Штамм @ @ 94/77-продуцент протеазного комплекса и препарата антибактериального и фунгицидного действия Советский патент 1985 года по МПК C12N15/00 C12N9/48 C12N15/00 C12R1/645 

00 0 Изобретение относится к микробиологическому производству протеолитических препаратов и препаратов, обла данщих антибактериальным и фунгицидным действием, и представляет собой новый штамм микрофильных грибов рода Hypomycee. Изобретение может быть применено в микробиологической, промышленности сельском хозяйстве и фитопа тологии. В настоящее время известны штаммы грибов, бактерий, актиномицетовпродуцентов протеолитических ферментов. Известен штамм. актиномицетов - продуцент протеолитических ферментов например термофильный актиномицет Micromonospora vulgar s 1 J. Недостатками этого штамма являютс низкая активность протеолитических ферментов в купьтуральной жидкости продуцентов; невысокая казеинолитическая активность в препаратах; образует только один полезный целевой продукт - протеазу и не образуют препарат, обладающий антибактериальным и фунгицидным действием. Наиболее близкими к предлагаемому по технической сущности и достигаемому положительному эффекту являются штаммы Dactylium dendroides и Мопо.sporium ap.aricinum |2j. Недостатками этих штаммов являют низкая казеинолитическая активность протеаз в культуральной жидкости; образуют препарат, обладающий тольк фунгицидным действием. Цель изобретения - получение штамма микофильного гриба Hypomyces rosellus 94/77, продуцирующего протеолитические ферменты с высокой казеинолитической активностью и препарат, обладающий -антибактериальным и фунгицидным действием. Штамм Hypomyces rosellus 94/77 хранится в музее промышленных микро организмов института ВНИИгеНетика под номером HMIIMF 242. I Предлагаемый штамм Hypomyces rostillus 94/77 выделен путем моноспорового рассева из налета гриба н плодовом теле Cystoderma amianthinum 9.9.1977 г. собранном в заказнике Звенигородской биостанции МГУ (Московская область. Одинцовский район) Идентификацию предлагаемого штамм проводили, используя- соответствующи источники литературы (Арнольд Г.Р. Предварительный обзор микофильных грибов СССР. Новости систематики низших растений, 7, 108-120, 1970; Cams W., Hoozemans A.S. Cladobotryum-konidien formen von Hypomycesarten,Persoonia, 6, 95-100, 1970). Предлагаемый штамм характеризуется следующими признаками. Морфологические признаки. Конидиенрсцы прямые, разветвленные. Конидиогенные клетки ампуловидные, расположены в мутовках по 3-6, 30-50 X 4-6 мкм, гиалиновые. Конидии холобластические, образующиеся в результате последовательной симпрдиальной пролиферации вершины конидиогенной клетки (симподулоконидии), одноклеточные, позднее с 1-3 поперечными перегородками, овальные или цилиндрические, с закругленными концами, у основания част то с небольшим сосочком, 24-32 х 913,5 мкм. Хламидоспоры обильные, округлые, коричневые. В парных культурах с совместными штаммами образуют сумчатую стадию. Субикулюм распростертый, сначала белый, позднее карминовый, плотный. Перитеции тесно скученные или разбросанные, сначала погруженные в субикулюм, позднее поверхностные, почти свободные, грушевидные с конусовидным носиком, красноватые, 320-350 X 280-400 мкм. Сумки цилиндрические, унитуникатные, 170-200 х X 6-8 мкм. Аскоспоры веретеновидные, двуклеточные, с перетяжкой, на концах с длинными придатками, бородавчатые, бесцветные, 28-40 х 6,57,5 мкм. Культуральные признаки. Среда Чапека с сахарозой. Колонии широко растущие, очень рыхлые, сначала белые, затем местами розовые или желтоватые. Спороношение необильное. Среда окрашена в бледно-розовый цвет. Среда Чапека с 0,5% кукурузного экстракта. Колонии широко растущие, пушистые, сначала белые, быстро приобретающие розово-малиновую окраску с коричневато-желтыми участками. Спороношение обильное, в виде белого порожистого налета по всей поверхности колонии. Обратная сторона колонии и среда темно-красные с желтовато-коричневыми участками. 3. Сусло-агар. Колонии широко расту щие, рьпспые, пушистые, с неровным краем, сначала белые, затем коричнево-желтые с обильными малиновыми участками, затем малиновые. Спороношение обильное, в виде белого порошистого налета по всей поверхност колонии. Обратная сторона колонии и среда карминно-красные до темнопурпурных. При глубинном культивировании из минеральных и органических среда штамм растет в виде гомогенной масс или мелких шариков. Мицелий окрашен в карминно-красный цвет, культураль ная жидкость имеет коричнево-красну окраску.. Физиолого-биохимические признаки Хороший рост штамма наблюдается при температуре 5-25°С, слабый рост при температуре 5-10С и . При температуре О и рост отсутствует. При росте на среде Чапека (основной солевой состав) усваивает нитрат калия и аммония, винно-кислый аммо-. НИИ, мочевину, пептон, гидролизат казеина, соевую муку, глюкозу, сахарозу, ксилозу, глицерин, маннит. Гид ролизует крахмал и в очень слабой степени целлюлозу. Чувствителен к антибиотикам трихотецйну и циклогексимиду. Патогенностью не обладает. Предлагаемьш штамм синтезирует внеклеточные протеолитические фермен ты с высоким казеинолитическим и фибринолитическим действием и препарат, обладающий антибактериальным и фунгицидным действием. Высокая активность штамма относительно стабильна при длительном (год-полтора года) хранении его на агаризованном сусле (4° по Баллингу в пробирках под вазелиновым маслом при комнатной температуре (18-24 С) Пример. Штамм Hypomyces ros lus 94/77 выращивают в пробирках н известной агаризованной среде (4 п Баллингу сусло, рН 6,0) в течение 5 сут при температуре . Затем мицелий гриба петлей из пробирки вносят в известную жидкую питательную среду, .содержащую 4° по Баллинг сусло с рН 6, 0. Посевной материал выращивают на качалке (200-220 об/ми в колбах емкостью 750 мл со 100 мл среды в течение 48 ч при 24-26С. 894 Затем посевной материал в количестве 7% по объему вносят в среду следующего состава, %: соевая мука 2,5; сахароза 2,0; вода водопроводная, рН 6,2 и выращивают тем же способом в течение 3 сут при , Культуральную жидкость отделяют от мицелия при помощи бумажных фильтров. Сравнительные данные протеолитической активности культуральной жидкости и з,она подавления роста тесторганизмов культуральной жидкостью предлагаемого штамма и прототипа представлены в табл. 1. Как видно из табл. 1, протеолитическая активность предлагаемого-штамма в 1,5-2 раза выше, чем у известных штаммов. Кроме того, предлагаемый штамм образует препаратjобладающий способностью подавлять рост фитопатогенных грибов, грамположительных и грамотрицательных бактерий, в .отличие от известных штаммов, образующих препарат только фунгицидного действия . Из культуральной жидкости предлагаемого штамма путем осаждения сернокислым аммонием при насыщении 0,60,7 при рН 7,0-8,0 выделяют протеолитический комплекс. Субстратная специфичность протеолитического комплекса Hypomyces rostillus 94/77 представлена в табл. 2. Фибринолитическая активность протеазного комплекса, определенная по методу Аструпа и Мюллертца (Astrup Т., Miillertz S. The estimation of plasmin and trypsin by means of the plate method. Acta physiologica Scand. V. 25, p. 93, 1952), составляла 7200-7750 усл.ед/мл. Температурный оптимум препарата 50°С. Препарат сохранял свою исход- ,. ную активность при 4 С в течение 3 месяцев. Препарат, подавляющий рост некоторых фитопатогенных грибов и грамотрицательных и грамположительных бактерий, экстрагируется из фильтрата культуральной жидкости хлороформом (1:1) при рН 5,0. Полученный экстракт дважды фильтруется через бумажные фильтры и обрабатывается петролейным эфиром в соотношении (1:15), Препарат, переше/уиий в петролейный

эфир, высушивается, осадок раствори ётся в этиловом спирте. .

Полученный препарат обладает анти- 5 бактериальйым и фунгицидным действием, подавляет рост следующих тест-организмов: Staphylococcus sureus, Escheric-r hia coll, Pseudomonas fluorescena. Bacillus subtllis, Halmyntosporium 10 eativum. .

Использование предлагаемого штамма по .сравнению с известными имеет следующие преимущества:

высокая, казеинолитйческая активность протеолитического комплекса и протеаз в культуральной жидкости;

образует препарат, подавляющий рост фитопатогенных грибов, грамположительных и грамотрицательных бактерий.

, Таблица

Штамм Hypomyces rosellus 97/77 (Коллекция Центрального музея промышленных микроорганизмов института ВНИИгенетика, коллекционный номер F 242) - продуцент протеазного комплекса и препарата антибактериального и фунгицидного действия. (Л

к/ Определяли по методу Сгоурис (Sgousis J.T. Vuman J,K. Mecall Х.В,

.The evalution of fibrinolytic preparation/ Vox. Sanguinis, v. 6, p. 53,

1961).

Kx/ Определяли методом диффузии в агар (Егоров Н.С. Микробы антагонисты и биологические методы определения антибиотической активности. Высшая школа, 1965); тест-организмы: 1 - Bacillus Subtilis; 2 - Helrayntosporium sativum; 3 - Escherichia coli.

I .Т a б л и-ц a 2