department of Pharmaceutical Technology, India Настоящее исследование было посвящено получению наночастиц методом контролируемой гелеобразования для модельного противоракового препарата 5-фторурацила. Препараты были приготовлены с использованием биосовместимого конъюгата (окисленного периодатом альгинат натрия, конъюгированный с лизином). Этот комплекс был безопасен и готовился по мягкой и простой процедуре реакции. Конъюгат хорошо диспергируется в воде, а наночастицы альгината натрия, закрепленные L-лизином, демонстрируют контролируемое высвобождение модельного препарата. Различные количества метапериодата натрия, растворенного в 100 мл дистиллированной воды, и перемешивали магнитом в темноте при 25°C в течение 6 ч. Затем раствор диализовали в дистиллированной воде (2,5 л) с различными изменениями воды до полного освобождения от периодата (48 ч).

Очевидно, что все упомянутые выше методы, имеют серьезные недостатки, отмеченные выше и относящиеся прежде всего к способом модификации (окисления) полисахаридов.

Суть изобретения

Целью настоящего изобретения является разработка нового способа получения модифицированного полиэлектролитного комплекса, обладающего с улучшенными характеристиками стабильности и биосовместимости для широкого применения в биохимии и медицине - для доставки БАВ, а также в пищевой отрасли - для сохранности продуктов при хранении. При создании данного изобретения ставилась задача разработать экономически эффективный и экологически чистый промышленный способ по модификации поверхности полисахаридов ( в частности альгината натрия) реакционно-способными газами с последующим синтезом в водном растворе полиэлектролитного комплекса (ПЭК) Заявленное изобретение позволяет не только преодолеть все вышеупомянутые недостатки, присущие известным способам, но и впервые продемонстрировать уже коммерциализированный промышленный процесс. Технический результат достигается за счет инновационной промышленной технологической схемы и параметров процесса газохимической модификации и синтеза ПЭК. При этом удалось повысить безопасность и экологичность процесса, значительно расширить спектр применяемых используемых для доставки биологически активных веществ (БАВ).

Технический результат достигается тем, что в способе получения полиэлектролитного комплекса на основе Альгината натрия и Лизина, используется предварительная модификация полисахарида (альгината) методом «сухого» термического озонирования озоновоздушной смесью газов. Низкомолекулярный альгинат натрия (LMWSA) с молекулярной массой до 70 кДа,, получают контролируемым газо-термическим окислением с помощью озона при температуре до 80°, продолжительностью до 10 минут, а полиэлектролитный комплекс (ПЭК) синтезируют в водном растворе электростатическим взаимодействием вышеупомянутых компонентов в соотношении 2:1 или 1:2 и значений pH 2,0-5,0, по водородным связям и реакции Шиффа.

Описание изобретения

Способ получения модифицированного полиэлектролитного комплекса включает следующие этапы:

1. Получение модифицированного низкомолекулярного альгината

Получают анионный низкомолекулярный альгинат (LMWSA) с молекулярной массой от 200 до 70 кДа.

Альгинат получают контролируемым термическим окислением с помощью озона в сухом виде при температуре до 80°C в течение 5-10 минут. Этот процесс позволяет достичь необходимых физико-химических свойств альгината.

2. Формирование полиэлектролитного комплекса

К полученному низкомолекулярному альгиновому натрию добавляется катионный L-лизин гидрохлорид (L-Lysine HCl) в соотношении 2:1 или 1:2.

Процесс проводится в водном растворе при значениях pH от 2,0 до 5,0.

Полиэлектролитный комплекс образуется за счет электростатического взаимодействия между анионными и катионными компонентами по водородным связям и реакции Шиффа.

Химический механизм газовой модификации.

Одним из наиболее перспективных и современных методов модификации поверхности полимеров является модификация реактивными газами, которая позволяет изменить свойства поверхностей этих материалов в широких пределах и значительно расширить области их использования. Под термином «реактивные газы» подразумевают совокупность химически активных и естественной смеси газов воздуха, так или иначе принимающих участие в химических реакциях в процессе модификации. В качестве химически активных, как правило, используют известные газы-окислители: хлор, фтор, озон. К естественной смеси относится целый спектр газов, как уже присутствующих в атмосферном воздухе (азот, водород, кислород, окислы углерода), так и специально введенных в реактивную газовую среду (азот, аммиак, газообразные прекурсоры). Например, газообразные прекурсоры на основе аминов получаются при введении в реактор при соответствующей температуре мономеров: триметиламин, пропиламин, пиперидин, этаноламин, этилендиамин т.п.).

Химический механизм газовой модификации показан на фигуре 12.

В процессе газохимической наномодификации на поверхности полимера возникают функциональные полярные химически активные группы: гидроксильные, карбоксильные, карбонильные, перекисные, аминные и т. д. (набор и химическая природа групп определяется спектром газов занятых в реакции) Химически активные функциональные группы образованные на поверхности полимера (размерами 20-50нм) позволяют провести практически любую реакцию присоединения (со-полимеризации) а перекисные и нитро-радикалы осуществляют химическую сшивку (cross-linking) с образованием ковалентных и водородных связей. (Фиг. 4)

Особенностью нанотехнологии газохимической модификации и графтинга (химической прививки полимерных цепей к поверхности материала) является широкое использование процессов самоорганизации, самосборки и поверхностно-инициируемого синтеза, которые могут в сложно организованной системе привести к формированию необходимых упорядоченных структур (наноструктур), проявляющих требуемые практически важные (функциональные) свойства.

Основные принципы являющихся «краеугольными камнями» технологии термической газо-модификации являются:

1) Поверхностная модификация полимера реакционно-способными газами для создания химически активных функциональных групп (так называемых «графтовых сайтов»);

2) Иммобилизация инициатора полимеризации на поверхности предварительно модифицированного полимера по методу «grafting to» или SAM (self-assembled monolayer) 3) Поверхностно -инициированная полимеризация (SIP -surface initiated polymerization) по методу «grafting from» c использованием методов контролируемой радикальной полимеризации ATRP, RAFT, NMP.

Термический Озонолиз

Температурный озонолиз приводит к образованию метастабильных (возбужденных)

атомов кислорода, в процессе декомпозиции ( разложения) которых происходит выделение энергии в количестве 102 500 калорий, в виде хемолюминисценции ( в голубом спектре) соответствующей длины волны 2780А

В случае введения в реакционную среду специальных газов, например: аммиака или его смесей с водородом или газовых аминных прекурсоров на поверхности возникают азотсодержащие группы (амино-, амидо-, имидо-, имино- и т.п.).

Преимущества изобретения

Полученные полиэлектролитные комплексы обладают уникальными свойствами, которые могут быть использованы для эффективной доставки биологически активных веществ.

Изобретение также находит применение в пищевой промышленности для увеличения сроков хранения продуктов и улучшения их сохранности.

Сравнительный анализ с прототипом показывает, что заявленный способ отличается параметрами модификации («сухая схема», повышенная температура озонолиза, короткое время, экологичность процесса) и химической природой химически активных групп на поверхности модифицированного полисахарида (в частности альгината), то есть заявленное решение соответствует критерию «новизна».

Оно также соответствует критерию «изобретательский уровень», так как использование термического озонолиза для модификации полисахарида (в частности альгината) и формированию на его основе полиэлектролитного комплекса с аминокислотами (в частности с лизином) является неизвестным способом, который уже является промышленным процессом и впервые продемонстрирован в данном изобретении.

Изобретение может быть дополнено различными вариантами реализации, которые не выходят за рамки заявленного способа.

Описание фигур

Фиг. 1. Принципиальная схема модифицированного полиэлектролитного комплекса (ПЭК).

Фиг. 2. Принципиальная технологическая схема газовой модификации.

Фиг. 3. Алгоритм газохимической модификации.

Фиг. 4. ИК-спектры: модифицированного альгина (красный цвет) и исходного альгината (синий цвет).

Фиг. 5. Изменение усредненного весового молекулярного распределения, kDa.

Фиг. 6. Микрофотографии иллюстрируют процесс образования наноразмерных химически активных групп ( время озонирования альгината при 80 С) На снимках a) b) c) d) можно видеть изменение топографии поверхности в процессе газохимической модификации. (область сканирования : 2.5 μm x 2.5 μm), время модификации соответственно : одна минута (a); три минуты (b); пять минут (c); и десять минут (d). Нанометрическиеразмеры функциональных групп определяются примерно от 20 нмдо 70 нм.

Фиг. 7. Топографические снимки (область сканирования: 1 μm x 1 μm), в динамическом методе, после 15 минут модификации перед (a) и после (b) отмывки образца. Размеры «капель» на снимках(a) и (и) 24 и 14 nm, соответственно.

Фиг. 8. Морфологические изменения, вызванные деструкцией полимерных фибрилл и образование низкомолекулярных олигомерных соединений (функциональных групп) отчетливо видны с помощью AFM.

Фиг. 9. Образование ПЭК, показано образование ПЭК после смешивания левого (соотношение PLL: Alg1:1) и правого (соотношение PLL:ALg2:1) с различной концентрацией NaBr(0,025 М, 0,05 М, 0,25 М и 0,05 М слева направо).

Фиг. 10. Сравнительное фото ПЭК.

A)1:1 PLL: Algнемодифицированный с 0.025 M NaBR;

B) 1:1 PLL:Algмодифицированный комплекс с 0.25 M NaBr.

Примеры

Пример №1. Получение модифицированного низкомолекулярного альгината натрия

В данном эксперименте использовался очищенный альгинат натрия (Mw 972,3 кДа, Mw/Mn 2,72 и M/ G 0,79). Газ озон был получен из газообразного кислорода (или воздушной смеси) с помощью генератора озона.

Комплекс оборудования и Принципиальная схема (Фиг 2)

а) Газоподготовка (Gas Preparation Cabinet) - в него входит : генератор озона, компрессор с холодильником, чиллер, осушитель воздуха, ресивер. Также предусмотрено оборудование для подачи и других газов (например N2, CO2 и др.) Производители : фирмы «Озония» ( Швейцария), «Атлас-Копко» ( Швеция).

б) Реактор газохимической модификации и Реактор полимеризации (графтинга).

Реакторы представляют собой горизонтальные двухосные смесители ( усовершенствованный тип «Forberg»), с донной выгрузкой типа «bomb-discharge», с двойной рубашкой нагрева-охлаждения, внутреннее покрытие -PTFE. Позволяют сформировать качественный «псевдоожиженный» слой, не допуская агломерацию и обеспечивая равномерный нагрев и обработку материалов газами и реагентами (газообразными прекурсорами). Для реактора предусмотрена система жидкостной и порошковой дозации реагентов. Для реактора газохимической модификации предусмотрена газовая схема, с системой рекуперации выхлопа.

По окончанию цикла модификации и графтинга ( в среднем 5-10 минут) модифицированный или привитой порошок проходит стадию конциционирования и охлаждения в специальном смесителе и загружается в бункер перед упаковкой материала. Все параметры процессов модификации и графтинга строго контролируются (PLC monitor).

Параметры процесса модификации зависят от

площади поверхности порошка полимера,

времени озонирования и

температуры, определены эмпирическим путем и отражены в Алгоритме газовой модификации (Фиг. 3).

Пример №2. Сравнительный анализ ИК-спектров образцов исходного и модифицированного Альгината натрия

На (Фиг. 6) показано наличие характеристической полосы карбоксильных групп (1726 см-1), количественное определение которых было определено методом химического титрования. В образце газохимически модифицированного альгината натрия имеется характеристическая полоса внеплоскостных деформационных колебаний С-Н (888см-1) при RR1С=СН2 - группе, однако интенсивность этой полосы в несколько раз меньше интенсивности такой полосы в образце исходного альгината натрия, поскольку при озонировании большинство винилиденовых групп расходуется в результате их взаимодействия с озоном. На Фиг. 6 приведены ИК-спектры модифицированных ПЭ с полной расшифровкой характерных полос (см-1 ): 719-721 - маятниковые колебания СН2-групп; 1302 - крутильные колебания СН2-групп ; 1375-7 - веерные колебания СН2-групп; 1466-8 - деформационные ножничные колебания СН2-групп 1645 - валентные колебания С=С групп 1726 - валентные колебания СOOH карбоксильных групп; 1898 - обертон маятниковых колебаний СН2-групп (731+1170) 2021 - обертон маятниковых и крутильных колебаний СН2-групп (720+1302) ; 2667 - обертон веерных и крутильных колебаний СН2-групп (1375+1302) ; 2846-50- симметричные валентные колебания С-Н СН2-групп ; 2904-18- асимметричные валентные колебания С-Н СН2 групп ; 3662 - валентные колебания О-Н гидроксильных групп. (Фиг 4)

Пример №3. Влияние озонирования на молекулярно-массовое распределение

Молекулярно-массовое распределение (Mw/ Mn) образцов LMWSA, полученных озонированием, заметно изменилось по сравнению с исходным альгинатом натрия. Mw/Mn альгината натрия сначала увеличилось с 2,72 до 3,26 в начальный 10-минутный период озонирования, затем медленно уменьшилось с увеличением времени озонирования (10-50 мин), затем снова медленно выровнялось (50-70 мин) и, наконец, сошлось до 1,43. Изменение Mw/Mn образцов LMWSA может быть результатом гетерогенной реакции между озоном и цепочками молекул альгината натрия. (Фиг. 5).

Пример №4. Анализ морфологии поверхности модифицированного полисахарида ( альгината натрия)

Используя метод атомно-силовой микроскопии (AFM) можно проанализировать изменения на нано уровне в морфологии поверхности и адгезии, являющихся следствиями процесса газохимической поверхностной модификации полимеров. (для наглядности и простоты измерений в качестве примера рассматривается газохимическая модификация порошка альгината, нанесенного на стеклянную подложку.

Для порошкообразных образцов рекомендуется использовать полуконтактный режим (tapping mode), который минимизирует деформацию образца и позволяет получить высокое разрешение. Для анализа поверхности использовался атомный силовой микроскоп (Explorer, TopoMetrix) Альгинат натрия обрабатывалась озоновоздушной смесью в реакторе-модификаторе при температуре 80°С, рабочем давлении газа-2,5 бара, производительности озонатора CFS-7 «Озония» 250 г О3/час, концентрации озона 9 мас.% в течение 15 минут. Для анализа морфологии поверхности использовалась контактная техника AFM, с областью сканирования: 2,5 μm × 2,5 μm : ( Фиг.6).

В первую минуту процесса практически не видно морфологических изменений поверхности. Когда время модификации доходит до 3 минут, отчетливо видны «утолщения» и «узелки» на фибрилах альгината (b). Очевидно, что изменения в морфологии произошли из-за образования низкомолекулярных олигомерных соединений гидроксильных, карбоксильных, альдегидных, кетонных, перикисных и др. химически активных функциональных групп. Наличие этих групп установлены FTIR (Фиг.4). Причем, окисление поверхности приводит не только к образованию низкомолекулярных олигомеров но и разрыву поверхностных полимерных цепочек, причем никомолекулярные олигомерные соединения сосредотачиваются (агрегируются) на поверхности полимерных фибрилл и имеют большую поверхностную энергию, чем переферийные области полимера. Появление этих соединений в виде «капель» очень похоже внешне на росу на текстильной поверхности. Когда время модификации превышает 5 минут «узелковая» структура «теряется» и изменяется на «вытянутые капли» на фибриллах (с). Резонно предположить, что при увеличении времени модифицирования увеличивается количество низкомолекулярных олигомерных соединений. Снимки (b) и (c), показывают, что эти «капли « в основном имеют округлую морфологию, тогда как снимки (с) показывают уже «пролонгированные капли и ламеллы». При достижении времени модификации 15 минут, снимок (d), формирование и насыщенность «пролонгированных капель» усиливается и в дальнейшем ясно видна агрегация этих низкомолекулярных олигомеров, из-за различия в поверхностной энергии, в какой - то мере повторяющих структуру фибрилл исходного полимера. При дальнейшей модификации поверхности полимера очевидно, что наиболее тонкие фибриллы будут более чувствительны к воздействию реакционной среды, мы будем наблюдать их разрывы, подобно «напряженной и затем релаксирующей ленте», образование и рост на разорванных фибриллах низкомолекулярных олигомерных соединений.

Это отчетливо видно на Фиг 7 (a) после 15 минут модификации. И даже после отмывки этих «капель» водой - снимок (b) отчетливо видна уже измененная морфология поверхности полимера. (Фиг 8).

Пример №5. Исследование соотношений компонентов в полиэлектролитном комплексе (ПЭК) PLL: Alg ( Л-Лизин : Альгинат)

Модифицированный альгинат натрия (Alg) с молекулярным весом 70 kDa (3%, w/v), Полилизин (PLL, Mw < 5000) поставлялся компанией Macklin Biochemical Co., Ltd. (Шанхай, Китай). Смешивались в соотношениях 1:1 и 2:1, при комнатной температуре, с добавлением соли NaBr или NaCl. Данные приведены в Табл 2. и (Фиг 9-10).

Табл.2 Образцы ПЭК PLL:Alg с разными концентрациями соли после смешивания и после центрифугования

Соотношение PLL:Alg Концентрация NaBr Наблюдение после смешивания Наблюдение после ультрацентрифугирования 1:1 0,25 M Быстрая преципитация Твёрдые агрегаты 0,5 M Быстрая преципитация Твёрдые агрегаты 1,0 M Мутная суспензия Непрозрачный, эластичный, но непригодный для механических испытаний 1,5 M Прозрачный раствор Н/Д 2:1 0,25 M Быстрая преципитация Твёрдые агрегаты 0,5 M Быстрая преципитация Твёрдые агрегаты 1,0 M Мутная суспензия Непрозрачный, эластичный, но непригодный для механических испытаний 1,5 M Прозрачный раствор Н/Д

Примечания:

PLL - это соотношение полилизина (PLL) и альгината (Alg),

M - молярная концентрация (моль/литр),

Н/Д - не применимо (не указаны данные).

Настоящее изобретение представляет собой новый подход к получению модифицированных полиэлектролитных комплексов, что открывает новые возможности для их применения в медицине и пищевой промышленности.

Литература

1. Биомиметический принцип конструирования экдистероидсодержащих липосом / Л.А. Ковлер, В.В. Володин, Н.К. Политова и др. // Докл. РАН, 1998. Т. 363, № 5. С. 641-644.

2. Гольбрайх Л.С. Хитин и хитозан: строение, свойства, применение // Соросовский образовательный журн., 2001. Т. 7, № 7. С. 51-56.

3. Кабанов В.А. Физико-химические основы и перспективы применения растворимых интерполиэлектролитных комплексов (обзор) // Высокомолекулярные соединения, 1994. Т. 36. № 2. С. 183-197.

4. Кабанов В.А., Зезин А.Б. Водорастворимые нестехиометричные полиэлектролитные комплексы - новый класс синтетических полиэлектролитов // Итоги науки и техники. Сер. "Органическая химия". М., 1984. Т. 5. С. 131-189.

5. Новоселов Н.П., Сашина Е.С. Современные представления о строении целлюлозы, хитина и хитозана. Механизм их растворения и биологическая активность // Биологически активные вещества в растворах. М.: Наука., 2001. С. 363-397.

6. Новый подход к созданию материалов с контролируемым выделением лекарственного вещества / Н.Р. Кильдеева, В.Г. Бабак, Г.А Вихорева. и др. // Вестн. МГУ. Сер. 2. Химия, 2000. Т. 41, № 6. С. 423-425.

7. Трехкомпонентные интерполимерные комплексы с низкомолекулярным посредником - некоторые особенности надмолекулярной структуры / О.В. Праздничная, И.Д. Юргенс, С.В. Кораблева и др. // Высокомолекулярные соединения, 1994. Сер. А. Т. 36, № 8. С. 1316-1321.

8. Химическая модификация 20Е и исследование мембранотропных свойств его производных / Н.К. Политова, Л.А. Ковлер, В.В. Володин и др. // Химия растительного сырья, 2001. Т. 5, № 2. С. 69-81.

9. Slama K., Lafont R. Insect hormones - ecdysteroids: their presence and actions in vertebrates // Eur. J. Entomol., 1995. Vol. 92. P. 355-377.

Изобретение относится к химии, а именно к способу получения полиэлектролитного комплекса для доставки биологически активных веществ. Предложенным способом получают модифицированный низкомолекулярный альгинат с молекулярной массой 70 кДа путем контролируемого сухого термического окисления озоном альгината натрия при температуре 80°C в течение 5-10 мин и затем в водном растворе с pH от 2,0 до 5,0 смешивают полученный модифицированный низкомолекулярный альгинат и поли-L-лизин гидрохлорид при их соотношении соответственно 2:1 или 1:1. Изобретение обеспечивает контролируемое снижение молекулярной массы альгината до 70 кДа и формирование стабильного и биосовместимого полиэлектролитного комплекса, пригодного для инкапсуляции и доставки биологически активных веществ. 13 ил., 2 табл., 5 пр.

Способ получения полиэлектролитного комплекса для доставки биологически активных веществ, характеризующийся тем, что получают модифицированный низкомолекулярный альгинат с молекулярной массой 70 кДа путем контролируемого сухого термического окисления озоном альгината натрия при температуре 80°C в течение 5-10 мин и затем в водном растворе с pH от 2,0 до 5,0 смешивают полученный модифицированный низкомолекулярный альгинат и поли-L-лизин гидрохлорид при их соотношении соответственно 2:1 или 1:1.