Способ выделения гликозаминогликанов из лейкоцитов крови Советский патент 1985 года по МПК A61K35/14 

vj

эо

vj

Изобретение относится к клинической биохимии и касается способа вьщепения гликозаминогликанов (ГАГ) из лейкоцитов человека.

Известен способ выделения ГАГ из лейкоцитов, включающий термоденатурацию лейкоцитов, экстрагинирование липидов этанолом и эфиром, переваривание проназой при 55°, обработку щелочью отделение белков и-нуклеиновых кислот трихлоруксусной кислотой, диализ для освобождения от низкомолекулярных примечей и осаждение конечного продукта цетилпиридинхлоридом с последующим переосаждением этиловым спиртом, насыщенным ацетатом натрия 1,

Однако полученные указанным методом ГАГ х актеризуются гетерогенностью, что затрудняет исследование их состава в клетках крови и изучение свойств отдельных видов ГАГ. Кроме того, известный метод не экономичен, как в силу длительности всей процедуры (13-14 дней), так и из-за применения дорогого импортного ферментп (проназы).

Цель изобретения - повьппение чистоты препарата гликозаминогликанов, упрощение и ускорение способа его

вьщеления.

I , .--,

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу выделения гликозаминогликанов из лейкоцитов крови путем экстракции липидов органическими растворителями, .обработки протеолитическими ферментами, осаждния балластных белков с последующей обработкой продукта четвертичноаммонийными основаниями и этанолом экстракцию липкдов проводят ацетоном, про-теолитическое расщепление папаиноМ в присутствии ЭДТА и цистеина, целевой продукт получают дифференциальной экстракцией раство рами солей возрастающей ионной силы

Способ осуществляется следующим образом.

Лейкоциты крови, вьщеленные дифференциальным центрифугированием, обрабатывают двукратно 10-15 объема ми ацетона, фильтруют на воронке Бюхнера и высушивают на воздухе. Полученный сухой порошок растирают при помощи гомогенизатора с фермент но-буферной смесью, содержащей кристаллический папаин (2 мг Ha,.JOO мг сухого порошка), 5 мМ цистена и

4 мМ ЭДТА а в 0,05 М фосфатном буфере, рН 7,5. Ферментно-буферная смесь берется из расчета 10 мл на 100 мг высушенных клеток. Суспензию клеток переносят в небольшие флакон и инкубируют при 65°С в ультратермостате в течение 4 ч После окончаг ния переваривания к полученному лизату добавляют 50%-ную трихлоруксусную кислоту до конечной концентрации 5%, и в течение ночи при происходит осаждение белков и ну.клеиновых кислот. Осадок удаляют центрифугированием при 3000 об/мин при . К супернатанту при интенсивном перемешивании добавляют 4 объем охлажденного до О-(-5°) 96%-ного этанола и 50%-ного раствора ацетата до конечной концентрации 0,5%. Оставляют для формирования осадка при 0-4С в течение 18-24 ч. Сформировавпшйся хлопьевидный осадок, представляющий собой ГАГ в смеси с гликгеном и другими высокомолекулярными соединениями, отделяют центрифугированием при 3000 об./мин при 0-4 в течение 20 мин. Осадок растворяют в дистиллированной воде, добавляют NaCl до конечной концентрации не вьш1е 0, 15 М, обеспечивая полное растворение, после чего добавляют 0,2 объема 5%-ного раствора бромистого цетилтриметиламмония (цетавлона) - chemapol (Чехословакия). Специфическое формирование комплекс са ГАГ с цетавлоном происходит в течение 30-60 мин при или 8-10 ч при комнатной температуре.

Для уплотнения осадка добавляют 5-10 мг целита и отделяют комплекс ГАГ - цетавлон центрифугированием. Осадок промывают 0,2 М NaCl для удаления низкомолекулярных балластных примесей. Дифференциальную экстракцию ГАГ осуществляют поочередным добавлением к осадку небольших объемов растворов хлористого натрия в концентрации 0,5, 0,7, 1,0 и 2,0 М. Вследствие гетерогенности ГАГ (различий их по молекулярной массе и полианионным свойствам) их комплексы с детавлоном различаются по растворимости, и при помощи дифференциальной экстракции удается выделить отдельно разные виды ГАГ. Фракции, экстрагируемые 1М и 2М NaCl, не различаются, по составу, поэтому их объединяют. Полученные фракции ГАГ переосаждают и дополнительно очищают от примесей добавлением 4 объемов охла1жденного до О этанола с добавлением ацетата Na в конечной концентрации 0,5-1%. Оса дение очищенных ГАГ происходит в течение ночи при 0-4°С, осадки отде ляют центрифугированием при 3000 об./мин в течение 20 мин. Полу ченные осадки ГАГ растворяют в дистшшированной воде или физрастворе, при необходимости проводят стерилизующую фильтрацию через мембранные фильтры Миллипор, хранят в замороженном или лиофилизированном состоянии. Для анализа фракций применяют электрофорез в ацетатцеллюлозе содержание и выход ГАГ определяют по концентрации уроновых кислот, определенньй карбазольным методом. Выход ГАГ в среднем составляет 110130 мкг уроновых кислот на 100 мг ацетонового порошка лейкоцитов. Пример 1. К 280 мл донорской крови, заготовленной на консер винте с цитратом натрия, добавля от 70 мл 3%-ного раствора пищевой желатины в физиологическом растворе хлорида натрия, после чего в течение 1 ч клетки крови оседают при 37С. Верхний плазменный слой, содержащий лейкоциты и тромбоциты, переносят в центрифужные стаканы и центрифугируют при 1200 об/мин в течение 15 мин при комнатной температуре на центрифуге К-70. Осадок лейкоцитов (1 мл) двукратно промывают 10 мл физиологического раствора на центрифутер Ш1К-1 при 1000 об./мин. Для удаления примеси эритроцитов к промытому осадку добавляют 7 мл охлажденного 0,83%-ног Шу-С в 0,0125 М трис-НСЕ буфере, рН 7,4, затем пробу тщательно перемешивают и удаляют образовавшийся. гёмолизат центрифугир1ованием на ден рифугер Щ1К-1. Осадок промывают физиологическим раствором, Вьзделенные лейкоцитов (в объеме 0,6 мл) обрабатывают 9 мл ацетона, затем растирают в гомогенизаторе и фильтруют через воронку Бюхнера,используя вакуумный насос. Полученный порошок обезвоженных и частично обезж ренных клеток высушивают на воздухе Из 280 мл донорской крови получа ют 100 мг сухого порошка клеток. К 100 мл сухого порошка клеток приливают 10 мл ферментно-буферной смеси, содержащий 2 мг кристаллического папаина, 8,7 мг цистеина и 18,6мг ЭДТА в 0,05 М фосфатном буфере, рН 7,5, и растирают в гомогенизаторе. Взвесь переносят во флакон емкостью 20 мл и инкубируют в ультратермостате при 65 С в течение 4 ч. После окончания переваривания к полученному лизату добавляют 1,0 мл 50% ТХУ. Смесь оставляют на ночь в холодильнике при 4°С для осаждения белков и нуклеиновых кислот. Осадок удаляют центрифугированием при 3000 об/мин при . К супернатанту при интенсивном перемешивании добавляют 40 мл 96%-ного охлажденного этилового спирта и 0,5 мл 50%-ного раствора ацетата Na, Оставляют до формирования осадка в течение 18 ч при 4°С Сформировавшийся хлопьевой белый осадок отделяют центрифугированием при 3000 об/Miffl при в течение 20 мин, супернатант отбрасывают. Осадок растворяют в 2,0 мл дистиллированной воды и добавляют 3 капли 1,0м раствора хлорвда натрия до полного растворения, К пробе добавляют 0,4 мл 5%-ного водного, раствора цетавлона; Осаждают ГАГ при 37С в течение 1 ч. Для получения более плотного осадка добавляют 10 мг целита и проводят центрифугирование пробы при 4000 об/мин в течение 10 мин при комнатной - емпературе, супернатант удаляют, а осадок суспендируют в 2,0 мл 0,2 М раствора NaC, Дифференциальную экстракцию ГАГ из компле сса с цетавлоном осуществляют добавление- к осадку раствора хлорида Na:1-я экстракция проводились 0,5 М NaCl (1,5 мл); 2-я экстракция - 1,0 мл 0,7 М NaC, 3-я - 1,0 мл 1,0 М NaCl, 4-я 0,5 мл 2,0м раствора хлорвда натрия, После каждой экстракции пробу центрифугируют. Экстракты ГАГ, полученные при концентрации NaCt 1,0 и 2,0 М, объединяют. Полученные фракции ГАГ при концентрации хлорида Na 0,5, 0,7 и 1 +2,0 М переосаждают соответственно 6,0; 4,0 и 6,0 мл. переохлажденного до -4С этанола при этом в каждую пробу с ГАГ добавляют 3 капли 50%-ного раствора ацетата Nd, Осадки, содера цие очищенные ГАГ, растворяют в дистиллированной воде. После определения содержания ГАГ пробы замора живают или подвергают стерилизукяцей фильтрации с последующей лиофилизацией целевого продукта. Выход ГАГ из лейкоцитов составляет 120 мкг уроновых кислот из 100 мг сухого порошка. Пример 2. Вся процедура получения ГАГ проводится по примеру 1, за исключением некоторых режимов - параметров способа. Так, например, при полученш лейкоцитов осадок лейкоцитов (1,2 мл) двукратно промывают 15 мл физиологического раствора; для удаления примеси эритроцитов к промытому осадку добавляют 10 мл охлажденного 0,83%-ного в 0,0125 М трис-НС буфере...Вьщеленные клетки лейкоцитов (0,7 мл) обрабатывают 7,0 мл ацетона. Из 280 мл донорской крови получают 105 мг сухо го порошка клеток. При получении ГАГ осаждение белков и нуклеиновых кислот проводят при 6°С...После добавления охлажденного спирта и ацетата натрия осадок формируется в течение 24 ч. Осаждают ГАГ при 37С в течение 30 мин. Для уплотнения осадка добавляют 5 мг целита... Выхрд ГАГ из лейкоцитов составляет 115 мкг уроновых кислот из 100 м сухого порошка. П р и м е р 3. То же самое, что в примере 1, только стадию осаждения ГАГ цетавлоном проводят при комнатной температуре в течение 10 ч. Выход ГАГ из лейкоцитов составляет 130 мкг уроновых кислот из 100 м ацетонового порошка клеток. Идентификацию гликозаминогликонов осуществляют следующим образом. Анализ фракций ГАГ включает определение содержания гексазаминрв, галактозаминов, уроновых кислот, сульфата и электрофоретический анаЛИЗ на ацетатцеллюлозных пленках. Электрофорез проводят в 0,25 М

Са-ацетатном буфере, рН 5,5 при ппот- 50 ьгх лейкозами. ности тока 0,5 Ма/см в течение 4 ч на приборе ПЭФ-3 на ацетатцеллюлозных пленках фирмы Pratiga (Италия) с перфорацией. Пробы наносят при помощи амшшкатора этой же фирмы. Окраску электрофореграмм проводят 0,5%-ным раствором Алциан синего в 3%-ном растворе CHjCOOH или 0,2%ным раствором толуидина в 2%-ном CHjCOOH с последующей отмывкой фона 1%-ным раствором , а затем водой. В качестве стандартов ГАГ используется хондройтин-4-сульфат Sigma (США), гиалуроновая кислота, полученная из стекловидного тела кролика, и гепарансульфат из печени крысы.. Электрофоретические исследования ГАГ, выделяемых из лейкоцитов крови, свидетельствуют о том, что они представлены в основном хондроитинсульфатом, об этом также говорят данные определения гексозаминов, сульфата . и уроновых кислот и их соотношение. Тот факт, что ГАГ расщепляются тестикулярной гиалуронидазой без образования свободного ацетилгексозамина, свидетельствует о том, что ГАГ лейкоцитов представлены хондроитинсульфатом. Предлагаемый метод вьвделенич ГАГ из лейкоцитов крови позволяет значительно ускорить и упростить процедуру выделения ГАГ (сокращается время вьщеления от 13-14 до 4 сут} исключается стадия диализа, сокращается время протеолиза с 2-3 сут до 4 ч и т.д.). Кроме того, в предлагаемом методе не используются дефицитные реактивы, в частности проназы. Предлагаемый метод позволяет получить целевой продукт в более очицен- ном виде, об этом свидетельствуют данные электрофорбтического анализа. Разработанный способ выделения ГАГ из лейкоцитов крови позволяет проводить исследования количественного содержания ГАГ, их состава в клетках крови здоровых людей и боль

СПОСОБ ВВДЕЛЕНИЯ ГЛИКОЗАМИНОГЛИКАНОВ ИЗ ЛЕЙКОЦИТОВ КРОВИ путем экстракции липидов органическими растворителями, обработки протеолитическими ферментами, оСаждения балластных белков с последующей обработкой продукта четвертичноаммонийными основаниями и этанолом, о тл и ч а ю щ и и с я тем, что, с целью повышения чистоты целевого продукта, упрощения и ускорения способа, экстракцию липидов проводят ацетоном, протеолитическое расщепление - папаином в присутствии ЭДТА и цистеина, целевой продукт получают дифференциальной экстракцией растворами солей возрастающей ионной силы. (Л