Изобретение относится к ветеринарии и касается применения пептида Ac-His-Ala-Glu-GI11-NH2 с N-терминальной ацетильной группой и С-терминальной амидной группой (далее в тексте обозначаемого как НАЕЕ), или его фармацевтически приемлемых солей, или его комплексов для восстановления физиологически нормальной концентрации эндогенного НАЕЕ в крови при заболеваниях или нарушениях здоровья животных, сопряженных с нейровоспалением.
Предшествующий уровень техники
Многие заболевания и нарушения здоровья могут сопровождаться нейровоспалением: черепно-мозговые травмы [Simon, D.W. et al. (2017) The far-reaching scope of neuroinflammation after traumatic brain injury. Nature Reviews Neurology 13 (3), 171-191], спинно-мозговые травмы [Hellenbrand, D.J. et al. (2021) Inflammation after spinal cord injury: a review of the critical timeline of signaling cues and cellular infiltration. Journal of Neuroinflammation 18 (1), 284], инсульт [Anrather, J. and Iadecola, C. (2016) Inflammation and Stroke: An Overview. Neurotherapeutics 13 (4), 661-670], ковид-19 [Vanderheiden, A. and Klein, R.S. (2022) Neuroinflammation and COVID-19. Curr Opin Neurobiol 76, 102608], делирий [Cerejeira, J. et al. (2012) The Cholinergic System and Inflammation: Common Pathways in Delirium Pathophysiology. Journal of the American Geriatrics Society 60 (4), 669-675; Lyman, M. et al. (2014) Neuroinflammation: the role and consequences. Neurosci Res 79, 1-12], сахарный диабет [Olasehinde, Т.A. et al. (2022) Neuroinflammatory Biomarkers in Diabetic Encephalopathy: Linking Cholinergic and Cognitive Dysfunction. In Biomarkers in Diabetes (Patel, V.B. and Preedy, V.R. eds), pp. 1-20, Springer International Publishing], опухоли периферических нервов и центральной нервной системы [Balkwill, F. and Mantovani, Α. (2001) Inflammation and cancer: back to Virchow? The lancet 357 (9255), 539-545; Gysler, S.M. and Drapkin, R. (2021) Tumor innervation: peripheral nerves take control of the tumor microenvironment. The Journal of Clinical Investigation 131 (11); Shalapour, S. and Karin, M. (2019) Pas de Deux: Control of Anti-tumor Immunity by Cancer-Associated Inflammation. Immunity 51 (1), 15-26], а также ряд аутоиммунных болезней (например, рассеянный склероз [Filippi, Μ. et al. (2018) Multiple sclerosis. Nature Reviews Disease Primers 4 (1), 43; Kamma, E. et al. (2022) Central nervous system macrophages in progressive multiple sclerosis: relationship to neurodegeneration and therapeutics. Journal of Neuroinflammation 19 (1), 45], системная красная волчанка) [Gottschalk, T.A. et al. (2015) Pathogenic Inflammation and Its Therapeutic Targeting in Systemic Lupus Erythematosus. Front Immunol 6, 550]) и все нейродегенеративные заболевания (например, болезнь Альцгеймера [Leng, F. and Edison, P. (2021) Neuroinflammation and microglial activation in Alzheimer disease: where do we go from here? Nature Reviews Neurology 17 (3), 157-172], болезнь Пика (или лобно-височная деменция) [Chu, Μ. et al. (2023) Peripheral inflammation in behavioural variant frontotemporal dementia: associations with central degeneration and clinical measures. Journal of Neuroinflammation 20 (1), 65], болезнь Паркинсона [Troncoso-Escudero, P. et al. (2018) Outside in: Unraveling the Role of Neuroinflammation in the Progression of Parkinson's Disease. Front Neurol 9, 860], боковой амиотрофический склероз [Robberecht, W. and Philips, T. (2013) The changing scene of amyotrophic lateral sclerosis. Nature Reviews Neuroscience 14 (4), 248-264], церебральная амилоидная ангиопатия [de Souza, A. and Tasker, K. (2023) Inflammatory Cerebral Amyloid Angiopathy: A Broad Clinical Spectrum. J Clin Neurol 19 (3), 230-241]). Неизбежным результатом нейровоспаления является деградация и гибель нейронов (нейродегенерация) [Zhang, W. et al. (2023) Role of neuroinflammation in neurodegeneration development. Signal Transduction and Targeted Therapy 8 (1), 267]. Как следствие нейродегенерации, у пациентов снижаются качество и продолжительность жизни, а также может развиваться приобретенное слабоумие (деменция) [Ahmad, М.А. et al. (2022) Neuroinflammation: A Potential Risk for Dementia. Int J Mol Sci 23 (2)]. Поэтому актуальным является разработка лекарственных средств и лечебных технологий, направленных на регуляцию нейровоспаления [van der Flier, W.M. et al. (2023) Towards a future where Alzheimer's disease pathology is stopped before the onset of dementia. Nature Aging 3 (5), 494-505].
Из научной и патентной литературы известно, что синтетический аналог участка 35-НАЕЕ-38 никотинового ацетилхолинового рецептора подтипа α4β2 (α4β2-nAChR), представляющий собой тетрапептид Ac-His-Ala-Glu-Glu-NH2 с N-терминальной ацетильной группой и С-терминальной амидной группой (далее обозначаемый как НАЕЕ), обладает следующими свойствами:
(1) специфически связывается с участком 11-EVHH-14 бета-амилоида (Αβ) (как в отсутствии ионов цинка [патент WO 2012/056157; патент РФ №2679080; Barykin, Е.Р. et al. (2020) Tetrapeptide Ac-HAEE-NH(2) Protects α4β2 nAChR from Inhibition by Αβ. Int J Mol Sci 21 (17)], так и в присутствии ионов цинка [Mitkevich, V.A. et al. (2023) Zn-dependent β-amyloid Aggregation and its Reversal by the Tetrapeptide HAEE. Aging Dis 14 (2), 309-318];
(2) при внутривенном введении экспериментальным животным (мыши, кролики, крысы) эффективно проникает через гематоэнцефалический барьер в головной мозг и является безопасным в широком диапазоне концентраций [Zolotarev, Y.A. et al. (2021) Pharmacokinetics and Molecular Modeling Indicate nAChRα4-Derived Peptide HAEE Goes through the Blood-Brain Barrier. Biomolecules 11 (6)];
(3) эффективно подавляет образование амилоидных бляшек в животных моделях болезни Альцгеймера [Tsvetkov, P.O. et al. (2015) Peripherally Applied Synthetic Tetrapeptides HAEE and RADD Slow Down the Development of Cerebral β-Amyloidosis in ΑβΡΡ/PS1 Transgenic Mice. J Alzheimers Dis 46 (4), 849-53: Mitkevich, V.A. et al. (2023) Zn-dependent β-amyloid Aggregation and its Reversal by the Tetrapeptide HAEE. Aging Dis 14 (2), 309-318; патент РФ №2784249; патент РФ №2784319; патент РФ №2784326; патент РФ №2784425; патент РФ №2784732; патент РФ №2784746; патент РФ №2785354].
Из патентной литературы известны комплексы НАЕЕ с ионами металлов и соли НАЕЕ [патент РФ №2784249; патент РФ №2784319; патент РФ №2784326; патент РФ №2784425; патент РФ №2784732; патент РФ №2784746; патент РФ №2785354], а также тройной комплекс НАЕЕ с Zn и альбумином [патент РФ №2709539].
Авторы настоящего изобретения подчеркивают, что с момента описания синтетического пептида НАЕЕ в WO 2012/056157 на протяжении более десяти лет он рассматривался как разработанный терапевтический агент, который можно вводить в организм для препятствования агрегации Αβ в тканях головного мозга. Таким образом, ранее была известна только способность синтетического пептида НАЕЕ ингибировать образование агрегатов Αβ, которые ассоциированы с развитием болезни Альцгеймера.
В опубликованных источниках научной и патентной литературы нет сведений как о том, что пептид НАЕЕ является эндогенным компонентом крови человека или животных, так и о том, что введение в организм пептида НАЕЕ или фармацевтически приемлемых солей или комплексов пептида НАЕЕ может влиять на концентрацию эндогенных компонентов крови человека или животных, и следовательно, оказывать терапевтический эффект при заболеваниях, сопровождающихся его дефицитом в организме, например, с заболеваниями, сопряженными с нейровоспалением.
Сущность изобретения
Неожиданно в настоящем изобретении было обнаружено, что в крови человека, а также в крови таких млекопитающих как коза, бык, лошадь, овца и мышь, присутствует пептид Ac-His-Ala-Glu-Glu-NH2 с N-терминальной ацетильной группой и С-терминальной амидной группой (далее обозначаемый как НАЕЕ) эндогенной природы.
Неожиданно было установлено, что дефицит НАЕЕ в крови человека или животных связан с заболеваниями или нарушениями здоровья, которые характеризуются нейровоспалением: если у человека или животных выявлено нейровоспаление, то уровень НАЕЕ существенно снижен по сравнению с физиологической нормой.
Неожиданно было обнаружено, что курсовое введение синтетического пептида НАЕЕ в организм животных, которые использовались для моделирования различных заболеваний или нарушений, связанных с нейровоспалением, и у которых на момент введения НАЕЕ имелись характерные признаки этих заболеваний или нарушений, приводило к восстановлению физиологически нормальной концентрации эндогенного НАЕЕ в крови этих животных. Такое восстановление сопровождалось улучшением состояния здоровья экспериментальных животных и ослаблением у этих животных клинических проявлений соответствующих заболеваний или нарушений, а также уменьшением смертности в экспериментальных группах животных. Таким образом, применение экзогенного НАЕЕ для восстановления уровня эндогенного НАЕЕ в крови может использоваться в качестве средства для терапии заболеваний и нарушений здоровья, ассоциированных с падением уровня концентрации эндогенного НАЕЕ в крови.
Неожиданно было определено, что курсовое введение синтетического пептида НАЕЕ в организм здоровых животных не влияет на уровень физиологически нормальной концентрации эндогенного НАЕЕ в крови этих животных, не вызывает у них видимого ухудшения состояния здоровья и не приводит к каким-либо токсическим эффектам или побочным действиям. Из этих данных следует, что избыточное количество НАЕЕ в крови, обусловленное курсовым введением синтетического НАЕЕ в организм здоровых животных, не приносит вреда здоровью, не приводит к накоплению НАЕЕ, а также не вызывает нарушения секреции эндогенного НАЕЕ.
Неожиданно было выявлено, что курсовое введение синтетического пептида НАЕЕ в организм здоровых животных, которые затем подвергались травмирующим воздействиям головного мозга (модель черпно-мозговой травмы (ЧМТ)), приводило к уменьшению последствий ЧМТ по сравнению с контрольными животными, не получавших НАЕЕ. Эти данные свидетельствуют о нейропротекторной функции НАЕЕ.
Техническая проблема, на решение которой направлено изобретение, заключается в применении синтетического пептида НАЕЕ или его фармацевтически приемлемых солей или комплексов для восстановления физиологически нормальной концентрации эндогенного НАЕЕ в крови при заболеваниях или нарушениях здоровья животных, сопряженных с нейровоспалением.
Технический результат изобретения заключается в обеспечении возможности восстановления физиологически нормальной концентрации эндогенного НАЕЕ в крови при заболеваниях или нарушениях здоровья животных, сопряженных с нейровоспалением и характеризуемых падением уровня эндогенного НАЕЕ в крови по сравнению с физиологической нормой, за счет восстановления этого уровня под воздействием введения в организм синтетического пептида НАЕЕ и/или производных синтетического пептида НАЕЕ, показывающих аналогичную эффективность. Под физиологической нормой, в соответствие с определением Медицинского словаря (Medical Dictionary for the Health Professions and Nursing. Farlex Partner Medical Dictionary. (2012), ссылка: https://wvvw.medicinenet.com/normal_range/definition.htm), понимается диапазон значений, характерный для 95% процентов значений от нормальной популяции. Остальные нормальные результаты выходят за пределы нормального диапазона, как и любые действительно ненормальные результаты. В то же время, нормальный диапазон может варьировать для конкретного от возраста, роста, пола, этнической принадлежности или культуры пациента.
Заявленный технический результат обеспечивается путем применения синтетического пептида НАЕЕ или фармацевтически приемлемых солей или комплексов синтетического пептида НАЕЕ для восстановления физиологически нормальной концентрации эндогенного НАЕЕ в крови животных.
Фармацевтически приемлемыми солями синтетического пептида НАЕЕ могут быть одно- или двузамещенные соли натрия, калия или аммония.
Фармацевтически приемлемыми комплексами синтетического пептида НАЕЕ могут быть комплексы с цинком, медью, кальцием, магнием или другими катионами, способными взаимодействовать с молекулой НАЕЕ за счет электростатических и/или донорно-акцепторным взаимодействием.
Авторами настоящего изобретения показано, что количественное определение концентрации эндогенного пептида НАЕЕ в плазме крови человека или животных в диапазоне концентраций от 25 до 8000 пикограммов на миллилитр (пг/мл) достигается с использованием метода высокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании с масс-спектрометрическим детектированием молекулярных ионов НАЕЕ и характеристичных фрагментов НАЕЕ.
Измерение концентрации НАЕЕ в плазме крови осуществляют методом, сочетающим разделение высокоэффективной жидкостной хроматографии и регистрацией на масс-детекторе (ВЭЖХ-МС) родительского квази-молекулярного иона и фрагментных ионов после предварительной экстракции на ион-обменном твердофазном носителе депротеинизированной фракции биологического материала (плазмы крови). К 100 мкл плазмы крови добавляют 10 мкл раствора химически идентичного, но отличного по изотопному составу внутреннего стандарта НАЕЕ, отличающегося на Δm=+2.0067 а.е. или иную массу в зависимости от изотопной композиции внутреннего стандарта, до конечной концентрации 1 нг/мл (1000 пг/мл). Далее, к смеси плазмы крови с внутренним стандартом добавляют семь объемов смеси органических растворителей (метанол, ацетонитрил и вода) в соотношениях 7:2:1. После добавления смеси органических растворителей наблюдаем формированием взвеси белого или молочного цвета. Взвесь инкубируют при температуре 40°С в течение 10 минут при постоянном перемешивании на скорости 1100 об./мин. По окончании инкубирования, взвесь осветляют центрифугированием при ускорении 15000 g в угловом роторе при температуре 10°С в течение 10 минут. Затем количественно отбирают надосадочную жидкость (750 мкл) и переносят ее к 5 мл охлажденного водного раствора 2.5% гидроксида аммония для снижения конечной концентрации органических растворителей (метанола и ацетонитрила) и сенситизации целевого (выделяемого) компонента НАЕЕ и внутреннего стандарта в условиях основной реакции среды. Полученный раствор фракции плазмы крови в растворе 2.5% гидроксида аммония (около 5.7 мл) наносят на сильный смешанный анион-обменный твердофазных носитель, предварительно промытый последовательно в метаноле (1 мл), ацетонитриле (1 мл), воде (1 мл) и стабилизированный в 2.5% водном растворе гидроксида аммония (2 мл). После нанесения фракции плазмы крови (около 5.7 мл) на стабилизированный носитель уравновешивают твердофазный носитель со связанным с ним НАЕЕ и внутренним стандартом в растворе 2.5% водного гидроксида аммония (2 мл). Затем промывают носитель последовательно в воде (1 мл) и в 60% водном растворе метанола (1 мл). Коэлюцию НАЕЕ и внутреннего стандарта в одной фракции осуществляют раствором 3% муравьиной кислоты в ацетонитриле (0.6 мл). Собранную фракцию высушивают под вакуумом в концентраторе при температуре, не превышающей 45°С, до сухого остатка (полного испарения органического растворителя). Полученный сухой остаток восстанавливают в 30 мкл водного раствора 0.1% муравьиной кислоты для дальнейшего инструментального анализа методом ВЭЖХ-МС.
В изобретении продемонстрировано, что в плазме крови как у здоровых людей, так и у всех исследованных интактных млекопитающих (коза, бык, лошадь, овца, мышь) присутствует эндогенный пептид НАЕЕ в следующих физиологически нормальных концентрациях: (1) 430±52 пг/мл для человека; (2) 5023±227 пг/мл для козы; (3) 1680±75 пг/мл для быка; (4) 1589±176 пг/мл для лошади; (5) пг/мл для овцы 2545±271; (6) 1179±86 пг/мл для мыши (Таблица 1).
Авторами настоящего изобретения было обнаружено, что концентрация эндогенного НАЕЕ в плазме крови у пациентов с подтвержденными диагнозами заболеваний или нарушений здоровья, связанных с нейровоспалением, составляет: (1) 74±14 пг/мл для болезни Альцгеймера; (2) 82±18 пг/мл для болезни Паркинсона; (3) 95±19 пг/мл для бокового амиотрофического склероза; (4) 186±34 пг/мл для рассеянного склероза; (5) 192±37 пг/мл для сахарного диабета II-го типа; (6) 205±59 пг/мл для последствий черепно-мозговой травмы; (7) 244±38 пг/мл для постковидного синдрома (Таблица 2).
Таким образом, показано, что концентрация эндогенного пептида НАЕЕ в плазме крови пациентов с подтвержденными диагнозами заболеваний или нарушений здоровья, связанных с нейровоспалением (включая болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, боковой амиотрофический синдром, рассеянный склероз, сахарный диабета II-го типа, последствия черепно-мозговой травмы, а также постковидный синдром), значительно снижена по сравнению с физиологической нормой, которая у здоровых добровольцев составляет 430±52 пг/мл.
В настоящем изобретении было выявлено, что у животных, которые используются для моделирования заболеваний или нарушений здоровья, связанных с нейровоспалением (включая болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, боковой амиотрофический синдром, рассеянный склероз, сахарный диабета II-го типа, а также последствия черепно-мозговой травмы), имеется существенный дефицит эндогенного НАЕЕ в плазме крови (Таблица 3, Таблица 3А, Таблица 3Б). Так как аналогичный дефицит эндогенного пептида НАЕЕ выявлен в настоящем изобретении и для людей с подтвержденными диагнозами заболеваний или нарушений здоровья, связанных с нейровоспалением, то исходя из сходства функций молекул Αβ, амилоидного прекурсорного протеина (АРР), растворимой β-формы АРР (sΑΡΡβ) и α4β2-nΑChR в организме человека и животных можно ожидать, что изменение уровня НАЕЕ в крови человека и животных вызывается сходными причинами.
Этот дефицит существенно восстанавливается и приближается к физиологической норме при курсовом введении модельным животным терапевтической дозы следующих препаратов: (1) синтетического пептида НАЕЕ (Таблица 3); (2) фармацевтически приемлемой соли синтетического пептида НАЕЕ (Таблица 3А); (3) фармацевтически приемлемого комплекса синтетического пептида НАЕЕ (Таблица 3Б). Следовательно, концентрацию эндогенного пептида НАЕЕ в крови, сниженную вследствие нейровоспаления, можно в значительной степени восстановить с помощью курсового введения синтетического пептида НАЕЕ или фармацевтически приемлемых солей или комплексов пептида НАЕЕ в организм. Так как в настоящем изобретении показано, что повышение уровня эндогенного пептида НАЕЕ в крови сопровождается улучшением состояния животных, используемых для моделирования заболеваний или нарушений здоровья, связанных с нейровоспалением, то применение синтетического пептида НАЕЕ или фармацевтически приемлемых солей или комплексов пептида НАЕЕ для восстановления физиологически нормального уровня эндогенного НАЕЕ в крови может использоваться для терапии заболеваний или нарушений животных, связанных с нейровоспалением.
Введение синтетического пептида НАЕЕ или фармацевтически приемлемых солей или комплексов пептида НАЕЕ пациенту может осуществляться с помощью всех возможных видов наружного, энтерального, ингаляционного и парентерального способов применения (включая внутривенное, внутриартериальное, внутрибрюшинное, подкожное, накожное, трансдермальное, внутримышечное, интратекальное, субарахноидальное, пероральное, интраназальное, сублингвальное, буккальное, ректальное введение). При введении синтетического пептида НАЕЕ или фармацевтически приемлемых солей или комплексов пептида НАЕЕ в твердой форме предпочтительным способом введения является сублингвальный. При введении синтетического пептида НАЕЕ или фармацевтически приемлемых солей или комплексов пептида НАЕЕ в форме раствора предпочтительными способами введения являются внутривенный, подкожный и интраназальный.
Возможность терапевтического лечения заболеваний или нарушений, связанных с нейровоспалением, посредством восстановления физиологически нормальной концентрации эндогенного пептида НАЕЕ показана с использованием животных моделей, включая:
(1) модель болезни Альцгеймера (Jankowsky, J. L., Slunt, Η. Η., Ratovitski, Т., Jenkins, Ν. Α., Copeland, Ν. G., & Borchelt, D. R. (2001). Co-expression of multiple transgenes in mouse CNS: a comparison of strategies. Biomolecular engineering, 17(6), 157-165);
(2) модель болезни Паркинсона (Kuroiwa Η, Yokoyama Η, Kimoto Η, Kato Η, Araki Т. Biochemical alterations of the striatum in an MPTP-treated mouse model of Parkinson's disease. Metab Brain Dis. 2010 Jun;25(2): 177-83. doi: 10.1007/s 11011-010-9195-9);
(3) модель бокового амиотрофического склероза (Дейкин А.В., Ковражкина Е.А., Овчинников Р.К., Броновицкий Е.В., Разинская О.Д., Смирнов А.П., Ермолкевич Т.Г., Еляков А.Б., Попов А.Н., Федоров Е.Н., Лыткина О.А., Кухарский М.С., Тарасова Т.В., Шелковникова Т.А., УстюговА.А., НинкинаН.Н., Гольдман И.Л., Садчикова Е.Р., Бачурин CO., Скворцова В.И. Модель бокового амиотрофического склероза на основе линии трансгенных мышей, экспрессирующих мутантную форму FUS белка человека. Журнал неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова. 2014; 114(8):62-69);
(4) модель рассеянного склероза (Levy, Η, Yaniv Assaf, and D Frenkel. 2010. 'Characterization of brain lesions in a mouse model of progressive multiple sclerosis', Experimental neurology, 226: 148-58);
(5) модель сахарного диабета II-го типа (Gilbert, Ε. R., Ζ. Fu, and D. Liu. 2011. 'Development of a nongenetic mouse model of type 2 diabetes', Exp Diabetes Res, 2011: 416254);
(6) модель черепно-мозговой травмы (Yang, Χ. Μ., Χ. Η. Chen, J. F. Lu, С.Μ. Zhou, J. Y. Han, and С.Η. Chen. 2018. 'In vivo observation of cerebral microcirculation after experimental subarachnoid hemorrhage in mice', Neural Regen Res, 13: 456-62).
Описание фигур
Фиг. 1: Хроматограммы изолированного ионного тока фрагментов b1, b2, b3 и al внутреннего стандарта с включением двух стабильных изотопов углерода [13С] в конечной концентрации 1 нг/мл и пептида НАЕЕ после экстракции из пробы плазмы крови человека. Расчетная концентрация НАЕЕ по относительному отклику площади под пиком иона-квантора [13С2]-b1 с m/z=182.0814 составила 0.322 нг/мл (А). Участки деконволюции масс-спектра фрагментов внутреннего стандарта с включением стабильных изотопов углерода [13С] и соответствующих фрагментных ионов НАЕЕ в пробе плазмы крови после экстракции (Б). Композитные спектры фрагментации НАЕЕ и внутреннего стандарта с включением стабильных изотопов углерода [13С], а также остаточные сигналу родительского иона внутреннего стандарта с m/z=528 и НАЕЕ с m/z=526 в пробе плазмы крови после экстракции. Дистанция между фрагментами и родительскими ионами внутреннего стандарта с НАЕЕ составляет в среднем 2.0067 атомных единиц массы (без поправки на дефект массы), что соответствует включению двух изотопов углерода [13С] в молекуле внутреннего стандарта (В).
Варианты осуществления изобретения
Изобретение иллюстрируется нижеприведенными примерами, но не ограничивается ими.
Пример 1. Определение концентраций эндогенного пептида НАЕЕ в плазме крови здоровых добровольцев и млекопитающих.
Забор венозной крови проводили у здоровых добровольцев (возрастной интервал генерализованной выборки от 37 до 86 полных лет) и у следующих видов млекопитающих: (1) коза домашняя (возрастной интервал генерализованной выборки от 5 до 10 полных лет); (2) бык домашний (возрастной интервал генерализованной выборки от 8 до 13 полных лет); (3) лошадь домашняя (возрастной интервал генерализованной выборки от 8 до 14 полных лет); (4) овца домашняя (возрастной интервал генерализованной выборки от 4 до 7 полных лет); (5) мышь домовая (возрастной интервал генерализованной выборки от 6 до 9 полных месяцев). В течение получаса после забора крови готовили аликвоты плазмы крови (ЭДТА-2К+), которые замораживали для длительного хранения.
Измерение концентрации НАЕЕ в плазме крови осуществляют методом, сочетающим разделение высокоэффективной жидкостной хроматографии и регистрацией на масс-детекторе (ВЭЖХ-МС) родительского квази-молекулярного иона и фрагментных ионов после предварительной экстракции на ион-обменном твердофазном носителе депротеинизированной фракции биологического материала (плазмы крови). К 100 мкл плазмы крови добавляют 10 мкл раствора химически идентичного, но отличного по изотопному составу внутреннего стандарта НАЕЕ, отличающегося на Δm=+2.0067 а.е. или иную массу в зависимости от изотопной композиции внутреннего стандарта, до конечной концентрации 1 нг/мл (1000 пг/мл). Далее, к смеси плазмы крови с внутренним стандартом добавляют семь объемов смеси органических растворителей (метанол, ацетонитрил и вода) в соотношениях 7:2:1. После добавления смеси органических растворителей наблюдаем формированием взвеси белого или молочного цвета. Взвесь инкубируют при температуре 40°С в течение 10 минут при постоянном перемешивании на скорости 1100 об. /мин. По окончании инкубирования, взвесь осветляют центрифугированием при ускорении 15000 g в угловом роторе при температуре 10°С в течение 10 минут. Затем количественно отбирают надосадочную жидкость (750 мкл) и переносят ее к 5 мл охлажденного водного раствора 2.5% гидроксида аммония для снижения конечной концентрации органических растворителей (метанола и ацетонитрила) и сенситизации целевого (выделяемого) компонента НАЕЕ и внутреннего стандарта в условиях основной реакции среды. Полученный раствор фракции плазмы крови в растворе 2.5% гидроксида аммония (около 5.7 мл) наносят на сильный смешанный анион-обменный твердофазных носитель, предварительно промытый последовательно в метаноле (1 мл), ацетонитриле (1 мл), воде (1 мл) и стабилизированный в 2.5% водном растворе гидроксида аммония (2 мл). После нанесения фракции плазмы крови (около 5.7 мл) на стабилизированный носитель уравновешивают твердофазный носитель со связанным с ним НАЕЕ и внутренним стандартом в растворе 2.5% водного гидроксида аммония (2 мл). Затем промывают носитель последовательно в воде (1 мл) и в 60% водном растворе метанола (1 мл). Коэлюцию НАЕЕ и внутреннего стандарта в одной фракции осуществляют раствором 3% муравьиной кислоты в ацетонитриле (0.6 мл). Собранную фракцию высушивают под вакуумом в концентраторе при температуре, не превышающей 45°С, до сухого остатка (полного испарения органического растворителя). Полученный сухой остаток восстанавливают в 30 мкл водного раствора 0.1% муравьиной кислоты для дальнейшего инструментального анализа методом ВЭЖХ-МС.
Регистрацию сигнала эндогенного пептида НАЕЕ в плазме крови (ЭДТА-2К+) проводили методом высокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании с масс-спектрометрией (ВЭЖХ-МС) в режиме положительной электростатической ионизации и тандемного или адресного сканирования по прекурсорному и фрагментным ионам. Количественную оценку проводили по площади или высоте хроматографического пика изолированного ионного тока прекурсорного иона или базового фрагментного иона-квантора эндогенного пептида НАЕЕ и внутреннего стандарта [С2]-НАЕЕ, отличающегося от НАЕЕ по изотопному составу из-за включения двух изотопов [13С2] атома углерода, то есть отличного от НАЕЕ на +2.00671 атомных единиц массы (Фиг. 1).
Таким образом, аликвота плазмы крови после необходимых лабораторных процедур, направленных на получение обогащенной по НАЕЕ и внутреннему стандарту фракции, анализировалась количественным методом масс-спектрометрии с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии и внутреннего изотопно-меченного стандарта.
Было определено, что средняя концентрация эндогенного пептида НАЕЕ в исследованных образцах плазмы крови здоровых добровольцев (N=10) составляла 430±52 пг/мл. Это значение отражает физиологически нормальную концентрацию эндогенного пептида НАЕЕ в плазме крови человека (Таблица 1).
Также обнаружено, что в плазме крови исследованных интактных млекопитающих (коза, бык, лошадь, овца, мышь) присутствует эндогенный пептид НАЕЕ в следующих физиологически нормальных концентрациях: (1) 5023±227 пг/мл для козы; (2) 1680±75 пг/мл для быка; (3) 1589±176 пг/мл для лошади; (4) 2545±271 пг/мл для овцы; (5) 1179±86 пг/мл для мыши (Таблица 1).
Погрешность всех измерений составляла не более 10% на нижних уровнях измерений (от 25 до 100 пг/мл) и не более 5% на средних и верхних уровнях измерений (более 100 пг/мл, но менее 5500 пг/мл).
Полученные данные свидетельствуют о том, что пептид НАЕЕ является эндогенным компонентом крови здоровых добровольцев и интактных млекопитающих.
Пример 2. Определение концентрации эндогенного пептида НАЕЕ в плазме крови у пациентов с подтвержденными диагнозами заболеваний или нарушений здоровья, связанных с нейровоспалением.
С использованием количественного метода анализа концентрации эндогенного пептида НАЕЕ в соответствие с Примером 1 настоящего изобретения установлены концентрации эндогенного пептида НАЕЕ в плазме крови у пациентов с подтвержденными диагнозами следующих заболеваний или нарушений здоровья, связанных с нейровоспалением: (1) болезнь Альцгеймера; (2) болезнь Паркинсона; (3) боковой амиотрофический склероз; (4) рассеянный склероз; (5) сахарный диабет II-го типа; (6) черепно-мозговые травмы; (7) пост-ковидный синдром (Таблица 2).
На основании проведенных измерений (Таблица 2) были определены следующие значения средних концентраций эндогенного пептида НАЕЕ в плазме крови: (1) 74±14 пг/мл для пациентов с диагнозом болезни Альцгеймера; (2) 82±18 пг/мл для пациентов с диагнозом болезни Паркинсона; (3) 95±19 пг/мл для пациентов с диагнозом бокового амиотрофического склероза; (4) 186±3 пг/мл для пациентов с диагнозом рассеянного склероза; (5) 192±37 пг/мл для пациентов с диагнозом сахарного диабета II-го типа; (6) 205±59 пг/мл для пациентов с последствиями черепно-мозговых травм; (7) 244±38 пг/мл для пациентов с диагнозом пост-ковидного синдрома.
Таким образом, у всех пациентов с подтвержденными диагнозами заболеваний или нарушений здоровья, связанных с нейровоспалением, наблюдается значительный дефицит эндогенного пептида НАЕЕ в плазме крови по сравнению с физиологически нормальной концентрацией эндогенного пептида НАЕЕ, которая по данным из Примера 1 составляет 430±52 пг/мл.
Пример 3. Применение пептида НАЕЕ или однозамещенной натриевой соли НАЕЕ или цинкового комплекса НАЕЕ для восстановления дефицита эндогенного пептида НАЕЕ в плазме крови животных, которые используются в качестве признанных моделей заболеваний или нарушений здоровья, связанных с нейровоспалением.
Возможность терапевтического лечения заболеваний или нарушений животных, связанных с нейровоспалением, посредством восстановления физиологически нормальной концентрации эндогенного пептида НАЕЕ показана с использованием животных моделей на основе мышей, включая:
(1) модель болезни Альцгеймера (Jankowsky, J. L., Slunt, Η. Η., Ratovitski, Т., Jenkins, Ν. Α., Copeland, Ν. G., & Borchelt, D. R. (2001). Co-expression of multiple transgenes in mouse CNS: a comparison of strategies. Biomolecular engineering, 17(6), 157-165);
(2) модель болезни Паркинсона (Kuroiwa Η, Yokoyama Η, Kimoto Η, Kato Η, Araki Т. Biochemical alterations of the striatum in an MPTP-treated mouse model of Parkinson's disease. Metab Brain Dis. 2010 Jun; 25(2): 177-83. doi: 10.1007/s11011-010-9195-9);
(3) модель бокового амиотрофического склероза (Дейкин А.В., Ковражкина Е.А., Овчинников Р.К., Броновицкий Е.В., Разинская О.Д., Смирнов А.П., Ермолкевич Т.Г., Еляков А.Б., Попов А.Н., Федоров Е.Н., Лыткина О.А., Кухарский М.С., Тарасова Т.В., Шелковникова Т.А., Устюгов А.А., Нинкина Н.Н., Гольдман И.Л., Садчикова Е.Р., Бачурин CO., Скворцова В.И. Модель бокового амиотрофического склероза на основе линии трансгенных мышей, экспрессирующих мутантную форму FUS белка человека. Журнал неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова. 2014; 114(8):62-69);
(4) модель рассеянного склероза (Levy, Η, Yaniv Assaf, and D Frenkel. 2010. 'Characterization of brain lesions in a mouse model of progressive multiple sclerosis', Experimental neurology, 226: 148-58);
(5) модель сахарного диабета II-го типа (Gilbert, Ε. R., Ζ. Fu, and D. Liu. 2011. 'Development of a nongenetic mouse model of type 2 diabetes', Exp Diabetes Res, 2011: 416254);
(6) модель черепно-мозговой травмы (Yang, Χ. Μ., Χ. Η. Chen, J. F. Lu, С.M. Zhou, J. Y. Han, and С.H. Chen. 2018. 'In vivo observation of cerebral microcirculation after experimental subarachnoid hemorrhage in mice', Neural Regen Res, 13: 456-62).
Терапевтическое воздействие на всех экспериментальных мышей, которые были использованы в качестве вышеуказанных моделей заболеваний или нарушений (Таблица 3, Таблица 3А, Таблица 3Б), оказывалось следующим образом: каждому животному в возрасте 5-6 месяцев ежедневно в течение 5 суток внутривенно вводилась одна доза препарата, приготовленного в физиологическом растворе и содержащего пептид НАЕЕ или однозамещенную натриевую соль НАЕЕ или цинковый комплекс НАЕЕ. Количество синтетического пептида НАЕЕ в одной дозе каждого из препаратов в пересчете на массу животного составляло 0,05 мг/кг; однозамещенная натриевая соль НАЕЕ и цинковый комплекс НАЕЕ были приготовлены согласно патенту РФ №2784326 и патенту РФ №2784319, соответственно.
Для каждой из вышеуказанных животных моделей были сформированы по три группы мышей (N=10), которые затем подвергались терапевтическому воздействию одного из следующих препаратов: (1) пептид НАЕЕ (Таблица 3); (2) однозамещенная натриевая соль НАЕЕ (Таблица 3А); (3) цинковый комплекс НАЕЕ (Таблица 3Б).
Эффективность терапевтического воздействия на каждую из трех групп мышей для каждой из исследованных животных моделей оценивалась на основании анализа изменений концентраций эндогенного пептида НАЕЕ в плазме крови в трех временных точках: (1) за день до начала лечения; (2) через 3-е суток после начала лечения (после трех введений соответствующего препарата); (3) через 10 суток после начала лечения.
Для мышей в возрасте 5-6 месяцев, использованных в качестве животной модели болезни Альцгеймера (Jankowsky, J. L., Slunt, Η. Η., Ratovitski, Т., Jenkins, Ν. Α., Copeland, Ν. G., & Borchelt, D. R. (2001). Co-expression of multiple transgenes in mouse CNS: a comparison of strategies. Biomolecular engineering, 17(6), 157-165), были получены следующие результаты измерений.
Уровень эндогенного пептида НАЕЕ за день до начала лечения составлял:
(1) 426±90 пг/мл - для группы под действием пептида НАЕЕ;
(2) 477±84 пг/мл - для группы под действием однозамещенной натриевой соли НАЕЕ;
(3) 451±73 пг/мл - для группы под действием цинкового комплекса НАЕЕ.
Уровень эндогенного пептида НАЕЕ через 3-е суток после начала лечения составлял:
(1) 587±126 пг/мл - для группы под действием пептида НАЕЕ;
(2) 649±114 пг/мл - для группы под действием однозамещенной натриевой соли НАЕЕ;
(3) 620±89 пг/мл - для группы под действием цинкового комплекса НАЕЕ.
Уровень эндогенного пептида НАЕЕ через 10 суток после начала лечения составлял:
(1) 872±202 пг/мл - для группы под действием пептида НАЕЕ;
(2) 959±163 пг/мл - для группы под действием однозамещенной натриевой соли НАЕЕ;
(3) 899±160 пг/мл - для группы под действием цинкового комплекса НАЕЕ.
Таким образом, у мышей в возрасте 5-6 месяцев, использованных в качестве животной модели болезни Альцгеймера, концентрация эндогенного пептида НАЕЕ в плазме крови составляла от 426±90 пг/мл до 477±84 пг/мл, что свидетельствует о значительном дефиците эндогенного пептида НАЕЕ по сравнению с физиологически нормальной концентрацией эндогенного пептида НАЕЕ в плазме крови мышей, которая по данным из Примера 1 настоящего изобретения составляет 1179±86 пг/мл. Однако, курсовое введение препаратов синтетического пептида НАЕЕ или его фармацевтически приемлемых производных (однозамещенной натриевой соли или цинкового комплекса) позволяет значительно восстановить уровень эндогенного пептида НАЕЕ в плазме крови при болезни Альцгеймера.
Для мышей в возрасте 5-6 месяцев, использованных в качестве животной модели болезни Паркинсона (Kuroiwa Η, Yokoyama Η, Kimoto Η, Kato Η, Araki Τ. Biochemical alterations of the striatum in an MPTP-treated mouse model of Parkinson's disease. Metab Brain Dis. 2010 Jun;25(2): 177-83. doi: 10.1007/s11011-010-9195-9), были получены следующие результаты измерений.
Уровень эндогенного пептида НАЕЕ за день до начала лечения составлял:
(1) 440±100 пг/мл - для группы под действием пептида НАЕЕ;
(2) 464±73 пг/мл - для группы под действием однозамещенной натриевой соли НАЕЕ;
(3) 437±85 пг/мл - для группы под действием цинкового комплекса НАЕЕ.
Уровень эндогенного пептида НАЕЕ через 3-е суток после начала лечения составлял:
(1)615±135 пг/мл - для группы под действием пептида НАЕЕ;
(2) 640±98 пг/мл - для группы под действием однозамещенной натриевой соли НАЕЕ;
(3) 601±120 пг/мл - для группы под действием цинкового комплекса НАЕЕ.
Уровень эндогенного пептида НАЕЕ через 10 суток после начала лечения составлял:
(1) 875±208 пг/мл - для группы под действием пептида НАЕЕ;
(2) 893±142 пг/мл - для группы под действием однозамещенной натриевой соли НАЕЕ;
(3) 862±187 пг/мл - для группы под действием цинкового комплекса НАЕЕ.
Таким образом, у мышей в возрасте 5-6 месяцев, использованных в качестве животной модели болезни Паркинсона, концентрация эндогенного пептида НАЕЕ в плазме крови составляла от 437±85 пг/мл до 464±73 пг/мл, что свидетельствует о значительном дефиците эндогенного пептида НАЕЕ по сравнению с физиологически нормальной концентрацией эндогенного пептида НАЕЕ в плазме крови мышей, которая по данным из Примера 1 настоящего изобретения составляет 1179±86 пг/мл. Однако, курсовое введение препаратов синтетического пептида НАЕЕ или его фармацевтически приемлемых производных (однозамещенной натриевой соли или цинкового комплекса) позволяет значительно восстановить уровень эндогенного пептида НАЕЕ в плазме крови при болезни Паркинсона.
Для мышей в возрасте 5-6 месяцев, использованных в качестве животной модели бокового амиотрофического склероза (Дейкин А.В., Ковражкина Е.А., Овчинников Р.К., Броновицкий Е.В., Разинская О.Д., Смирнов А.П., Ермолкевич Т.Г., Еляков А.Б., Попов А.Н., Федоров Е.Н., Лыткина О.А., Кухарский М.С., Тарасова Т.В., Шелковникова Т.А., Устюгов А.А., Нинкина Н.Н., Гольдман И.Л., Садчикова Е.Р., Бачурин C.O., Скворцова В.И. Модель бокового амиотрофического склероза на основе линии трансгенных мышей, экспрессирующих мутантную форму FUS белка человека. Журнал неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова. 2014; 114(8):62-69), были получены следующие результаты измерений.
Уровень эндогенного пептида НАЕЕ за день до начала лечения составлял:
(1) 699±73 пг/мл - для группы под действием пептида НАЕЕ;
(2) 728±39 пг/мл - для группы под действием однозамещенной натриевой соли НАЕЕ;
(3) 722±68 пг/мл - для группы под действием цинкового комплекса НАЕЕ.
Уровень эндогенного пептида НАЕЕ через 3-е суток после начала лечения составлял:
(1) 957±101 пг/мл - для группы под действием пептида НАЕЕ;
(2) 996±68 пг/мл - для группы под действием однозамещенной натриевой соли НАЕЕ;
(3) 980±78 пг/мл - для группы под действием цинкового комплекса НАЕЕ.
Уровень эндогенного пептида НАЕЕ через 10 суток после начала лечения составлял:
(1) 1401±224 пг/мл - для группы под действием пептида НАЕЕ;
(2) 1509±127 пг/мл - для группы под действием однозамещенной натриевой соли НАЕЕ;
(3) 1515±163 пг/мл - для группы под действием цинкового комплекса НАЕЕ.
Таким образом, у мышей в возрасте 5-6 месяцев, использованных в качестве животной модели бокового амиотрофического склероза, концентрация эндогенного пептида НАЕЕ в плазме крови составляла от 699±73 пг/мл до 728±39 пг/мл, что свидетельствует о значительном дефиците эндогенного пептида НАЕЕ по сравнению с физиологически нормальной концентрацией эндогенного пептида НАЕЕ в плазме крови мышей, которая по данным из Примера 1 настоящего изобретения составляет 1179±86 пг/мл. Однако, курсовое введение препаратов синтетического пептида НАЕЕ или его фармацевтически приемлемых производных (однозамещенной натриевой соли или цинкового комплекса) позволяет восстановить уровень эндогенного пептида НАЕЕ в плазме крови при боковом амиотрофическом склерозе.
Для мышей в возрасте 5-6 месяцев, использованных в качестве животной модели рассеянного склероза (Levy, Η, Yaniv Assaf, and D Frenkel. 2010. 'Characterization of brain lesions in a mouse model of progressive multiple sclerosis', Experimental neurology, 226: 148-58), были получены следующие результаты измерений. Уровень эндогенного пептида НАЕЕ за день до начала лечения составлял:
(1) 730±70 пг/мл - для группы под действием пептида НАЕЕ;
(2) 726±62 пг/мл - для группы под действием однозамещенной натриевой соли НАЕЕ;
(3) 713±58 пг/мл - для группы под действием цинкового комплекса НАЕЕ.
Уровень эндогенного пептида НАЕЕ через 3-е суток после начала лечения составлял:
(1) 1007±73 пг/мл - для группы под действием пептида НАЕЕ;
(2) 1007±99 пг/мл - для группы под действием однозамещенной натриевой соли НАЕЕ;
(3) 979±64 пг/мл - для группы под действием цинкового комплекса НАЕЕ.
Уровень эндогенного пептида НАЕЕ через 10 суток после начала лечения составлял:
(1) 1431±131 пг/мл - для группы под действием пептида НАЕЕ;
(2) 1463±194 пг/мл - для группы под действием однозамещенной натриевой соли НАЕЕ;
(3) 1386±162 пг/мл - для группы под действием цинкового комплекса НАЕЕ.
Таким образом, у мышей в возрасте 5-6 месяцев, использованных в качестве животной модели рассеянного склероза, концентрация эндогенного пептида НАЕЕ в плазме крови составляла от 713±58 пг/мл до 730±70 пг/мл, что свидетельствует о значительном дефиците эндогенного пептида НАЕЕ по сравнению с физиологически нормальной концентрацией эндогенного пептида НАЕЕ в плазме крови мышей, которая по данным из Примера 1 настоящего изобретения составляет 1179±86 пг/мл. Однако, курсовое введение препаратов синтетического пептида НАЕЕ или его фармацевтически приемлемых производных (однозамещенной натриевой соли или цинкового комплекса) позволяет восстановить уровень эндогенного пептида НАЕЕ в плазме крови при рассеянном склерозе.
Для мышей в возрасте 5-6 месяцев, использованных в качестве животной модели сахарного диабета II-го типа (Gilbert, Ε. R., Ζ. Fu, and D. Liu. 2011. 'Development of a nongenetic mouse model of type 2 diabetes', Exp Diabetes Res, 2011: 416254), были получены следующие результаты измерений.
Уровень эндогенного пептида НАЕЕ за день до начала лечения составлял:
(1) 668±168 пг/мл - для группы под действием пептида НАЕЕ;
(2) 628±186 пг/мл - для группы под действием однозамещенной натриевой соли НАЕЕ;
(3) 699±177 пг/мл - для группы под действием цинкового комплекса НАЕЕ.
Уровень эндогенного пептида НАЕЕ через 3-е суток после начала лечения составлял:
(1) 902±223 пг/мл - для группы под действием пептида НАЕЕ;
(2) 859±274 пг/мл - для группы под действием однозамещенной натриевой соли НАЕЕ;
(3) 980±251 пг/мл - для группы под действием цинкового комплекса НАЕЕ.
Уровень эндогенного пептида НАЕЕ через 10 суток после начала лечения составлял:
(1) 1386±351 пг/мл - для группы под действием пептида НАЕЕ;
(2) 1250±415 пг/мл - для группы под действием однозамещенной натриевой соли НАЕЕ;
(3) 1419±344 пг/мл - для группы под действием цинкового комплекса НАЕЕ.
Таким образом, у мышей в возрасте 5-6 месяцев, использованных в качестве животной модели сахарного диабета II-го типа, концентрация эндогенного пептида НАЕЕ в плазме крови составляла от 628±186 пг/мл до 699±177 пг/мл, что свидетельствует о значительном дефиците эндогенного пептида НАЕЕ по сравнению с физиологически нормальной концентрацией эндогенного пептида НАЕЕ в плазме крови мышей, которая по данным из Примера 1 настоящего изобретения составляет 1179±86 пг/мл. Однако, курсовое введение препаратов синтетического пептида НАЕЕ или его фармацевтически приемлемых производных (однозамещенной натриевой соли или цинкового комплекса) позволяет восстановить уровень эндогенного пептида НАЕЕ в плазме крови при сахарном диабете II-го типа.
Для мышей в возрасте 5-6 месяцев, использованных в качестве животной модели черепно-мозговой травмы (Yang, Χ. Μ., Χ. Η. Chen, J. F. Lu, С.M. Zhou, J. Y. Han, and С.H. Chen. 2018. 'In vivo observation of cerebral microcirculation after experimental subarachnoid hemorrhage in mice', Neural Regen Res, 13: 456-62), были получены следующие результаты измерений.
Уровень эндогенного пептида НАЕЕ за день до начала лечения составлял:
(1) 574±173 пг/мл - для группы под действием пептида НАЕЕ;
(2) 760±136 пг/мл - для группы под действием однозамещенной натриевой соли НАЕЕ;
(3) 746±123 пг/мл - для группы под действием цинкового комплекса НАЕЕ.
Уровень эндогенного пептида НАЕЕ через 3-е суток после начала лечения составлял:
(1) 795±251 пг/мл - для группы под действием пептида НАЕЕ;
(2) 1052±172 пг/мл - для группы под действием однозамещенной натриевой соли НАЕЕ;
(3) 1026±175 пг/мл - для группы под действием цинкового комплекса НАЕЕ.
Уровень эндогенного пептида НАЕЕ через 10 суток после начала лечения составлял:
(1) 1138±389 пг/мл - для группы под действием пептида НАЕЕ;
(2) 1534±314 пг/мл - для группы под действием однозамещенной натриевой соли НАЕЕ;
(3) 1510±305 пг/мл - для группы под действием цинкового комплекса НАЕЕ.
Таким образом, у мышей в возрасте 5-6 месяцев, использованных в качестве животной модели черепно-мозговой травмы, концентрация эндогенного пептида НАЕЕ в плазме крови составляла от 574±173 пг/мл до 760±136 пг/мл, что свидетельствует о значительном дефиците эндогенного пептида НАЕЕ по сравнению с физиологически нормальной концентрацией эндогенного пептида НАЕЕ в плазме крови мышей, которая по данным из Примера 1 настоящего изобретения составляет 1179±86 пг/мл. Однако, курсовое введение препаратов синтетического пептида НАЕЕ или его фармацевтически приемлемых производных (однозамещенной натриевой соли или цинкового комплекса) позволяет восстановить уровень эндогенного пептида НАЕЕ в плазме крови при черепно-мозговой травме.
В совокупности вышеприведенные данные указывают на то, что при заболеваниях или нарушениях здоровья, связанных с нейровоспалением, дефицит эндогенного НАЕЕ эффективно восстанавливается при терапевтическом воздействии препаратов синтетического пептида НАЕЕ, а также однозамещенной натриевой соли НАЕЕ или цинкового комплекса НАЕЕ. При этом все три вышеназванных препарата имеют сходную эффективность для восстановления дефицита эндогенного НАЕЕ в исследованных животных моделях.
Таким образом, заявленное изобретение обеспечивает возможность восстановления физиологически нормальной концентрации эндогенного НАЕЕ в крови при заболеваниях или нарушениях здоровья животных, сопряженных с нейровоспалением и характеризуемых падением уровня эндогенного НАЕЕ в крови по сравнению с физиологической нормой, за счет восстановления этого уровня под воздействием введения в организм синтетического пептида НАЕЕ и/или производных синтетического пептида НАЕЕ, показывающих аналогичную эффективность
Пример 4. Влияние курсового введения синтетического пептида НАЕЕ на способность мышей переносить последствия черепно-мозговой травмы.
Возможность профилактического эффекта курсового введения синтетического пептида НАЕЕ для компенсации последствий черепно-мозговой травмы была установлена на мышах, которые используются в качестве животной модели черепно-мозговой травмы (Yang, Χ. Μ., Χ. Η. Chen, J. F. Lu, С.M. Zhou, J. Y. Han, and С.H. Chen. 2018. 'In vivo observation of cerebral microcirculation after experimental subarachnoid hemorrhage in mice', Neural Regen Res, 13: 456-62).
Схема эксперимента заключалась в следующем. Для двух групп мышей дикого типа в возрасте 5-6 месяцев (по 10 животных в группе) определяли концентрации эндогенного пептида НАЕЕ в крови в соответствие с методом из Примера 1 настоящего изобретения. Далее животным из первой группы ежедневно в течение 10 суток вводили синтетический пептид НАЕЕ, приготовленный в физиологическом растворе, и количество синтетического пептида НАЕЕ в одной дозе в пересчете на массу животного составляло 0,05 мг/кг, а животные во второй группе оставались интактными. Через 30 суток после начала курсового введения препарата синтетического пептида НАЕЕ мышам первой группы были проведены измерения концентраций эндогенного пептида НАЕЕ в крови у животных обеих групп. Сразу после забора образцов крови для проведения измерений все животные как из первой, так и из второй групп подвергались травмирующему воздействию головного мозга в соответствие с описанием модели черепно-мозговой травмы (Yang, Χ. Μ., Χ. Η. Chen, J. F. Lu, С.M. Zhou, J. Y. Han, and С.H. Chen. 2018. 'In vivo observation of cerebral microcirculation after experimental subarachnoid hemorrhage in mice1, Neural Regen Res, 13: 456-62). Через 90 дней после травмирующего воздействия для каждой экспериментальной группы оценивали смертность животных, а также средний уровень эндогенного пептида НАЕЕ в крови выживших мышей.
Исходные средние концентрации эндогенного пептида НАЕЕ в крови мышей составляли 1208±7 пг/мл и 1175±68 пг/мл для животных из первой и второй групп, соответственно (Таблица 4). Курсовое введение синтетического пептида НАЕЕ животным первой группы не повлияло на уровни концентрации эндогенного пептида НАЕЕ, которые составляли 1293±86 пг/мл и 1233±62 пг/мл для животных из первой и второй групп, соответственно (Таблица 4).
Через 90 дней после травмирующего воздействия средняя концентрация эндогенного пептида НАЕЕ у животных из первой группы оставалась на исходном уровне 1104±80 пг/мл, в то время как для животных из второй группы, которым не вводили синтетический НАЕЕ, концентрация эндогенного пептида НАЕЕ понизилась до 894±24 пг/мл. При этом смертность в первой группе была на уровне 10%, в то время как смертность во второй группе составила 80%.
Таким образом, профилактическое курсового введения синтетического пептида НАЕЕ существенно увеличивает способность мышей переносить последствия черепно-мозговой травмы.
Изобретение относится к химии и ветеринарии, а именно к применению пептида Ac-His-Ala-Glu-Glu-NH2 с N-терминальной ацетильной группой и С-терминальной амидной группой (НАЕЕ), или его фармацевтически приемлемых солей, или его фармацевтически приемлемых комплексов с катионами металлов для восстановления физиологически нормальной концентрации эндогенного НАЕЕ в крови животных. Изобретение обеспечивает возможность восстановления физиологически нормальной концентрации эндогенного HAEE в крови при заболеваниях или нарушениях здоровья животных, сопряжённых с нейровоспалением и характеризуемых падением уровня эндогенного HAEE в крови по сравнению с нормой. 2 з.п. ф-лы, 1 ил., 6 табл., 4 пр.
1. Применение пептида Ac-His-Ala-Glu-Glu-NH2 с N-терминальной ацетильной группой и С-терминальной амидной группой (НАЕЕ), или его фармацевтически приемлемых солей, или его фармацевтически приемлемых комплексов с катионами металлов для восстановления физиологически нормальной концентрации эндогенного НАЕЕ в крови животных.
2. Применение по п. 1, которое показано при сниженном уровне НАЕЕ в плазме крови по сравнению с нормой.
3. Применение по п. 2, которое показано при заболеваниях или нарушениях здоровья животных, сопряженных с нейровоспалением.
| ПЕПТИДНОЕ СОЕДИНЕНИЕ, ПОЛЕЗНОЕ ДЛЯ ИНГИБИРОВАНИЯ ОБРАЗОВАНИЯ АМИЛОИДНЫХ БЛЯШЕК | 2011 |
|
RU2588143C2 |
| КАЛИЕВАЯ СОЛЬ ПЕПТИДА HAEE ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ НЕЙРОДЕГЕНЕРАТИВНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ | 2022 |
|
RU2784425C1 |
| ЦИНКОВЫЙ КОМПЛЕКС ПЕПТИДА HAEE ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ НЕЙРОДЕГЕНЕРАТИВНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ | 2022 |
|
RU2784319C1 |
| Фармацевтическая композиция на основе пептида HAEE для лечения нейродегенеративных заболеваний | 2019 |
|
RU2709539C1 |
| Способ получения пептида Ac-His-Ala-Glu-Glu-NH | 2021 |
|
RU2767030C1 |
| ТЕТРАПЕПТИД, СТИМУЛИРУЮЩИЙ ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ НЕЙРОНОВ, ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЕ СРЕДСТВО НА ЕГО ОСНОВЕ И СПОСОБ ЕГО ПРИМЕНЕНИЯ | 1999 |
|
RU2155063C1 |
| WO 2010146578 A2, 23.12.2010. | |||
