Способ диагностики лимфоцитарного хориоменингита Советский патент 1980 года по МПК A61B10/00 

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано для ранней аллергодиагностики инфек.ционного заболевания лимфоцитарного хориоменингита. Известен способ диагностики лимфо цитарногб хориоменингита путем поста новки реакции взаимодействия антигека и антитела l , Однако известный способ не обеспе ивaeт ранней диагностики заболевания. Целью изобретения является ранняя диагностика заболевания. Эта цель достигается тем, ,чго в качестве антигена используют аллерген, полученный из мозга зараженных мышей-сосунков, исследуют кровь с помощью aллepгичec иx тестов in vitro и по повьшенной чувствительности организма к вирусу лимфоцитарного хориоменикгита диагностируют наличие заболевания, Кроме того, в качестве аллергичес ких тестов используют показатель повреждения нейтрофилов крови, коэффициент лизиса лейкоцитов и непрямую дегранулнцию тучных клеток. -Способ осуществляется следующим образом. Приготовление аллергенов.Для постановки указанных реакций используют 2 вида аллергенов. Первый готовят из мозга новорожденных г., инфицированных вирусом лимфоцитарного хориоменингита ЛХМ, путем-борагно-солевой экстракции антигена вируса, который затем освобождают от балластных белков фреоном 113, инактивируют и лиофилизируют. без наполнителя. Для этого 2-3 дневных мышей-сосунков, вскармливаемых матками, заражают интрацеребрально по 0,02 мм 1%-ной вируссодержащей суспензией мозга мышей и несколько штук (5 - 10) взрослых белых мьизей (при лимфоцитарном хориоменингите новорожденные мьдши не болеют, но вирус хорошо размножается в их мозге, поэтому параллельно для контроля .заражают взрослых мьлией, которые боле-от с явными клиническими проявлениями). На 6 - 7 день после заражения при появлении признаков заболевания у взрослых мышей всю партию новорожденных мышей забивают и забирают мозг. Из последнего готовят 20%-ную суспензию (1 мл на 1 мозг) на боратно-солевом растворе NaCE. с рН 9,0, К приготовленной суспензии добавляют фреон 113 в объеме 1;1, смесь тщательно перемешивают и поме щают в бытовой холодильник на 4 суток постоянно взбалтывая. Далее производят центрифугирование при 6000 об/мин в течение 20 мин при температуре от О до +4. После цент рифугирования антиген для полной инактивации вируса выдерживают в холодильнике при 4°С в течение двух недель, затем подвергают лиофилизац на вакуум-сушилыюй установке в течение 36 ч. Ампулы с высушенным пре паратом герметизируют под вакуумом Характеристикой,аллергена служат его антигенная активность в РСК и с держание в нем белка. Антигенная активность этого аллергена в РСК 1:128, количество белка - 650 мг % Контрольный аллерген готовят тем же способом из Аозга незараженных вирусом ЛХМ новорожденных животных, содержание белка в нем составляет 728 мг %. Культурный аллерген представ ляет собой вируссодержащую жидкость клеток эмбриона человека (КЭЧ) на уровне 2-го пассажа вируса ЛХМ в этой клеточной культуре. Клетки до инфицирования (2-4 суток) выращивают в 100 мл (матрасах) на среде 199 с 10%-ной бычьей сыворот кой до образования монослоя, затем заражают вирусом в виде 10%-ной суспензии инфицированного мозга мышей в дозе 10 - ДЦдо . После 40 минугной адсорбции вируса при 22°С клетки трехкратно отмывают рас вором Хэнкса и заливают средой 199 без сыворотки. Через 3 суток инкубации при матрасы с инфицированными клетками и жидкостью замораживают, затем оттаивают, центрифугируют при 3000 об/мин 20 мин и используют для 1-го пассажа, в каче стве аллергена применяют 2-й пасса вируса на указанной кпеточной куль туре . Для этого 3-4 дневный клеточный монослой, выраьценный в матрасах 100 мл, заражают вирусом 1-го пасса жа на данной ткани. Ростовую среду 199 с 10%-ной бычьей сыворотки сливают и заменяют средо 199 без сыворотки в количестве 12 мл с содержанием вируса 1000 . Матр с инфицированными клетками инкубируют в термостате в течение 3 суто при температуре 37°С, после чего их помещают в замораживающий холодиль ник, затем оттаивают и используют в качестве аллергена. Для изготовления контрольного культурального аллергена проделывают те же манипуляции, только при первом этапе в клетки вносят 10%-н мозговую суспензию нормальных (неинфицированных ви{Ас-ом ЛХМ) мы-, шей . Активность специфического (опытного) аллергена в РСК составляет 1:16 - 1:32, количество белка до 200 мг %, в контрольном аллергене белка содержится 134 мг %. Все контрольные аллергены проверяют в РСК с иммунной ЛХМ сывороткой, реакция во всех случаях должна быть отрицательной, Для каждого пробирочного теста подбирают свою дозу опытного и соответствующего контрольного аллергена. Так, для НДТК аллерген берут в цельном виде, для ППН и КЛЛ - в разведении 1:4 - 1:8. Для определения коэффициента лизиса лейкоцитов в опытную пробирку стерильной микропипеткой вносят 0,025 мл рабочего раствора опытного аллергена, в контрольную - 0,025 мл рабочего раствора контрольного аллергена на дистиллированной воде. Если аллергены жидкие, то для приготовления рабочего раствора соединяют 1 часть 50%-ного раствора цитрата натрия с 8 частями аллергена. Сухие аллергены для приготовления . рабочего растворяют в 51ном растворе цитрата натрия. В обе пробирки в околодоиную часть вносят по 0,1 мл крови. Для получения антикоагулирующего эффекта содержимое пробирок слегка встряхивают. Пробирки помещают в термостат при . Через 2 ч содержимое пробирок встряхивают в целях равномерного распределения лейкоцитов во всем объеме смеси. Из каждой пробирки содержимое набирают в меланжер, для белой крюви до метки 0,5 и до 11 осторожно насасывают 5%-ный раствор уксусной кислоты. Меланжеры тщательно встряхивают, первые три капли выпускают на вату, затем заполняют камеру Горяева, Под микроскопом с увеличением 8x10 считают лейкоциты в 100 больших квадратах. Результаты обрабатывают по формуле: КМ . где КЛЛ - индекс коэффициента лизиса лейкоцитов; число лейкоцитов, насчитанное в 100 больших квадратах опытного препарата;число лейкоцитов, насчитанное в 100 больших о квадратах контрольного препарата. Результат считают положительным при значении KЛJJ 0,10 и более. Для определения показателя повреждения нейтрофилов из содержимого пробирок сразу порле взятия из

них крови меланжером готовит мазки средней толютны. Для используют химически чистые, обезжиренные предметные стекла. Подсушенные на воздухе мазки маркируют и фиксируют 40 мин в спиртовом растворе нитрата меди и нитрата кальция с добавлением к нему непосредственно перед фиксацией формалина (на 100 м 96° этилового спирта берут 1,8 г CulNO-i),, 0,9 г Ca(NO.j) и 10 мл 40%-ного формалина). После фиксации мазки отмывают от формалина в трех порциях 96°спирта (по 10 мин в каждой) и красят на выявление гликогена по методу Шабадаша: 40 мин выдерживают в растворе периодата при комнатной температуре, промывают 2 мин в дистиллированной воде погружают на 30 - 40 мин в реактив Шиффа, обрабатывают в порциях (по 3 мин в каждой) сернистой воды, промывают 30 мин в дистиллированной воде, ядра клеток докрашивают 5-8 мин ( в зависимости от качества красителя). 0,1%-ным раствором Азура П. Мазки просматривют под микроскопом с иммерсионной системой, увеличение 90x10. В каждом препарате исследуют 100 нейтрофилов и определяют количество поврежденных, т.е. с проявлением амебоидной активности. Расчет результатов:

0-ц

ппн

10О

где ППН - показатель повреждения

нейтрофилов;

О - число поврежденных нейтрофилов в опыте;

К - число поврежденных нейтрофилов в контроле 100 - количество просмотренных

в мазке клеток.

Результат считают положительным три значении ППН больше 0,10,

Для постановки,непрямой реакции дегрануляции тучных клеток кровь набирают в сухую пробирку з количестве 1,0 мл, помещают в бытовой холодильник, через 18 - 20 ч отсасывают сыворотку для реакции. Тучные клетки получают из перитонеального эксудата интактной крысй. Для этого крысе под глубоким эфирным наркозом вводят внутрибрюшинно 5-8 мл подогретого до 37°С раствора без глюкозы. После 1,5 минутного легкого массажа брюшка делают послойный разрез длиной 15 м через все слои передней брюшной стенки. Крысу быстро поворачивгиот брюшком вниз и собирают стекающий из разреза по кишечным петлям эксудат с раствором Тироде.Взвесь клеток цинтрифугируют 2 мин. при 1 тыс, об/мин, 4/5 объема декантата удаляют f, осадок ресуспендируют в

оставшемся объеме надосадочной жидкости. На предметное стекло, заранее окрашенное 0,3%-ным спиртовым раствором нейтрального красного, наносят по капле исследуемой сыворотки, аллергена и взвеси тучных клеток, тцттельно смешивают стеклянной палочкой и закрывают обезжиренным покровным стекпом. На отдельных стеклах проверяют пригодность ( отсутствие спонтанной дегрануляции), токсичность :;ыворотки (.тучные клетки + сыворотка) , аллергена (тучные клетки + + аллерген) и специфичность реакции (тучные клетки + сыворотка + контрольный аллерген). Все препараты помещают во влажные камеры и термостатируют 10 мин при 37°С, Препараты просматривают при увеличении 40x10, Определяют процент разрушенных

0 тучных клеток. Результат считают положительным при разрушении более 10% тучных клеток в опытном препарате при отрицательном контроле (меньше 10 разрушенных тучных клеток и 100 просмотренных).

5

Опыты, проведенные на 10 группах экспериментальных животных (236 морских свинок) позволяют сделать Q вывод, что аллергическими методами in vitro возможно выявить сенсибилизацию инфицированного организма вирусом ЛХМ, начиная С 3 дня инфекции, в то время, как внутрикожные аллергические пробы были положитель5ными только с 14 дня заболевания. С этого же срока стала возможна и серодиагностика,

Предлагаемый способ обеспечивает раннюю диагностику лимфицитарного

0 хориоменингита. Любой из трех предлагаемых тестов обеспечивает раннее выявление заболевания. Все реакции просты, требуют минимального количества крови для исследования, воспро5изводимы в практической лаборатории при наличии коммерческих гьллергенов.

Формула изобретения

1, Способ диагностики лимфоцитарного хориоменингита путем постановки реакции взаимодействия антигена и антитела, отличаю ГЦ ийс я тем, что, с целью ранней диагностики заболевания, в качестве антигена используют аллерген , полученный из мозга зараженных мьшей-сосунков, исследуют кровь с помощью аллергических тестов in vitro и по повышенной чувствительности организма к вирусу лимфоцитарного хориоменингита диагностируют наличие заболевания,

2. Способ по п, 1, о т л и чающийся тем, что в качестве аллер7745448

гических тестов используют показательИсточники информации,

повреждения нейтрофилов крови, коэф-принятые во внимание 17ри экспертиз фициент лизиса лейкоцитов и не-1. Леви М.И, Лимфоцитарный ,хопрямую дегрануляцию тучных кле-риоменингит. М., Медицина, 1964,

ТОКс. 124-125 (прототип).