Углеродные наночастицы и способ их изготовления Российский патент 2025 года по МПК C01B32/15 C09K11/65 C09K11/78 B82B1/00 B82B3/00 B82Y15/00 B82Y40/00 A61K49/06 

Изобретение относится к области нанотехнологий и наноматериалов, а именно к получению углеродных наночастиц, для мультимодального получения изображений биологических объектов.

Известна «Красная люминесцентная углеродная квантовая точка, способ ее получения и применение» (Патент КНР № CN 106520116, МПК C09K 11/65, C01B 32/15, B82Y 20/00, B82Y 40/00, G01N 21/64, дата публикации 11.06.2019, дата приоритета 11.10.2016), представляющая собой сферическую углеродную наночастицу размером примерно 2-3 нм, состоящую из углерода, азота и кислорода, ее получают способом сольвотермального нагрева лимонной кислоты и мочевины в смеси растворителей (диметилформамид и диметилсульфоксид) с последующим очищением полученного раствора.

Полученные углеродные наночастицы обладают фотолюминесценцией с максимумом на 640 нм и квантовым выходом 35-40%, что демонстрирует возможность применения таких наночастиц для люминесцентной визуализации. К недостаткам данного способа относятся высокие температуры синтеза 200-240°С, количество используемых компонентов, а также необходимость в соблюдении соотношения прекурсоров и их химической чистоты, что обуславливает сложность контроля свойств углеродных наночастиц.

Известны углеродные наночастицы, синтезированные по протоколу, описанному в публикации Fang Y., Zhou L., Zhao J., et al. Facile synthesis of pH-responsive gadolinium(III)-doped carbon nanodots with red fluorescence and magnetic resonance properties for dual-readout logic gate operations // Carbon N Y. 2020. Vol. 166. P. 265-272, https://doi.org/10.1016/j.carbon.2020.05.060, согласно которому 1,0 г лимонной кислоты, 2,0 г мочевины и 0,016 г GdCl₃ растворяют в 10,0 мл диметилформамида, затем реакционную смесь помещают в автоклав для сольвотермальной реакции при 160°C в течение 6 часов. Затем полученную смесь темно-красного цвета остужают до комнатной температуры и промывают 1,0 М водным раствором NaOH при перемешивании в течение 5 минут, после чего раствор диализируют с использованием диализных мешков с отсечкой по молекулярному весу 3,5 кДа против воды в течение 3 дней. В конце полученные углеродные наночастицы центрифугируют при 12000 об/мин в течение 10 минут для выделения осадка, который далее дважды промывают деионизированной и высушивают. Углеродные наночастицы, полученные по описанной технологии, состоят из 64,93% углерода, 24,72% кислорода, 3,71% азота, 5,21% натрия и 1,43% гадолиния (указаны атомные проценты). Массовая концентрация гадолиния равна 32,6%. Такие углеродные наночастицы обладают длинноволновой фотолюминесценцией с максимумом полосы на 620 нм. К недостаткам аналога относятся низкий квантовый выход фотолюминесценции равный 2,3%, а также невысокое значение релаксивности r1=16,428 л × ммоль^-1 × с^-1.

Прототипом заявляемого изобретения являются легированные марганцем углеродные наночастицы, описанные в работе «Manganese-Doped Carbon Dots as a Promising Nanoprobe for Luminescent and Magnetic Resonance Imaging», Stepanidenko E.A., Vedernikova A.A., Badrieva Z.F., et al. // Photonics. 2023. Vol. 10. № 7. P. 757, https://doi.org/10.3390/photonics10070757, которые состоят из атомов 61,4-61,8% углерода, 24,5-26,1% кислорода, 11,7-13,0% азота и 0,7-0,8% марганца. Водные растворы таких углеродных наночастиц обладают полосой поглощения с максимумом полосы на 535 нм и интенсивным излучением с максимумом полосы на 420-550 нм при возбуждении от 350 до 450 нм и менее интенсивным пиком фотолюминесценции на 620 нм при возбуждении на 550 нм. Релаксивность r1 варьируется в пределах 4,8-6,7 л × ммоль^-1 × с^-1.

Для синтеза углеродных наночастиц на первом этапе смешивают 2,6 ммоль лимонной кислоты с 0,5 ммоль тетрагидрата ацетата марганца (II) / тетрагидрата хлорида марганца (II), затем растворяют реагенты в 5 мл формамида. Далее на втором этапе полученный раствор помещают в закрытые автоклавы из нержавеющей стали с тефлоновым покрытием и нагревают при 180°C в течение 12 часов, после реакции автоклав естественным образом охлаждают до комнатной температуры. На последнем этапе реакционную смесь очищают, добавляя 30 мл этанола и центрифугируют при 6000 об/мин в течение 15 мин, с полученным осадком повторяют процедуру очищения 3 раза, до тех пор, пока надосадочная жидкость не изменит цвет с темно-красного на светло-фиолетовый, после чего осадок растворяют в деионизированной воде и переносят в диализные мешки с отсечкой по молекулярному весу 3,5 кДа для диализа против деионизированной воды на протяжении 24 часов. После диализа растворы углеродных наночастиц дополнительно фильтруют через мембрану 0,22 мкм.

Недостатками прототипа в применении для люминесцентной визуализации являются излучение в области 420-630 нм с максимумами на 460 и 620 нм и низкая интенсивность красного излучения по сравнению с излучением в сине-зеленой области спектра; а в применении для магнитно-резонансной томографии является низкое значение релаксивности r1 до 6,7 л × ммоль^-1 × с^-1.

Задачей, на решение которой направлено предлагаемое изобретение, является создание углеродных наночастиц, со способностью обеспечения эффективного использования в люминесцентной визуализации и магнитно-резонансной томографии.

Поставленная задача решается за счет достижения технического результата, заключающегося в повышении квантового выхода и увеличении длины волны излучения при фотолюминесцентной визуализации и значений релаксивности r1 при магнитно-резонансной томографии.

Данный технический результат достигается тем, что углеродные наночастицы со свойством фотолюминесцентной визуализации биологических объектов и уменьшения времени релаксации протонов при их магнитно-резонансной томографии, с размерами 1-18 нм, состоящие из углерода, кислорода, азота и металла, отличаются тем, что в качестве металла внедрен гадолиний, а состав наночастиц в атомных процентах следующий: 59,8-59,9% углерода, 20,5-21,4% кислорода, 18,1-19,1% азота и 0,5-0,7% гадолиния.

Для фотолюминесцентной визуализации биологических объектов их состав в атомных процентах следующий: 59,8% углерода, 21,4% кислорода, 18,1% азота и 0,7% гадолиния, при этом максимум полосы фотолюминесценции на 640 нм и квантовый выход фотолюминесценции равен 41%.

Для уменьшения времени релаксации протонов при магнитно-резонансной томографии биологических объектов их состав в атомных процентах следующий: 59,9% углерода, 20,5% кислорода, 19,1% азота и 0,5% гадолиния, а значение продольной релаксивности r1 равно 25,76 л × ммоль^-1 × с^-1.

Способ синтеза углеродных наночастиц заключающийся в формировании наночастиц из лимонной кислоты, формамида и солей металлов, при котором смесь этих прекурсоров переносят в закрытый реакционный сосуд, нагревают в течении нескольких часов при 180°C для сольвотермальной реакции, после чего смесь остужают, растворяют в спирте и центрифугируют для выделения осадка в течение 15 минут при 6000 об/мин, после чего надосадочную жидкость удаляют, а с осадком повторяют растворение в спирте и центрифугирование с выделением осадка каждый раз с удалением вновь образованной надосадочной жидкости вплоть до изменения цвета, затем осадок диализируют против дистиллированной или деионизированной воды в диализном мешке с отсечкой молекулярного веса 3,5 кДа с заменой воды по мере ее окрашивания в течении нескольких суток, после этого очищенный раствор полученных углеродных наночастиц подвергаютсушке, отличается тем, что в качестве солей металла используют хлорид или нитрат гадолиния, молярное отношение формамида к лимонной кислоте и к соли гадолиния равно 19:1:(0,01-0,05), лимонную кислоту, формамид и соль гадолиния подвергают смешиванию в течение 5 минут под воздействием ультразвука до полного растворения, нагревание при 180°C производят в течении 8 часов, после остужения многократное растворение в спирте и центрифугирование с удалением надосадочной жидкости прекращают, когда надосадочная жидкость приобретает светло-фиолетовый или желтый оттенок, после диализа углеродные наночастицы растворяют в воде и повторно выделяют осадок при тех же параметрах центрифугирования, полученный осадок высушивают методом лиофилизации для получения темных порошков углеродных наночастиц.

Данные углеродные наночастицы обладают оптическими переходами в длинноволновой области спектра, содержат металлокомплексы, определяющие способность углеродных наночастиц уменьшать времена релаксации протонов во время магнитно-резонансной томографии. Полученные углеродные наночастицы предназначены для использования в качестве двухмодальной пробы для визуализации биологических тканей как при люминесцентной визуализации, так и в ходе магнитно-резонансной томографии.

Предлагаемые углеродные точки обладают одновременно поглощением и интенсивной фотолюминесценцией в длинноволновой области спектра, что повышает отношение сигнал/шум в ходе биовизуализации. Длина волны возбуждающего излучения составляет 550-650 нм, а детектирование сигнала фотолюминесценции проводят в диапазоне 600-720 нм. Это объясняется уменьшением вероятности автофлюоресценции биологических тканей, а также увеличением глубины проникновения излучения за счет использования источника возбуждения и детектирования фотолюминесценции от наночастиц в длинноволновой области спектра.

Содержание гадолиния в углеродной матрице, обладающего парамагнитными свойствами, вызванными неспаренными электронами, содействует усилению локального магнитного поля во время магнитно-резонансной томографии за счет создаваемых в атомах магнитных моментов и изменяют продольное время релаксации протонов (Т1), ускоряя процессы релаксации ядер водорода. Благодаря этому углеродные наночастицы обладают высоким значением продольной релаксивности r1 и выступают в качестве T1-контрастного вещества для магнитно-резонансной томографии.

Наряду с этим, предлагаемый способ получения углеродных наночастиц с гадолинием имеют следующие преимущества: простой и безопасный синтез, не требующий высоких температур; распространенность используемых реагентов и их невысокая стоимость.

Для визуализации тканей с помощью разработанных углеродных наночастиц приготовляют водный раствор наночастиц с концентрацией не более 100 мг/мл с добавлением 2% (по объему) диметилсульфоксида. Данный раствор добавляют в питательную среду с клетками или инжектируют в ткань.

Следующие примеры раскрывают сущность изобретения.

Пример 1

Углеродные наночастицы синтезируют из 48,2 мг (0,13 ммоль) GdCl₃⋅6H₂O и 0,5 г (2,6 ммоль) лимонной кислоты в 2 мл (50 ммоль) формамида. Отношение молярной концентрации Gd к лимонной кислоте равно 0,05.

Этап 1. Сольвотермальный нагрев. Смесь прекурсоров перемешивают до полного растворения в течение 5 минут под воздействием ультразвука, после чего переносят в закрытый автоклав из нержавеющей стали с тефлоновым покрытием, нагревают при 180°С в течение 8 часов. После реакции автоклав естественным образом охлаждают до комнатной температуры.

Этап 2. Осаждение. Остывшую реакционную смесь растворяют в этаноле, перемешивают до полного растворения и осаждают методом центрифугирования в течение 15 минут при 6000 об/мин. После чего надосадочную жидкость удаляют, а осадок подвергается процедуре отмывания, описанной выше еще 3-5 раз, пока надосадочная жидкость не становится прозрачного светло-фиолетового или желтого оттенка.

Этап 3. Диализ. Для удаления непрореагировавших прекурсоров и молекулярных флуорофоров полученный на 2 этапе осадок растворяют в 10 мл деионизированной воды и помещают в предварительно подготовленный диализный мешок с отсечкой по молекулярному весу в 3,5 кДа на 4-7 дней с заменой воды по мере ее окрашивания.

Этап 4. Сушка. К очищенным углеродным наночастицам добавляют деионизированную воду так, чтобы объем смеси составил 50 мл. После чего полученный раствор осаждают центрифугированием в течение 15 минут при 6000 об/мин, осадок отделяют и высушивают методом лиофилизации.

Углеродные наночастицы из данного примера состоят из 59,8% C, 21,4% O, 18,1% N и 0,7% Gd (указаны атомные %). Массовая концентрация Gd в сухом веществе 6,7±0,7%. Процент внедрения металла 28%. Размер углеродных наночастиц варьируется в пределах 1-15 нм со средним размером около 1,6 нм и медианным размером около 2,5 нм. Углеродные наночастицы обладают длинноволновой фотолюминесценцией с максимумом полосы на 640 нм и квантовым выходом 35±5%. Релаксивность r1 составляет 25,76 л × ммоль^-1 × с^-1.

Пример 2

Углеродные наночастицы синтезированы из 11,7 мг (0,026 ммоль) Gd(NO₃)₃⋅6H₂O и 0,5 г (2,6 ммоль) лимонной кислоты в 2 мл (50 ммоль) формамида. Отношение молярной концентрации Gd к лимонной кислоте равно 0,01. Этапы 1-4 из примера 1 повторяют для данного образца. Углеродные наночастицы из данного примера состоят из 59,9% C, 20,5% O, 19,1% N и 0,5% Gd (указаны атомные %). Массовая концентрация Gd в сухом веществе 5,1±0,5%. Процент внедрения металла 51%. Размер углеродных наночастиц варьируется в пределах 1-8 нм со средним размером около 3,8 нм и медианным размером около 2,9 нм. Углеродные наночастицы обладают длинноволновой фотолюминесценцией с максимумом полосы на 640 нм и квантовым выходом 41±5%. Релаксивность r1 равна 20,99 л × ммоль^-1 × с^-1.

Рентгеновская фотоэлектронная спектроскопия образцов углеродных наночастиц, описанных в примерах 1 и 2 показала наличие углеродной матрицы, наличие кислорода и азота, а также подтверждено внедрение гадолиния, находящегося в степени окисления +3 и встроенного в видах: Gd₂O₃, Gd₂(C₂O₄)₃, а также цитратов, которые формируются в результате сольвотермального нагрева смеси из лимонной кислоты, формамида и солей гадолиния.

Химический состав, оптические свойства и релаксационные характеристики углеродных наночастиц, легированных гадолинием, из примеров 1 и 2, отражены также в таблице 1. Концентрация гадолиния в углеродных наночастицах при молярном отношении Gd к лимонной кислоте в пределах 0,01-0,05 равна 5,1-6,7% по массе. Процент внедрения металла 28-51%.

Таблица. Зависимость химического состава углеродных наночастиц, эффективности внедрения в них гадолиния, оптических параметров (положение максимума полосы поглощения/фотолюминесценции и квантовый выход фотолюминесценции) и релаксивности r1 от молярного отношения солей Gd к лимонной кислоте.

Пример Источник гадолиния (Gd) Молярное отношение Gd/ЛК^* % атома в образцах % внедрения Gd Пик
Погл./ ФЛ,
нм КВ ФЛ, % r1,
л × ммоль^-1 × с^-1 С O N Gd 1 GdCl₃
×6H₂O 0,05 59,8 21,4 18,1 0,7 28 590/
640 35 25,76 2 Gd(NO₃)₃
×6H₂O 0,01 59,9 20,5 19,1 0,5 51 590/
640 41 20,99 *ЛК - лимонная кислота, ФЛ - фотолюминесценция, Погл. - поглощение, КВ ФЛ - квантовый выход фотолюминесценции

Полученные углеродные наночастицы вне зависимости от типа соли Gd и соотношения реагентов обладают длинноволновым излучением с полосой в диапазоне 600-650 нм при возбуждении излучением с длиной волны на 550-600 нм. Квантовый выход, измеренный при возбуждении на длине волны 550 нм, для углеродных наночастиц равен 35-41%, что является высоким значением для фотолюминесценции в красном диапазоне спектра для углеродных наночастиц. Углеродные наночастицы обладают свойствами Т1-контрастного вещества и высокими значениями релаксивности r1=20,99-25,76 л × ммоль^-1 × с^-1.

Таким образом, предлагаемые углеродные наночастицы обладают эффективной двухмодальной биовизуализацией с высоким квантового выходом фотолюминесценции в длинноволновой области спектра излучения, а также высоким значением релаксивности r1 при магнитно-резонансной томографии.

Изобретение может быть использовано в медицине и биологии для мультимодального анализа изображений биологических объектов, в том числе живых тканей, с помощью люминесцентной спектроскопии и магнитно-резонансной томографии. Углеродные наночастицы размерами 1-18 нм, состоящие из углерода, кислорода, азота и металла, получают путём их формирования из прекурсоров: формамида, лимонной кислоты и солей металлов, в качестве которых используют хлорид или нитрат гадолиния, при молярном отношении формамида к лимонной кислоте и к указанной соли гадолиния, равном 19:1:(0,01-0,05). Прекурсоры смешивают в течение 5 мин под воздействием ультразвука до полного растворения. Полученную смесь переносят в закрытый реакционный сосуд, нагревают 8 ч при 180°С для сольвотермальной реакции, после чего остужают, растворяют в спирте и центрифугируют для выделения осадка в течение 15 мин при 6000 об/мин. Надосадочную жидкость удаляют, а осадок снова растворяют в спирте и проводят центрифугирование с выделением осадка и удалением вновь образованной надосадочной жидкости. Эти операции повторяют многократно и прекращают, когда надосадочная жидкость приобретает светло-фиолетовый или жёлтый оттенок. Затем осадок диализируют против дистиллированной или деионизированной воды в диализном мешке с отсечкой молекулярного веса 3,5 кДа с заменой воды по мере ее окрашивания в течение нескольких суток. После диализа углеродные наночастицы растворяют в воде и повторно выделяют осадок при тех же параметрах центрифугирования. Осадок высушивают методом лиофилизации для получения тёмных порошков углеродных наночастиц, обладающих свойством фотолюминесцентной визуализации биологических объектов и уменьшения времени релаксации протонов при их магнитно-резонансной томографии, имеющих следующий состав, ат. %: 59,8-59,9 углерода; 20,5-21,4 кислорода; 18,1-19,1 азота и 0,5-0,7 гадолиния. Полученные углеродные наночастицы обладают длинноволновым излучением с максимумом полосы фотолюминесценции 600-650 нм при возбуждении излучением с длиной волны 550-600 нм, а также квантовым выходом фотолюминесценции 35-41%. 2 н. и 2 з.п. ф-лы, 1 табл., 2 пр.

1. Углеродные наночастицы со свойством фотолюминесцентной визуализации биологических объектов и уменьшения времени релаксации протонов при их магнитно-резонансной томографии, с размерами 1-18 нм, состоящие из углерода, кислорода, азота и металла, отличающиеся тем, что в качестве металла внедрён гадолиний, а состав наночастиц в атомных процентах следующий: 59,8-59,9% углерода, 20,5-21,4% кислорода, 18,1-19,1% азота и 0,5-0,7% гадолиния.

2. Углеродные наночастицы по п. 1, отличающиеся тем, что для фотолюминесцентной визуализации биологических объектов их состав в атомных процентах следующий: 59,8% углерода, 21,4% кислорода, 18,1% азота и 0,7% гадолиния, при этом максимум полосы фотолюминесценции на 640 нм, и квантовый выход фотолюминесценции равен 41%.

3. Углеродные наночастицы по п. 1, отличающиеся тем, что для уменьшения времени релаксации протонов при магнитно-резонансной томографии биологических объектов их состав в атомных процентах следующий: 59,9% углерода, 20,5% кислорода, 19,1% азота и 0,5% гадолиния, а значение продольной релаксивности r1 равно 25,76 л × ммоль^-1 × с^-1.

4. Способ синтеза углеродных наночастиц, заключающийся в формировании наночастиц из лимонной кислоты, формамида и солей металлов, при котором смесь этих прекурсоров переносят в закрытый реакционный сосуд, нагревают в течение нескольких часов при 180°С для сольвотермальной реакции, после чего смесь остужают, растворяют в спирте и центрифугируют для выделения осадка в течение 15 минут при 6000 об/мин, после чего надосадочную жидкость удаляют, а с осадком повторяют растворение в спирте и центрифугирование с выделением осадка каждый раз с удалением вновь образованной надосадочной жидкости вплоть до изменения цвета, затем осадок диализируют против дистиллированной или деионизированной воды в диализном мешке с отсечкой молекулярного веса 3,5 кДа с заменой воды по мере ее окрашивания в течение нескольких суток, после этого очищенный раствор полученных углеродных наночастиц подвергают сушке, отличающийся тем, что в качестве солей металла используют хлорид или нитрат гадолиния, молярное отношение формамида к лимонной кислоте и к соли гадолиния равно 19:1:(0,01-0,05), лимонную кислоту, формамид и соль гадолиния подвергают смешиванию в течение 5 минут под воздействием ультразвука до полного растворения, нагревание при 180°С производят в течение 8 часов, после остужения многократное растворение в спирте и центрифугирование с удалением надосадочной жидкости прекращают, когда надосадочная жидкость приобретает светло-фиолетовый или жёлтый оттенок, после диализа углеродные наночастицы растворяют в воде и повторно выделяют осадок при тех же параметрах центрифугирования, полученный осадок высушивают методом лиофилизации для получения тёмных порошков углеродных наночастиц.