Способ получения тканевого аллергена для диагностики аутоаллергических процессов при хроническом тонзиллите Советский патент 1984 года по МПК A61K39/00 

Изобретение относится к мелицине а именно к способам получения ткане вого аллергена для диахностики аутоаллергических процессов при хроническом тонзиллите. Известен способ получения тканевого аллергвна для диагностики ауто аллергических процессов при хроническом тонзиллите путем гомогенизации ткани миндалин человека с посл дующим отделением надосадочной жидко ти, используемой затем в ка.честве аллергена Cl. Недостатком данного способа явля ется невысокая специфическая активность ползчаемого аллергена, что затрудняет аллергодиагностику хрони ческого тонзиллита. Известен способ получения тканев го аллергона для диагностики аутолаллергических процессов при хроническом тонзиллите, включающий гомогенизацию ткани миндалин человека С2 Недостатком указанного способа является низкая специфическая актив ности аллергена (аллергические реак ции при определении in vitro положительны у 38% здоровых людей и у 76% больных хроническим тонзиллитом) . Цель изобретения - повышение специфической активности аллергена. Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения тканевого аллергена для диагностики аутоаллергических процессов при хроническом тонзиллите, включающему гомогенизацию ткани миндалин человека, полученный после гомогенизации осадок промывают физиологичес- : КИМ раствором и обрабатывают 1 н. раствором соляной кислоты при нагре вании, отделяют надосадочную жидкос далее нейтрализуют ее раствором щел чи, стерилизуют и лиофилизируют. Способ осуществляется следующим образом. Удаленные во время оперативных вмешательств небные миндалины отмывают физиологическим раствором хлори да натрия, взвешивают и измельчают в блендоре в присутствии 15 мл физио логического раствора хлорида натрия в течение 10 мин при 3000 об/мин. Полученный гомогенат центрифугируют 5 мин при 1000 об/мин. Осадок трижды отмывают при центрифугировании избыт ком физиологического раствора. Режим центрифугирования 5 мин 1000 об/мин. Полученный осадок отжимают между лис тами фильтровальной бумаги Полученный осадок гомогената миндалии подвергают кислотному гидролизу 1 н. раствором соляной кислоты из расчета 200 мл 1 н. НС1 на 4 г влажной массы осадка. Гидролиз ведут в течение 30 -мин при кипячении., Гидролизат охлаждают до 20°С, после чего нейтрализуют 1 н. раствором .гидроксида натрия (NaOH) под потенциометрическим контролем до рН 7,1. Нейтрализованный-продукт центрифугируют в течение 30 мин при , 8000 об/мин. Осадок отбрасывают. 1 мл надосадочной жидкости упаривают досука под вакуумом при 10 мм рт. ст. и 50°С до постоянного веса. Производят взвешивание-i Затем сжигают навеску в муфельной печи при 800°С и повторно взвешивают. Содержание органических веществ определяют по разности результатов первого и второго взвешивания. Исходя из полученных результатов весовых определений, аллерген стандартизуют по навеске органических веществ до значений 10 мг/мл, проводя в зависимости от результатов упаривание в условиях вакуума при 10 мм рт.ст. и 40°С или разведение физиологическим раствором хлорида натрия. В полученном аллергене повторно определяют количество органических веществ. Полученный стандартный раствор аллергена подвергают стерилизующей фильтрации через фильтр Зейтца. .Раствор аллергена в стерильнЕлх условиях разливают в стерильные ампулы из нейтрального стекла объемом 3 мл и лиофилизируют при следующем режиме: вакуум 0,2 мм рт.ст. Т 20 С;время Лиофилизации 17 ч; время досушивания при комнатной температуре 6ч. Полученный при лиофилизации аллерген представляет собой белый . порошок, гигроскопичный и легкорастворимый в воде. Полученный по предлагаемому опое собу аллерген имеет следующий химический состав (расчет содержания в 1 мл), мг: . Сухой остаток13,60 Нелетучие соли3,60 Пептиды0,40 Редуцирующие моно- О,20 сахара АминокислотыСледы Соли жирныхСледы кислот НуклеотидыСледи Олигосахариды9,40 Аминный азот0,012 Средний молекулярный вес. 5000 уе. снову биологически активного начаа аллергодиагностикума составляют лигосахариды, представленные в кани миндалин в составе соединиельнотканных и ретикулярных волокон. оследнее объясняет высокую диагносическую ценность полученного аллерена и дает возможность его химичесой идентификации. с учетом химического родства полученного аллергодиагностикума гепарину для идентификации предлага ется метод определения тлерантности плазмы к гепарину. Опыт проводят путем сравнения биологической актив ности гепарина и полученного аллергодиагностикума с использованием общего контроля, предупмотренного методикой. Результаты сравнительных исследований трех серий полученного аллергодиагностикума однозначно показали, что он обладает антикоагу ляционной активностью, уступая тем не менее гепарину (90% активности от гепарина) . Предлагаемый метод идентификации надежен, легко повторим, методически прост, доступен для использования в лйбых условиях,. Активность аллергена, полученного по предлагаемому способу, изучена в опытах in vitro по тесту ППН (показатель повреждения нейтрофилов который нашел весЬМё широкое применение в клинике и лабораториях как метод аллергодиагностики, имеющими преимущество перед внутрикожными пробами (полная безопасность, более высокая чувствительность, отсутстви противопоказаний). Аллергодиагностике были подвергнуты 58 больных хроническим тонзиллитом и 20 здоровых людей (контроль Для постановки реакции ППН использованы 3 серии аллергена, изготовле ного по предлагаемому способу и 3 серии сшлергена, полученного по способу-прототипу. Стерильный пипеткой в 3 стерильные видалевскиё пробирки вносят по 0,08, мл свежей несвернувшейся крови В одну из этих пробирок, служащую опытом, вносят 0,02 мл изучаемого тканевого гшлергена, в другую такое же количество известного аллергена, полученного по способупрототипу. Аллергены для постановки реак1 ии ППН разводили следующим образом: 1,0 мл жидкого аллергена (концентра ции 100 мг %) смешивали с 0,25 мл 25%-ного раствора цитрата натрия. При этом конечная концентрация антикоагулянта в аллергене составляла 5%. В третью, контрольную пробирку добавляли 0,02 мл 5% цитрата натрия. После инкубации пробирок в течение 2 ч в термостате (37°С) из каждвй:.пробирки готовили мазки, высушивали на воздухе, фиксировали, обрабатывали по Шабадашу и окрашивали гематоксилином в течение 5 мин. Для оценки теста ППН просматри вали 100 нейтрофилов в контрольном и опытных мазках. Результаты подсчета обрабатывали по формуле где число поврежденных нейтрофилов в опыте; Н2- число поврежденных нейтрофилов в контроле; 100 - количество просмотренных в мазке клеток. Данные опытов представлены в таблице. Испытание in vitro в тесте ППН полученного по предлагаемому способу аллергена с кровью здоровых и больных компенсированным и декомпенсированным хроническим тонзиллитом пбказали его высокую диагностическую активность (абсолютные значения теста ППН превышали данные прототипа при компенсированном тонзиллите в среднем в 2,3 раза и при декомпенсированном хроническом тонзиллите - в 2,7 раза. Наличие достоверных отличий в диагностических показателях теста ППН при компенсированном хроническом тонзиллите и декомпенсированном хроническс тонзиллите позволяет проводить дифференциальную диагностику форм хронических тонзиллитов и определять соответствующие методы лечения. Предложенный способ методически прост, доступен и экономически выгоден (не требует дорогостоящих, реактивов, оборудования и больших затрат рабочей силы и времени).

100,185+0,042

1 2 3 1 2 3 1 2 3

100,16210,041

100,173+0,053

90,342+0,065 90,292+0,069

90,309±.0,083

70,025+0,002

7О.,027+0,004

60,048+0,006

0,076+0,023 0,069+0,027 0,)85+0,030 0,110±.0,033 0,137+0,025 0,105±0,024 0,032+0,003 0,038tO,005 0,045+0,004

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ -ТКАНЕВОГО AJDlEPrEHA ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ АУТОАЛЛЕРГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ ПРИ ХРОНИЧЕСКОМ ТОНЗИЛЛИТЕ, включающий гомогенизацию ткани 1и1индсшин человека, о тличающийся тем, что, с целью повышения специфической активности аллергена, полученный после гомогенизации осадок промывают физиологическим раствором и обрабатывают 1 н. раствором соляной кислоты при нагревании, отделяют насадочную жидкость, далее нейтрализуют ее раствором щелочи, стерилизуют и лиофилизируют.