Область техники
Изобретение относится к медицине, в частности, к психофармакологии, и касается применения пептида Ac-His-Ala-Glu-Glu-NH2 с N-терминальной ацетильной группой и С-терминальной амидной группой (далее в тексте обозначаемого как НАЕЕ), или его фармацевтически приемлемых солей, или его комплексов для восстановления физиологически нормальной концентрации эндогенного НАЕЕ в крови при психических расстройствах и расстройствах поведения. Изобретение обеспечивает возможность восстановления физиологически нормальной концентрации эндогенного НАЕЕ в крови при психических расстройствах и расстройствах поведения, характеризуемых падением уровнем эндогенного НАЕЕ в крови по сравнению с нормой.
Предшествующий уровень техники
Психическое расстройство характеризуется клинически значимым нарушением когнитивной функции, эмоциональной регуляции или поведения человека (https://www.who.int/ru/news-room/fact-sheets/detail/mental-disorders). При наличии внешних хронических стрессов уровень психических расстройств населения существенно возрастает (Charlson, F., М. van Ommeren, A. Flaxman, J. Cornett, H. Whiteford and S. Saxena (2019). "New WHO prevalence estimates of mental disorders in conflict settings: a systematic review and meta-analysis." Lancet 394(10194): 240-248).
На молекулярном уровне в регуляцию психического состояния вовлечены разнообразные нейрональные рецепторы, нейротрансмиттеры и нейропептиды (Casello S.M., Flores R.J., Yarar H.E., Wang H., Awanyai M., Arenivar M.A., Jaime-Lara R.B., Bravo-Rivera H., Tejeda H.A. Neuropeptide System Regulation of Prefrontal Cortex Circuitry: Implications for Neuropsychiatric Disorders. Front Neural Circuits. 2022 Jun 21; 16: 796443. doi: 10.3389/fncir.2022.796443. PMID: 35800635; PMCID: PMC9255232; Griebel, G., Holsboer, F. Neuropeptide receptor ligands as drugs for psychiatric diseases: the end of the beginning?. Nat Rev Drug Discov 11, 462-478 (2012). https://doi.org/10.1038/nrd3702).
Из научной и патентной литературы известно, что синтетический аналог участка 35-НАЕЕ-38 никотинового ацетилхолинового рецептора подтипа α4β2 (α4β2-nAChR), представляющий собой тетрапептид Ac-His-Ala-Glu-Glu-NH2 с N-терминальной ацетильной группой и С-терминальной амидной группой (далее обозначаемый как НАЕЕ), обладает следующими свойствами:
(1) специфически связывается с участком 11-EVHH-14 бета-амилоида (Аβ) (как в отсутствии ионов цинка (патент WO 2012/056157; патент РФ №2679080; Barykin, Е.Р. et al. (2020) Tetrapeptide Ac-HAEE-NH(2) Protects α4β2 nAChR from Inhibition by Aβ. Int J Mol Sci 21 (17)), так и в присутствии ионов цинка (Mitkevich, V.A. et al. (2023) Zn-dependent β-amyloid Aggregation and its Reversal by the Tetrapeptide HAEE. Aging Dis 14 (2), 309-318);
(2) при внутривенном введении экспериментальным животным (мыши, кролики, крысы) эффективно проникает через гематоэнцефалический барьер в головной мозг и является безопасным в широком диапазоне концентраций (Zolotarev, Y.A. et al. (2021) Pharmacokinetics and Molecular Modeling Indicate nAChRα4-Derived Peptide HAEE Goes through the Blood-Brain Barrier. Biomolecules 11 (6));
(3) эффективно подавляет образование амилоидных бляшек в животных моделях болезни Альцгеймера (Tsvetkov, P.O. et al. (2015) Peripherally Applied Synthetic Tetrapeptides HAEE and RADD Slow Down the Development of Cerebral β-Amyloidosis in AβPP/PSl Transgenic Mice. J Alzheimers Dis 46 (4), 849-53: Mitkevich, V.A. et al. (2023) Zn-dependent β-amyloid Aggregation and its Reversal by the Tetrapeptide HAEE. Aging Dis 14 (2), 309-318; патент РФ №2784249; патент РФ №2784319; патент РФ №2784326; патент РФ №2784425; патент РФ №2784732; патент РФ №2784746; патент РФ №2785354).
Из патентной литературы известны комплексы НАЕЕ с ионами металлов и соли НАЕЕ (патент РФ №2784249; патент РФ №2784319; патент РФ №2784326; патент РФ №2784425; патент РФ №2784732; патент РФ №2784746; патент РФ №2785354), а также тройной комплекс НАЕЕ с Zn и альбумином (патент РФ №2709539).
Из патентов РФ №2826728 и №2826726 известно, что пептид НАЕЕ является эндогенным компонентом крови человека и млекопитающих (коза, бык, лошадь, овца и мышь). Также из патентов РФ №2826728 и №2826726 следует, что введение в организм препаратов синтетического пептида НАЕЕ или фармацевтически приемлемых солей или комплексов пептида НАЕЕ может улучшать состояние человека или животных при нейровоспалительных заболеваниях, сопровождающихся дефицитом эндогенного НАЕЕ в крови.
В опубликованных источниках научной и патентной литературы нет сведений о том, как изменяется уровень эндогенного НАЕЕ в крови при психических расстройствах и расстройствах поведения. Также неизвестно, могут ли препараты синтетического пептида НАЕЕ или фармацевтически приемлемых солей или комплексов пептида НАЕЕ применяться для терапевтического лечения психических расстройств и расстройств поведения.
Сущность изобретения
В настоящем изобретении было обнаружено, что в крови крысы, курицы и осетра присутствует пептид Ac-His-Ala-Glu-Glu-NH2 с N-терминальной ацетильной группой и С-терминальной амидной группой (далее обозначаемый как НАЕЕ) эндогенной природы.
Неожиданно было установлено, что при психических расстройствах и расстройствах поведения наблюдается существенный дефицит эндогенного НАЕЕ в крови человека по сравнению с физиологической нормой.
Техническая проблема, на решение которой направлено изобретение, заключается в применении синтетического пептида НАЕЕ или его фармацевтически приемлемых солей или комплексов для восстановления физиологически нормальной концентрации эндогенного НАЕЕ в крови при психических расстройствах и расстройствах поведения.
Технический результат изобретения заключается в обеспечении возможности восстановления физиологически нормальной концентрации эндогенного НАЕЕ в крови при психических расстройствах и расстройствах поведения, характеризуемых падением уровня эндогенного НАЕЕ в крови по сравнению с физиологической нормой, за счет восстановления этого уровня после введения синтетического пептида НАЕЕ и/или производных синтетического пептида НАЕЕ, показывающих аналогичную эффективность. Под физиологической нормой, в соответствие с определением Медицинского словаря (Medical Dictionary for the Health Professions and Nursing. Farlex Partner Medical Dictionary. (2012), ссылка: https://www.medicinenet.com/normal_range/definition.htm), понимается диапазон значений, характерный для 95% процентов значений от нормальной популяции. Остальные нормальные результаты выходят за пределы нормального диапазона, как и любые действительно ненормальные результаты. В то же время, нормальный диапазон может варьировать для конкретного от возраста, роста, пола, этнической принадлежности или культуры пациента.
Заявленный технический результат обеспечивается путем применения синтетического пептида НАЕЕ или фармацевтически приемлемых солей или комплексов синтетического пептида НАЕЕ для восстановления физиологически нормальной концентрации эндогенного НАЕЕ в крови человека.
Фармацевтически приемлемыми солями синтетического пептида НАЕЕ могут быть одно- или двузамещенные соли натрия, калия или аммония.
Фармацевтически приемлемыми комплексами синтетического пептида НАЕЕ могут быть комплексы с цинком, медью, кальцием, магнием или другими катионами, способными взаимодействовать с молекулой НАЕЕ за счет электростатических и/или донорно-акцепторным взаимодействием.
Измерение концентрации НАЕЕ в плазме крови осуществляли методом, сочетающим разделение высокоэффективной жидкостной хроматографии и регистрацией на масс-детекторе (ВЭЖХ-МС) родительского квази-молекулярного иона и фрагментных ионов после предварительной экстракции на ион-обменном твердофазном носителе депротеинизированной фракции биологического материала (плазмы крови).
В изобретении продемонстрировано, что в плазме крови как у здоровых людей, так и у исследованных интактных животных (млекопитающие, птицы, рыбы) присутствует эндогенный пептид НАЕЕ в следующих физиологически нормальных концентрациях:
(1) 430±52 пг/мл для человека;
(2) 5023±227 пг/мл для козы;
(3) 1680±75 пг/мл для быка;
(4) 1589±176 пг/мл для лошади;
(5) 2545±271 пг/мл для овцы;
(6) 1179±86 пг/мл для мыши;
(7) 1720±190 пг/мл для крысы;
(8) 655±72 пг/мл для курицы;
(9) 796±85 пг/мл для осетра.
Авторами настоящего изобретения было обнаружено, что концентрация эндогенного НАЕЕ в плазме крови у пациентов с подтвержденными диагнозами психических расстройств и расстройств поведения составляет: (1) 160±70 пг/мл для непсихотического депрессивного расстройства в связи с сосудистым заболеванием головного мозга (постинсультная депрессия); (2) 223±81 пг/мл для смешанного тревожного и депрессивного расстройства (тревожно-депрессивное расстройство); (3) 247±78 пг/мл для генерализованного тревожного расстройства; (4) 136±65 пг/мл для посттравматического стрессового расстройства.
Таким образом, показано, что концентрация эндогенного пептида НАЕЕ в плазме крови пациентов с подтвержденными диагнозами психических расстройств и расстройств поведения (включая постинсультную депрессию, тревожно-депрессивное расстройство, генерализованное тревожное расстройство, посттравматическое стрессовое расстройство), значительно снижена по сравнению с физиологической нормой, которая у здоровых добровольцев составляет 430±52 пг/мл.
В настоящем изобретении было выявлено, что у крыс, которые используются для моделирования постинсультной депрессии, а также у крыс, использованных для моделирования депрессивно-подобного состояния, имеется существенный дефицит эндогенного НАЕЕ в плазме крови. Так как аналогичный дефицит эндогенного пептида НАЕЕ выявлен в настоящем изобретении и для людей с подтвержденными диагнозами психических расстройств и расстройств поведения (включая постинсультную депрессию, тревожно-депрессивное расстройство, генерализованное тревожное расстройство, постгравматическое стрессовое расстройство), то вследствие сходства функций молекул Аβ, α4β2-nAChR и НАЕЕ в организме человека и животных можно ожидать, что изменение уровня НАЕЕ в крови человека и животных вызывается сходными причинами.
Дефицит эндогенного НАЕЕ в крови животных, используемых для моделирования психических расстройств и расстройств поведения, существенно восстанавливается и приближается к физиологической норме при введении модельным животным терапевтической дозы следующих препаратов: (1) синтетического пептида НАЕЕ; (2) фармацевтически приемлемой соли синтетического пептида НАЕЕ; (3) фармацевтически приемлемого комплекса синтетического пептида НАЕЕ. Следовательно, концентрацию эндогенного пептида НАЕЕ в крови, сниженную при психических расстройствах и расстройствах поведения, можно в значительной степени восстановить с помощью введения синтетического пептида НАЕЕ или фармацевтически приемлемых солей или комплексов пептида НАЕЕ в организм. Так как в настоящем изобретении показано, что повышение уровня эндогенного пептида НАЕЕ в крови сопровождается улучшением состояния животных, используемых для моделирования психических расстройств и расстройств поведения, то применение синтетического пептида НАЕЕ или фармацевтически приемлемых солей или комплексов пептида НАЕЕ для восстановления физиологически нормального уровня эндогенного НАЕЕ в крови может использоваться для терапии таких расстройств.
Введение синтетического пептида НАЕЕ или фармацевтически приемлемых солей или комплексов пептида НАЕЕ пациенту может осуществляться с помощью всех возможных видов наружного, энтерального, ингаляционного и парентерального способов применения (включая внутривенное, внутриартериальное, внутрибрюшинное, подкожное, накожное, трансдермальное, внутримышечное, интратекальное, субарахноидальное, пероральное, интраназальное, сублингвальное, буккальное, ректальное введение). При введении синтетического пептида НАЕЕ или фармацевтически приемлемых солей или комплексов пептида НАЕЕ в твердой форме предпочтительным способом приема является сублингвальный. При введении синтетического пептида НАЕЕ или фармацевтически приемлемых солей или комплексов пептида НАЕЕ в форме раствора предпочтительными способами введения являются внутривенный, подкожный и интраназальный.
Возможность терапевтического лечения психических расстройств и расстройств поведения посредством восстановления физиологически нормальной концентрации эндогенного пептида НАЕЕ показана с использованием животных моделей, включая:
(1) модель геморрагического инсульта (А.Н. Макаренко, Н.С Косицын., С.В. Карпенко, В.А. Мишина. А.с. СССР. №1767518,03.11 1990; A. Jackowski, A. Crockard, G. Burnstock et al. The time course of intracranial pathophysiological changes following experimental subarachnoid haemorrage in the rat // J. Cerebral Blood Flow and Metabolism. 1990. V. 10. P. 835-849; Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств, Издание ФГБУ «НЦЭМСП» Минздравсоцразвития России, - 2012. М.: Изд-во Гриф и К.С. 276-296. С. 480-487);
(2) модель депрессивно-подобного состояния при длительном хроническом стрессе (Chiba, S., Т. Numakawa, М. Ninomiya, М. С.Richards, С.Wakabayashi and Н. Kunugi (2012). "Chronic restraint stress causes anxiety- and depression-like behaviors, downregulates glucocorticoid receptor expression, and attenuates glutamate release induced by brain-derived neurotrophic factor in the prefrontal cortex." Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry 39(1): 112-119; Singh, S., S. Tripathy, A. Rawat, D. Dubey, S. A. Siddiqui, R. Ugale, D. Kumar and A. Prakash (2023). "Pre-clinical Investigations of Therapeutic Markers Associated with Acute and Chronic Restraint Stress: A Nuclear Magnetic Resonance Based Contrast Metabolic Approach." Nanotheranostics 7(1): 91-101).
Описание чертежа
Фиг. 1 Хроматограммы изолированного ионного тока фрагментов b1, b2, b3 и a1 внутреннего стандарта с включением двух стабильных изотопов углерода [13С] в конечной концентрации 1 нг/мл и пептида НАЕЕ после экстракции из пробы плазмы крови человека. Расчетная концентрация НАЕЕ по относительному отклику площади под пиком иона-квантора [13С2]-b1 с m/z=182,0814 составила 0,322 нг/мл (А). Участки деконволюции масс-спектра фрагментов внутреннего стандарта с включением стабильных изотопов углерода [13С] и соответствующих фрагментных ионов НАЕЕ в пробе плазмы крови после экстракции (Б). Композитные спектры фрагментации НАЕЕ и внутреннего стандарта с включением стабильных изотопов углерода [13С], а также остаточные сигналу родительского иона внутреннего стандарта с m/z=528 и НАЕЕ с m/z=526 в пробе плазмы крови после экстракции. Дистанция между фрагментами и родительскими ионами внутреннего стандарта с НАЕЕ составляет в среднем 2,0067 атомных единиц массы (без поправки на дефект массы), что соответствует включению двух изотопов углерода [13С] в молекуле внутреннего стандарта (В).
Описание приборов
Измерение концентрации НАЕЕ в плазме крови осуществляли методом ВЭЖХ-МС на масс-спектрометре XEVO G2-XS Q-TOF (Waters, Ирландия) с модульной ВЭЖХ системой Acquity UPLC H-Class Plus. Выполняли регистрацию на масс-детекторе родительского квази-молекулярного иона и фрагментных ионов после предварительной экстракции на ион-обменном твердофазном носителе депротеинизированной фракции биологического материала (плазмы крови).
Примеры осуществления изобретения
Изобретение иллюстрируется нижеприведенными примерами, но не ограничивается ими.
Пример 1. Определение концентраций эндогенного пептида НАЕЕ в плазме крови здоровых добровольцев и животных (часть данных была ранее опубликована в патентах РФ №2826728 и 2826726)
Забор венозной крови проводили у здоровых добровольцев (возрастной интервал генерализованной выборки от 37 до 86 полных лет) и у следующих видов млекопитающих: (1) коза домашняя (возрастной интервал генерализованной выборки от 5 до 10 полных лет); (2) бык домашний (возрастной интервал генерализованной выборки от 8 до 13 полных лет); (3) лошадь домашняя (возрастной интервал генерализованной выборки от 8 до 14 полных лет); (4) овца домашняя (возрастной интервал генерализованной выборки от 4 до 7 полных лет); (5) мышь домовая (возрастной интервал генерализованной выборки от 6 до 9 полных месяцев). В течение получаса после забора крови готовили аликвоты плазмы крови (ЭДТА-2К+), которые замораживали для длительного хранения.
Измерение концентрации НАЕЕ в плазме крови осуществляли методом, сочетающим разделение высокоэффективной жидкостной хроматографии и регистрацией на масс-детекторе (ВЭЖХ-МС) родительского квази-молекулярного иона и фрагментных ионов после предварительной экстракции на ион-обменном твердофазном носителе депротеинизированной фракции биологического материала (плазмы крови). К 100 мкл плазмы крови добавляли 10 мкл раствора химически идентичного, но отличного по изотопному составу внутреннего стандарта НАЕЕ, отличающегося на Δm=+2.0067 а.е. или иную массу в зависимости от изотопной композиции внутреннего стандарта, до конечной концентрации 1 нг/мл (1000 пг/мл). Далее, к смеси плазмы крови с внутренним стандартом добавляли семь объемов смеси органических растворителей (метанол, ацетонитрил и вода) в соотношениях 7:2:1. После добавления смеси органических растворителей наблюдали формирование взвеси белого или молочного цвета. Взвесь инкубировали при температуре 40°С в течение 10 минут при постоянном перемешивании на скорости 1100 об/мин. По окончании инкубирования, взвесь осветляли центрифугированием при ускорении 15000 g в угловом роторе при температуре 10°С в течение 10 минут. Затем количественно отбирали надосадочную жидкость (750 мкл) и переносили ее к 5 мл охлажденного водного раствора 2.5% гидроксида аммония для снижения конечной концентрации органических растворителей (метанола и ацетонитрила) и сенситизации целевого (выделяемого) компонента НАЕЕ и внутреннего стандарта в условиях основной реакции среды. Полученный раствор фракции плазмы крови в растворе 2,5% гидроксида аммония (около 5,7 мл) наносили на сильный смешанный анион-обменный твердофазных носитель, предварительно промытый последовательно в метаноле (1 мл), ацетонитриле (1 мл), воде (1 мл) и стабилизированный в 2.5% водном растворе гидроксида аммония (2 мл). После нанесения фракции плазмы крови (около 5.7 мл) на стабилизированный носитель уравновешивают твердофазный носитель со связанным с ним НАЕЕ и внутренним стандартом в растворе 2.5% водного гидроксида аммония (2 мл). Затем промывают носитель последовательно в воде (1 мл) и в 60% водном растворе метанола (1 мл). Коэлюцию НАЕЕ и внутреннего стандарта в одной фракции осуществляют раствором 3% муравьиной кислоты в ацетонитриле (0,6 мл). Собранную фракцию высушивали под вакуумом в концентраторе при температуре, не превышающей 45°С, до сухого остатка (полного испарения органического растворителя). Полученный сухой остаток восстанавливали в 30 мкл водного раствора 0.1% муравьиной кислоты для дальнейшего инструментального анализа методом ВЭЖХ-МС.
Регистрацию сигнала эндогенного пептида НАЕЕ в плазме крови (ЭДТА-2К+) проводили методом высокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании с масс-спектрометрией (ВЭЖХ-МС) в режиме положительной электростатической ионизации и тандемного или адресного сканирования по прекурсорному и фрагментным ионам. Количественную оценку проводили по площади или высоте хроматографического пика изолированного ионного тока прекурсорного иона или базового фрагментного иона-квантора эндогенного пептида НАЕЕ и внутреннего стандарта [С2]-НАЕЕ, отличающегося от НАЕЕ по изотопному составу из-за включения двух изотопов [13С2] атома углерода, то есть отличного от НАЕЕ на +2.00671 атомных единиц массы (Фиг. 1).
Таким образом, аликвота плазмы крови после необходимых лабораторных процедур, направленных на получение обогащенной по НАЕЕ и внутреннему стандарту фракции, анализировалась количественным методом масс-спектрометрии с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии и внутреннего изотопно-меченного стандарта.
Было определено, что средняя концентрация эндогенного пептида НАЕЕ в исследованных образцах плазмы крови здоровых добровольцев (n=10) составляла 430+52 пг/мл. Это значение отражает физиологически нормальную концентрацию эндогенного пептида НАЕЕ в плазме крови человека.
Также обнаружено, что в плазме крови исследованных групп (n=10) интактных животных (млекопитающие, птицы, рыбы) присутствует эндогенный пептид НАЕЕ в следующих физиологически нормальных концентрациях: (1) 1720+Л90 пг/мл для крысы; (2) 655±72 пг/мл для курицы; (3) 796±85 пг/мл для осетра.
Пример 2. Определение концентрации эндогенного пептида НАЕЕ в плазме крови у пациентов с подтвержденными диагнозами психических расстройств и расстройств поведения
С использованием количественного метода анализа концентрации эндогенного пептида НАЕЕ в соответствие с Примером 1 настоящего изобретения установлены концентрации эндогенного пептида НАЕЕ в плазме крови у пациентов с подтвержденными диагнозами следующих психических расстройств и расстройств поведения составляет: (1) непсихотическое депрессивное расстройства в связи с сосудистым заболеванием головного мозга (постинсультная депрессия); (2) смешанное тревожное и депрессивное расстройство (тревожно-депрессивное расстройство); (3) генерализованное тревожное расстройство; (4) посттравматическое стрессовое расстройство.
На основании проведенных измерений в группах пациентов (n=10) были определены следующие значения средних концентраций эндогенного пептида НАЕЕ в плазме крови:
(1) 160±70 пг/мл для непсихотического депрессивного расстройства в связи с сосудистым заболеванием головного мозга (постинсультная депрессия);
(2) 223±81 пг/мл для смешанного тревожного и депрессивного расстройства (тревожно-депрессивное расстройство);
(3) 247±78 пг/мл для генерализованного тревожного расстройства;
(4) 136±65 пг/мл для посттравматического стрессового расстройства.
Таким образом, у всех пациентов с подтвержденными диагнозами психических расстройств и расстройств поведения наблюдается значительный дефицит эндогенного пептида НАЕЕ в плазме крови по сравнению с физиологически нормальной концентрацией эндогенного пептида НАЕЕ, которая по данным из Примера 1 составляет 430±52 пг/мл.
Пример 3. Применение синтетического пептида НАЕЕ и его производных для восстановления дефицита эндогенного пептида НАЕЕ в плазме крови и для уменьшения тревожности и депрессии у крыс с геморрагическим инсультом
Одним из наиболее распространенных последствий, с которым сталкиваются пациенты, перенесшие внутримозговое кровоизлияние (геморрагический инсульт), является постинсультная депрессия и тревожность (Hackett M.L., Pickles K. Part I: frequency of depression after stroke: an updated systematic review and meta-analysis of observational studies. Int J Stroke. 2014 (Dec), 9 (8), p. 1017-25; Вознесенская Т.Г. Депрессия при цереброваскулярных заболеваниях // Неврол. нейропсихиатр и психосом. №2, 2009, с. 9-13; Парфенов Владимир Анатольевич Постинсультная депрессия: распространенность, патогенез, Диагностика и лечение // Неврология, нейропсихиатрия, психосоматика. 2012. №4).
Исследование терапевтических эффектов синтетического НАЕЕ и его производных на восстановление физиологического уровня эндогенного НАЕЕ в периферической крови и на уменьшение тревожности и депрессии у животных, перенесших геморрагический инсульт, проведено на модели интрацеребральной посттравматической гематомы (геморрагического инсульта) у крыс (А.Н. Макаренко, Н.С. Косицын., С.В. Карпенко, В.А. Мишина. А.с. СССР. №1767518, 03.11.1990; А. Jackowski, A. Crockard, G. Burnstock et al. The time course of intracranial pathophysiological changes following experimental subarachnoid haemorrage in the rat // J. Cerebral Blood Flow and Metabolism. 1990. V. 10. P. 835-849; Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств, Издание ФГБУ «НЦЭМСП» Минздравсоцразвития России, - 2012. М.: Изд-во Гриф и К.С. 276-296. С. 480-487).
Эксперименты были выполнены на половозрелых беспородных белых крысах массой 280-300 г (самцы, 80 особей). Наркотизированных хлоралгидратом крыс (400 мг/кг, внутрибрюшинно) подвергали трепанации черепа и осуществляли деструкцию мозговой ткани в области внутренней капсулы (координаты Н=4,5-5 мм, L=3,5 мм, А=2 мм от брегмы) по атласу Буреша с последующим введением в место повреждения крови, взятой из-под языка (20-30 мкл).
На 10, 20 и 30 сутки после операции проводили следующие процедуры (Таблица 1); (1) измерение уровня эндогенного НАЕЕ в крови; (2) оценка тревожного состояния в тесте «Приподнятый крестообразный лабиринт» (ПКЛ); (3) оценка депрессивного состояния в тесте «Вынужденное плавание» (ВП).
За 3 дня до операции у 5 случайно выбранных крыс из 80 была измерена концентрация эндогенного НАЕЕ в крови, а также для этих животных были проведены тесты ПКЛ (Таблица 2) и ВП (Таблица 3).
На 10 день после операции выжило 23 крысы, из которых были сформированы 4 экспериментальные группы (n=5). Животным из трех групп вводили внутрибрюшинно в дозе 0,3 мг/кг в пересчете на массу пептида НАЕЕ следующие вещества: (1) синтетический пептид НАЕЕ; (2) однозамещенную натриевую соль НАЕЕ; (3) цинковый комплекс НАЕЕ. Крысам из четвертой (контрольной) группы вводили физиологический раствор. Каждому животному из сформированных экспериментальных групп было сделано 8 инъекций в период с 11 по 27 день исследования (Таблица 1).
Для оценки тревожного и депрессивного состояний животных в постинсультный период использовали тест «Приподнятый крестообразный лабиринт» (ПКЛ) (Семина И.И., Байчурина А.З., Никитин Д.О., Никитина А.В., Мустафин Р.И., Хуторянский В.В. Поведенческая фармакология как основной подход в изучении эффективности потенциальных психотропных средств: анализ современных методов. Разработка и регистрация лекарственных средств. 2023; 12(1): 161-181. https://doi.org/10.33380/2305-2066-2023-12-1-161-181) и тест «Вынужденное плавание» (ВП) (Молодавкин Г.М., Воронина Т. А., Мдзинаришвили А.Л. Особенности влияния фармакологических веществ разных классов на вынужденное плавание у крыс. Эксперим. и клин. Фармаколология, 1994, 57, №1, 3-5; Nomura S., Shimizu J., Kinjo M. et al., A new behavioral test for antidepressant drugs, Eur. J. Pharmacol., 1982, 83, №3-4, 171-175), соответственно. Измерения концентрации эндогенного НАЕЕ в крови животных проводили по методике из Примера 1 настоящего изобретения.
Тест «Приподнятый крестообразный лабиринт» (ПКЛ) проводили в приподнятом крестообразном лабиринте, который состоял из крестообразно расходящихся от центральной площадки под прямым углом 4-х рукавов: два противоположных открытых без стенок светлых и два закрытых темных. Центральная площадка и пол открытых рукавов прозрачны, тогда как пол и стенки закрытых рукавов покрашены в темный цвет. Рукава имели размеры - ширину 5 см и длину 20 см, высота стенок 14 см, центральная площадка 5×5 см, ПКЛ приподнят над полом на 100 см. Методика основана на естественном страхе нахождения грызунов на открытых площадках и падения с высоты и навыке предпочтения животными темных нор. Непосредственно перед началом эксперимента животных выдерживали (от 3 до 5 мин) в темных клетках. Затем животное помещали в ПКЛ на центральную площадку, головой к открытому рукаву и в течение минут регистрировали время пребывания животных в открытых и закрытых рукавах, количество заходов в открытые и закрытые рукава и число дефекаций. Состояние животного оценивали по следующим параметрам: (1) число заходов в светлые открытые рукава; (2) время нахождения в светлых рукавах; (3) число заходов в закрытые рукава; (4) время нахождения в закрытых рукавах. Уровень эндогенного НАЕЕ в крови крыс и результаты теста ПКЛ на всех этапах проведения исследования приведены в Таблице 2.
Тест «Вынужденное плавание» (ВП) проводили на установке, которая представляла собой собой сосуд размером 64×30×42 см, разделенный на 4 равных отсека. В отсеках находятся колеса шириной 11 см с 12 лопастями шириной 2 см, наружный диаметр колес 10 см. На краях каждого колеса укреплены магниты, а над колесами - герконы, которые срабатывают каждый раз, когда магнит проходит под ними и таким образом происходит автоматическая регистрация оборотов колес, которая является объективной мерой активности животных. Сосуд заполняли водой с температурой 25°С до середины колес. Крыс помещали в сосуд с водой в каждый отсек мордой от колеса и животные старались выбраться из воды с их помощью. Поскольку колеса вращались свободно, эти попытки оставались безуспешными, и у животных развивалось депрессивноподобное состояние, которое выражалось в отказе от борьбы. Вещества с антидепрессивной активностью облегчают это состояние, повышая число оборотов колес. Мерой депрессивноподобного состояния являлось число оборотов колеса (чем ниже число оборотов, тем более выражено это состояние). Число оборотов колес регистрировали в течение 5 минут с помощью специальных герконовых электромеханических датчиков. Уровень эндогенного НАЕЕ в крови крыс и результаты теста ВП на всех этапах проведения исследования приведены в Таблице 3.
Результаты исследования, обобщенные в Таблице 2 и Таблице 3, свидетельствуют о том, что средний уровень эндогенного НАЕЕ в крови крыс на 10 день после геморрагического инсульта составляет 619 пг/мл, что почти в 3 раза меньше физиологической нормы НАЕЕ (1756 пг/мл), наблюдаемой у тех же животных перед операцией. На 30 день после операции наблюдаемый постинсультный дефицит эндогенного НАЕЕ эффективно восстанавливается после курсового введения как синтетического НАЕЕ, так и его производных (Таблица 2, Таблица 3). Восстановление дефицита эндогенного НАЕЕ под действием инъекций НАЕЕ и его производных происходит параллельно с улучшением состояния животных, оцениваемого по данным тестов ПКЛ (Таблица 2) и ВП (Таблица 3). В то же время, по сравнению с крысами, которым вводили НАЕЕ или его производные, уровень эндогенного НАЕЕ у животных из контрольной группы, которым вводили физиологический раствор, был примерно в 2 раза ниже, а результаты тестов ПКЛ и ВП свидетельствовали о более выраженном тревожном и депрессивном состояниях у контрольных крыс (Таблица 2, Таблица 3).
Таким образом, синтетический НАЕЕ, однозамещенная натриевая соль НАЕЕ и цинковый комплекс НАЕЕ при введении крысам, перенесшим геморрагический инсульт, восстанавливают постинсультный дефицит эндогенного НАЕЕ в крови животных и вызывают уменьшение тревожности и депрессии у животных.
Пример 4. Применение синтетического пептида НАЕЕ и его производных для восстановления дефицита эндогенного пептида НАЕЕ в плазме крови и для уменьшения тревожности и депрессивно-подобного состояния у крыс после хронического стресса Хронический стресс вовлечен в патофизиологию депрессивных расстройств, и в настоящее время хронический стресс, вызванный ограничением подвижности, является наиболее распространенной животной моделью тревожно-депрессивных расстройств (Gururajan, A., A. Reif, J.F. Cryan and D.A. Slattery (2019). "The future of rodent models in depression research." Nature Reviews Neuroscience 20(11): 686-701).
Исследование терапевтических эффектов синтетического НАЕЕ и его производных на восстановление физиологического уровня эндогенного НАЕЕ в периферической крови и на уменьшение тревожности и депрессии у крыс, подвергнутых хроническому стрессу, проведено на модели «Хроническое ограничение подвижности» (ХОП) (Chiba, S., Т. Numakawa, М. Ninomiya, М.С. Richards, С. Wakabayashi and Н. Kunugi (2012). "Chronic restraint stress causes anxiety- and depression-like behaviors, downregulates glucocorticoid receptor expression, and attenuates glutamate release induced by brain-derived neurotrophic factor in the prefrontal cortex." Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry 39 (1): 112-119).
Эксперименты были выполнены на половозрелых самцах беспородных белых крыс массой 280-300 г в количестве 20 особей. Было сформировано 4 экспериментальные группы (n=5). Моделирование хронического стресса путем ограничения подвижности проводилось следующим образом. Животных заворачивали в пластиковые пакеты, изготовленные в форме конуса таким образом, чтобы крыса становилась полностью обездвиженной до конца эксперимента, но могло комфортно дышать только через отверстие, созданное на ростральном конце животного, и им не разрешалось получать доступ ни к еде, ни к воде в течение периода ограничения подвижности. Ограничение подвижности проводилось ежедневно с 9 до 15 ч (6 ч/день) в течение 28 дней.
После окончания стрессового воздействия в течение 7 дней животным из трех групп вводили внутрибрюшинно в дозе 0,3 мг/кг в пересчете на массу пептида НАЕЕ следующие вещества: (1) синтетический пептид НАЕЕ; (2) однозамещенную натриевую соль НАЕЕ; (3) цинковый комплекс НАЕЕ. Крысам из четвертой (контрольной) группы вводили физиологический раствор. В течение 7 дней после завершения стрессового воздействия (хронического ограничения подвижности) каждому животному из сформированных экспериментальных групп было сделано 5 инъекций одного из вышеуказанных веществ (Таблица 4, Таблица 5).
За три дня до начала 28-дневного стрессового воздействия, а также через день и через 7 дней после его завершения у всех животных измеряли уровень эндогенного НАЕЕ в крови и тестировали состояние тревожности и депрессии у животных Таблица 4, Таблица 5). Измерения концентрации эндогенного НАЕЕ в крови животных проводили по методике из Примера 1 настоящего изобретения. Для оценки тревожного и депрессивного состояний животных использовали тест «Приподнятый крестообразный лабиринт» (ПКЛ) и тест «Вынужденное плавание» в соответствие с Примером 3 настоящего исследования.
Результаты исследования, обобщенные в Таблице 4 и Таблице 5, свидетельствуют о том, что средний уровень эндогенного НАЕЕ в крови крыс после хронического стресса (в течение 28 дней) составляет 567 пг/мл, что примерно в 3 раза меньше физиологической нормы НАЕЕ (1744 пг/мл), наблюдаемой у тех же животных перед стрессовым воздействием. Инъекции исследуемых веществ (синтетический НАЕЕ, однозамещенная натриевая соль НАЕЕ, цинковый комплекс НАЕЕ) в течение 7 дней приводят к восстановлению уровня НАЕЕ до физиологической нормы, в то время как у контрольных животных концентрация эндогенного НАЕЕ составляла 763 пг/мл, что более чем в 2 раза ниже нормы, то есть у контрольных животных сохранялся значительный дефицит эндогенного НАЕЕ.
Восстановление дефицита эндогенного НАЕЕ под действием инъекций НАЕЕ и его производных происходит параллельно с улучшением состояния животных, оцениваемого по данным тестов ПКЛ (Таблица 4) и ВП (Таблица 5). В то же время, по сравнению с крысами, которым вводили НАЕЕ или его производные, уровень эндогенного НАЕЕ у животных из контрольной группы, которым вводили физиологический раствор, был примерно в 2 раза ниже, а результаты тестов ПКЛ и ВП свидетельствовали о более выраженном тревожном и депрессивном состояниях у контрольных крыс (Таблица 4, Таблица 5).
Таким образом, синтетический НАЕЕ, однозамещенная натриевая соль НАЕЕ и цинковый комплекс НАЕЕ при введении крысам, перенесшим хронический стресс, восстанавливают дефицит эндогенного НАЕЕ в крови и вызывают уменьшение тревожности и депрессии у животных.
Изобретение относится к медицине, в частности к психофармакологии. Предложено применение пептида Ac-His-Ala-Glu-Glu-NH2 c N-терминальной ацетильной группой и C-терминальной амидной группой (HAEE), или его фармацевтически приемлемых солей, или его комплексов для восстановления физиологически нормальной концентрации эндогенного HAEE в крови при психических расстройствах и расстройствах поведения. Изобретение обеспечивает возможность восстановления физиологически нормальной концентрации эндогенного HAEE в крови при психических расстройствах и расстройствах поведения, характеризуемых падением уровня эндогенного HAEE в крови по сравнению с нормой. 1 з.п. ф-лы, 1 ил., 5 табл., 4 пр.
1. Применение пептида Ac-His-Ala-Glu-Glu-NH2 с N-терминальной ацетильной группой и С-терминальной амидной группой (НАЕЕ), или его фармацевтически приемлемых солей, или его фармацевтически приемлемых комплексов с катионами металлов для восстановления физиологически нормальной концентрации эндогенного НАЕЕ в крови человека и животных при психических расстройствах и расстройствах поведения.
2. Применение по п. 1, которое показано при сниженном уровне НАЕЕ в плазме крови по сравнению с нормой.
