Способ диагностики системных заболеваний соединительной ткани Советский патент 1993 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к медицине и применяется для определения патологических изменений со стороны соединительной ткани при различных системных заболеваниях.

Способ диагностики системных заболеваний соединительной ткани путем исследования сыворотки крови заключается в том, что для повышения точности и сокращения времени исследования в сыворотке крови и в моче определяют содержание гли- козаминогликанов (ГАГ).

Для диагностики системных заболеваний соединительной ткани исследуются различные параметры, в частности исследуется соотношение между белковыми фракциями, для чего применяется элёктрофоретическое разделение на бумаге. Принцип определения основан на различной скорости перемещения Фракций в электрическом поле. Для системных заболеваний характерна гипергаммаг- лобулинемия, наиболее выраженная в активной стадии, при тяжелом течении патологического процесса. В то же время дис- протеинемия может отсутствовать у 40-70%

больных. Данный признак рассматривается как неспецифический.

В диагностике также используется определение содержания С-реактивного белка унифицированным методом кольцпреципи- тации в капиллярах. Принцип метода основан на том, что сыворотка крови, содержащая белок острой фазы, образует хлопьевидный преципитат при взаимодействии со специфической преципитирующей иммунной сывороткой к этому антигену. При низкой активности процесса, нетяжелом течении С-реактиеный белок может отсутствовать. Показатель не выявляется у 55-85% больных, также является неспецифическим. . Отсутствие корреляции между указанными показателями и точностью диагностики ограничивает их значимость,

Известе н способ диагностики системных заболеваний путем исследования ГАГ в сыворотке крови.

Метод состоит из этапов: 1) ферментативный протеолиз сыворотки крови, осуществляемый добавлением к 1,5 мл свежей сыворотки 0,3 мл раствора проназы с последующиминкубированием в течении 4 ч при

XJ

О

ч о о го

5 °С; 2)депротеинизация полученного гид- олизата с последующим выделением, и чисткой полученных ГАГ; 3) определение ГАГ по уроновым кислотам карбазоловым етодом.

Данная работа принята за прототип. По равнению с предлагаемой она менее точна.

Цель изобретения - повышение точности и ускорения способа диагностики нарушений метаболизма соединительной ткани. Поставленная цель достигается тем, что определяют ГАГ в сыворотке крови и в моче, причем исследование ГАГ в моче проводят после ее фильтрования и инкубации 2-2,5 мл с цетилпиридинийхлоридом в течении 25-35 минут, определяют соотношение между содержанием ГАГ в сыворотке крови и в моче и путем увеличения данного коэффициента диагностируют системное заболевание соединительной ткани.. :.. Новым в представленном способе является определение соотношения между содержанием ГАГ в сыворотке крови и в моче. Дополнительно разработан тест по выявлению степени тяжести патологического процесса, активности системных заболеваний соединительной тканм. В определении содержания ГАГ, экскретируемых с мочой, после фильтрации исследуемого материала и инкубирования с цетилпиридинийхлоридом, производится измерение на ФЭКе..

Сущность изобретения поясняется следующим образом,

П р име р . Больной Ю., 16лет, поступил с диагнозом: генерализованная бляшечная склеродермия, с жалобами на неприятные ощущения типа легкого жжения, покалывания в области пораженного участка кожи на наружной поверхности правого бедра, стя- нутость в области голеней, Считает себя больным около 2 месяцев, когда после переохлаждения стали появляться сиреневатые пятна на коже груди, живота, бедер. Ранее лечение не проводилось.

При поступлении общее состояние - удовлетворительное. Со стороны внутренних органов патологических изменений не выявлено. На коже шеи, груди, живота, предплечий, плеч, голеней имеются распространенные, сливающиеся очаги поражения, сиреневато-фиолетового цвета, уплотненные, с частично атрофированной поверхностью, занимающие большую часть кожного покрова. В области наружной поверхности правого бедра имеется белесовато-желтый уплотненный очаг до 6 см в диаметре, окруженный розовато-сиреневым венчиком до 0,3 см шириной, постепенно переходящей в неизмененную кожу. У

больного взяли 4 мл крови из локтевой вены, 2,5 мл мочи для определения содержания ГАГ.

Кровь оставляли для коагуляции на 45

мин при 4° С, затем центрифугировали при 500 g 45 мин при 4° С. Добавляли 0,2 мл раствора проназы, содержащей 15 мл про- назы Е ( на 1 мл 0,05 М трисацетатного буфера при рН 8). После протеолиза в течение 4 ч при 45° С добавляли 2,4 мл водяного раствора 17% NaCI, а затем 60 мл 3 N уксусной кислоты, заткнули пробирку пробкой и нагревали, выдерживая при 100 С в течение 5 мин и охлаждали в водяной бане. Центри5 фугировали при 30 000 g в течение 20 мин, затем брали 3 мл чистого супернатанта и помещал в стеклянную пробирку. Добавляли 9 мл этанол/ацетата при 4 °С (0,2 г ацетата к 250 мл этанола), встряхивали,

0 выдерживали 1 ч при 4° С и центрифугировали при 3000 g 20 мин при.4° С. Декантировали супернатант, оставляли пробирку перевернутой на фильтрованной бумаге в течение 5 мин, добавляли 6 мл 0,015% це5 тилпиридинийхлорида при 37° С в 0,02 М NaCI. Смешивали энергично до полного ре- суспендирования осадка и оставляли на 15 ч при 4 °С. Нагревали пробирку до 20° С и центрифугировали при 3000 g 20 мин при

0 комнатной температуре. Осторожно удаляли супернатант и оставляли пробирку перевернутой на фильтровальной бумаге в течение 5 мин. Добавляли к осадку 0,25 мл 0,15 N серной кислоты и переносили в 37° С.

5 Затем добавляли 1,5 мл 0,0125 М Na тетра- бората в концентрированной серной кислоте. Охлаждали этот раствор до 4° С и вливали медленно по стенке пробирки. Смешивали, пробирку помещали в ледяную ба0 ню, затем накрывапи и нагревали 5 мин при ТОО °С. Охлаждали до комнатной температуре, перемешивали и переносили в спект- рофотометрическую кювету, измеряли абсорбцию при 520 нм. Вычисление произ5 водили по формуле:

А гексуроновые кислоты сыеоротки .

А стандарт

А гексуроновые кислоты сыворотки - абсорбция сыворотки 0 А стандарт - абсорбция стандарта

1,22 - фактор корреляции, соответствующий потере объема 1 мл сыворотки в процессе теста

стандарт: 10 мг глюкуроновой кислоты в 5 0,25 мл 0,15 N серной кислоты

А гексуроноеые кислоты сыворотки v , „„

---- -----.------ ---

А стандарт 1.083 1.22

0.55 2,4мг ГАГ/ЮО мл сыворотки

2,4 10 /п

Для определения экскретируемых ГАГ в качестве контрольной пробы взяли 1 мл профильтрованной мочи и 1 мл 0,1 М цитрат- ного буфера, в качестве опытной пробы - 1 мл профильтрованной мочи и 1 мл цетилпи- ридинийхлорида; одновременно сопытной и контрольной пробами ставился стандарт: в пробирке вмешивали 0,1 мл основного стандарта, приготовленного из расчета 0,02 г хондроитинсульфата на 100 мл 0,1 М цит- ратно го буфера, 0,9 мл НаО, 1 мл 0,1 %-ного цетилпиридинийхлорида. Во всех пробирках содержимое перемешивали, после 25 мин пребывания при комнатной температуре вновь перемешивали и производили измерение на ФЭКе-56 против HgO в кюветах 0,5 см, синий светофильтр № 3. Содержание ГАГ определялось из расчета на количество креатинина, исследуемого следующим образом: в качестве контрольной пробы взяли 0,5 мл свежей профильтрованной мочи, 3 мл 2 %-ного раствора пикриновой кислоты, тщательно перемешали и добавили 0,2 мл NaOH, после 10 мин при комнатной температуре добавили Н20 до объема 100. мл; в качестве контрольной пробы: к 3 мл 2%-ного раствора пикриновой кислоты добавили 0,2 мл 10% NaOH и довели до 100 мл Нгб; в качестве стандартной пробы; 3 мл 2%-ной пикриновой кислоты, 0,2 мл 10% NaOH добавили к 0,5 мл основного раствора стандарта креатинина, после 10 мин при комнатной температуре добавили НаО до 100 мл; измерили против контроля опытную и стандартную пробы на ФЭКе 56 с синим светофильтром iSfe 3. Получили содержание креатинина,. рассчитанное по формуле

Е™ 100 60мг%,где

t СТ .

Е оп. - экстинкция опытной пробы Е ст. - экстинкция стандартной пробы Содержание ГАГ рассчитывали по формуле:

Е ст.к.

Х ЕО -20

ст.

ок.

г ГАГ/ гкреат.

0,100 -20 -0,30

г ГАГ/кг кр

0,12-0,180 30 г ГАГ/кг креат.,

где Е о. - экстинкция опытной пробы

Е ст.к. - экстинкция Стандартной пробы для креатинина

Е ст. - экстинкция стандартной пробы ГАГ

Е O.K. - экстинкция опытной пробы креатинина

20 - коэффициент корреляции, соответствующий потере обьема.

Так как показатели содержания ГАГ в сыворотке крови и в моче могут колебаться в сравнительно больших пределах, но в организме постоянно поддерживается баланс между синтезируемыми и экскретируемыми ГАГ, произвели определение соотношения между содержанием ГАГ в сыворотке крови ив моче, используя для удобства умножение коэффициента на 10. . У больного Ю. коэффициент составил:

in 2 ГАГ сыворотки крови ....

ГАГ мочи

15

10 2 24 3Q°-- г ГАГ/кг креат . 0,08 .

Для сравнения у здоровых доноров ко- 0 эффициент составляет в среднем

0-04+0-009л-ГкЛреаГт. Л р и м е р. Больная К., 1 б лет, поступила с диагнозом: системная склеродермия, с жа5 лобами на общую слабость, недомогание, неприятные ощущения типа легкого жжения, бегания мурашек по коже, уплотнения кожи кистей, предплечий, изъязвления . на коже кистей, ограничение подвижности мелких суставов кисти, локтевых, коленных, потерю массы тела. Ранее лечение не проводилось.

При поступлении общее состояние - относительно удовлетворительное. Больная пониженного питания, отмечается анемия лица, сужение ротовой щели,-диффузное уплотнение кожи, более выраженное на кистях, предплечьях, диффузная гиперпигментация, выражены сгибательные контрактуры в мелких суставах кисти, объем движений в локтевых и коленных суставах ограничен. В легких дыхание - везикулярное, тоны сердца - приглушены, ритмичны, живот - мягкий, безбо- лезненный, печень не увеличена, симптом

° Пастернацкого - отрицательный с обеих сторон. У больной взяли 4 мл крови из локтевой вены, 3 мл мочи для определения содержания ГАГ.

Кровь оставляли для коагуляции на 45 мин при4° С, а затем центрифугировали при 500 g 45 мин при 4 С. Добавили 0,2 мл раствора, проназы, содержащей 15 мл про- назы Е (на 1 мл 0,05 М трисацетатного буфера при рН 8). После протеолиза в течение 4

0

5

5

ч при 45 С добавляли 2,4 мл водного раствора 17%-ной Had, а затем 60 мл 3 N уксусной кислоты, заткнули пробирку проб(ГД .

кой и нагревали, выдерживая при 100 С в течение 5 мин и охлаждали в водяной бане.

Центрифугировали при 30 000 g в течение 20 мин, затем брали 3 мл чистого супернатанта и помещали в стеклянную пробирку. Добавляли 9 мл этанол/ацетата при 4° С (0,2 г ацетата к 250 мл этанола), встряхивали, вы- держивали 1ч при 4° С и центрифугировали при 3000 g 20 мин при 4° С. Декантировали супернатант, оставляли пробирку перевернутой на фильтровальной бумаге в течение 5 мин, добавляли 6 мл 0,014% цетилпиридиний- хлорида при 37° С в 0,02 М NaCI. Смешивали энергично до полного ресуспекдирования осадка и оставляли на 15 мин при 4 С. Нагревали пробирку до 20° С и центрифугировали при ЗОООд 20 мин при комнатной температуре. Ос- торожноудаляли супернатант и оставляли пробирку перевернутой на фильтровальной бумаге в течение 5 мин. Добавляли к осадку 0,25 мл 0,15 N серной кислоты и переносили в 37° С. Затем добавляли 1,5 мл 0,0125 М тетра- бората в концентрированной серной кислоте. Охлаждали этот раствор до 4 С и вливали медленно по стенке пробирки. Сме- ииивали, пробирку помещали в ледяную баню, затем накрывали и нагревали 5 мин при 100° С. Охлаждали до комнатной температуры, перемешивали и переносили в спектро- фотометрическую кювету, измеряли абсорбцию при 520 нм. Вычисление производили по формуле: А гексуроновые кислоты сыворотке х 1.22 А стандарт

Стандарт:

10 мг глюкуроновой кислоты в 0,25 мл 0,15 N серной кислоты А гексуроновые кислоты сыворотки х 1.22 А стандарт

1,62 -Г,22 -овл.щ-у

---055---3-60-10 /л

Для определения экскретируемых ГАГ в качестве контрольной пробы взяли 1 мл профильтрованной мочи и 1 мл 0,1 М цитрат- ного буфера, в качестве опытной пробы - 1 мл профильтрованной мочи и 1 мл цетилпи- ридинийхлорида; одновременно с опытной и контрольной пробами ставился стандарт: в пробирке смешивали 0,1 мл основного стандарта, приготовленного из расчета 0,02 г хондроитинсульфата на 100 мл 0,1 М цитрат- ного буфера, 0,9 мл hfeO, 1 мл 0,1% мл цетил- пиридинийхлорида. Во всех пробирках содержимое перемешивали, после 35 мин пребывания при комнатной температуре вновь перемешивали и производили изме- рение на ФЭКе 56 против НаО в кюветах 0,5 см; синий светофильтр № 3, Содержание ТАГ определялось из расчета на количество креатинина, исследуемого следующим образом: в качестве контрольной пробы взяли

0,5 мл свежей профильтрованной мочи, 3 мл 2%-ного раствора пикриновой кислоты, тщательно перемешали и добавили 0,2 мл 10%-ной NaOH, после 10 мин при комнатной температуре добавили Н20 до объема 100 мл; в качестве контрольной пробы: к 3 мл 2% раствора пикриновой кислоты 0,2 мл 10%-ной NaOH и довели до 100 мл в качестве стандартной пробы: 3 мл 2% пикриновой кислоты, 0,2 мл 10% NsOH добавили к 0,5 мл основного раствора стандарта креатинина, после 10 мин при комнатной температуре добавили НаО до 100 мл; измерили против контроля опытную и стандартную пробы на ФЭКе-56 синим светофильтром № 3. Получили содержание креатинина, рассчитанное по формуле:

Е оп . - 100 пп о, - 90 мг % , где

где Е on. экстинкция опытной пробы Е ст. - экстинкция стандартной пробы Содержание ГАГ рассчитали по формуле:

20 -Ее™.

JMsст

ок

г ГАГ/кг креат .

0.240 -20-0.30 лл глг/ 0.12 -0,270- Г ГАГ/КГ кРеат где Е о. - экстинкция опытной пробы

Е ст.к. - экстинкция стандартной пробы для креатинина

Е о к. - экстинкция опытной пробы креатинина

20 - коэффициент корреляции.

Соотношение между содержанием ГАГ в сыворотке крови и в моче составило:

г г ГАГ л кг креат.

0,08

г г ГАГ

л кг креат.

Пример. Больная С„ 66 лет поступила с диагнозом: склероатрофический лмхен, сопутствующее заболевание: сахарный диабет легкой степени тяжести, Предъявляла жалобы на легкий зуд, периодически - чувство покалывания, жжение на различных участках кожного покрова, высыпания на туловище, конечностях.

При поступлении общее состояние - удовлетворительное. Больная повышенного питания, имеется диффузное поражение кожного покрова в виде белесоватых участков атрофии, с блестящей поверхностью, частично сливающихся. Со стороны внутренних органов на момент осмотра патологических изменений нет. У больной взяли 4 мл крови из локтевой вены, 3,5 мл мочи для определения содержания ГАГ.

Кровь оставляли для коагуляции на 45 мин при 4°С, а затем центрифугировали при 500 g 45 мин при4° С. Добавили 0,2 мл раствора проназы, содержащей 15 мл проназы Е (1 мл 0,05 М трисацетатного буфера при рН 8). После протеолиза в течение 4 ч при 45° С добавляли 2,4 мл водного раствора 17%-ной NaCI, а затем 60 мл 3 N уксусной- кислоты, заткнули пробирку пробкой и нагревали, выдерживая при 100° С в течение 5 мин и охлаждали в водяной бане. Центрифугировали при 30 000 g в течение 20 мин, затем брали 3 мл чистого супернатанта и помещали в стеклянную пробирку. Добавляли 9 мл этанол-ацетата при 4 С (0,2 г ацетата Na к 250 мл этанола), встряхивали, выдерживали 1ч при 4° С и центрифугировали при 3000 g 20 мин при 4° С. Декантировали су- пернатант, оставляли пробирку перевернутой на фильтровальной бумаге в течение 5 мин, добавляли 6 мл 0,015% цетилпиридиний- хлоридэ при 37° С в 0,02 М Nad. Смешивали энергично до полного ресуспендирования осадка и оставляли на 15 ч при 4 С Нагревали пробирку до 20° С и центрифугировали при 3000 g 20 мин при комнатной температуре. Осторожно удаляли супернатант и ос- тавляли пробирку перевернутой .на фильтровальной бумаге в течение 5 мин. Добавляли к.осадку 0,25 мл 0,15 N серной кислоты и переносили в 37° С. Затем добавляли 1,5 мл 0,0125 М тетрабората Na в концентрированной серной кислоте. Охлаждали этот раствор до 4 С и вливали медленно по стенке пробирки. Смешивали, пробирку помещали в ледяную баню, затем накрывали и нагревали 5 мин при 100° С. Охлаждали до комнатной температуры, перемешивали и переносили в спектрофото- метрическую кювету, измеряли абсорбцию при 520 нм. Вычисление производили по формуле:

А гексуроновые кислоты сыворотки х 1,22 А стандарт

1,062

0,55

122- 2,36 -10-

г/л

Для определения экскретируемых ГАГ в качестве контрольной пробы взяли 1 мл профильтрованной мочи и 1 мл 0,1 М цитрат- ного буфера, в качестве опытной пробы - 1 мл профильтрованной мочи и 1 мл цетилпи- ридинийхлорида: одновременно с опытной и контрольной пробами ставился стандарт: в пробирке смешивали 0,1 мл основного стандарта, приготовленного из расчета 0,02 хондроитинсульфата на 100 мл 0,1 М цитрат- ного буфера, 0,9 мл НаО 1 мл 0,1 М цетилпи- ридинийхлорида. Во всех пробирках

содержимое перемешивали, после 30 минут пребывания при комнатной температуре вновь перемешивали и производили измерение на ФЭКе-5б против Н20 в кюветах 0,5

см, синий светофильтр № 3. Содержание ГАГ определялось из расчета на количество креатинича, исследуемого следующим образом: в качестве контрольной пробы: 3 мл 2%-ный пикриновой кислоты, 0,2 мл 10%

NaOH добавили к 0,5 мл основного раствора стандарта креатинина, после 10 мин при комнатной температуре добавили Н20 до 100 мл; измерили против контроля опытную и стандартную пробы на ФЭКе-56 с синим

фильтром Ns 3. Получили содержание креатинина, рассчитанное по формуле

( 75мг% Содержание ГАГ рассчитали по формуле:

С о

20 Е

ст.к

ст.

ок

0,142 -20 -0.30

102

0,12 0,225

Коэффициент составил:

ГАГ сыворотки крови

ГАГ мочи

2.36 -.1.0 2 10 2 г г ГАГ 32 л кг креат

32 г ГАГ/кг креат ,

5

0

0

0,07

г г ГАГ

л кг креат . Представленные примеры демонстрируют увеличение соотношения между содержанием ГАГ в сыворотке крови и в моче до 0,07 и выше. Определение данного пэра- метра позволяет повысить диагностическую

точность до 81% по сравнению с 63% при использовании прототипа. В 19% случаев увеличения параметра до 0,07 и выше отмечено не было.

р. Пример. Больная Б., 20 лет, поступила с диагнозом: бляшечная склеродермия, с жалобами на неприятные ощущения типа легкого жжения, покалывания в области пораженного участка кожи на наружной поверхности правого бедра. Считает себя больной около 5 месяцев, когда на месте сильного удара появилась сиреневая полоса до 2 см в.диаметре, постепенно увеличивавшаяся. Ранее лечение не проводилось.

ц При поступлений общее состояние - удовлетворительное.

Со стороны внутренних органов патологических изменений не выявлено. На наружной поверхности верхней трети правого .бедра имеется белесоватый очаг размером

до 4 см, плотный, окруженный сиреневой полосой до 0,3 см шириной, постепенно переходящей в неизмененМ1Ю кожу. У больной взяли 4 мл крови из локтевой вены, 2,5 мл мочи для определения содержания ГАГ,

Кровь оставляли для коагуляции на 45 мин при 4° С, а затем провели определение содержания ГАГ по приведенной выше методике. Вычисление проводили по формуле:

А гексуроновые кислоты сыворотки . „о з А стандарт,

1 °5Q551 2 2,34 мг ГАГ/100 мл

сыворотки 2,34 10 г/л .

Для определения экскретируемых ГАГ контрольную, опытную и стандартную пробу ставили в соответствии с описанием, приведенным в примере 1. Во всех пробирках содержимое перемешивали, после 35 мин пребывания при комнатной температуре вновь перемешивали и производили измерение на ФЭКе-56 против НгО в кюветах 0,5 см, синий светофильтр № 3.

Содержание ТАГ рассчитали по формуле:

Е ок. 20 Е ст

ст.к

оп

- г ГАГ/кг креат.

-%УЈ;& 45 г ГАГ/кг креат .

где Е ст.. - экстинкция стандартной пробы для креатинина

Е оп. к -экстинкция опытной пробы ГАГ Е ст. - экстинкция стандартной пробы ГАГ

Е оп. к - экстинкция опытной пробы креатинина,

20- коэффициент корреляции, соответ- ствующий потере объема

; Так как показатели содержания ГАГ в сыворотке крови и в моче могут колебаться в сравнительно больших пределах, но в организме постоянно поддерживается баланс между синтезируемыми и экекретируемыми ГАГ, произвели определение соотношения между содержанием ГАГ в сыворотке крови и в моче, используя для удобства умножение коэффициента на 10 2. У больной Б. коэффи- циент составил:

ГАГ сыворотки крови . 1П2 ГАГ мочи

102

25

2.34 -10 45

г ГАГ/кг креат . 10 2 - 0,052

Для сравнения у здоровых доноров коэффициент составляет в среднем

0,04 ± 0, . В данном случае его

Ki K|J i,

повышение не позволяет диагностировать системное заболевание соединительной ткани, так как показатель не достигает 0,07.

Применение: медицина. Сущность изобретения: определяют соотношение между содержанием гликозаминогликанов в сыворотке, крови и в моче. Системное заболевание соединительной ткани диагностируют при значении этого соотношения 0,07 и выше. Цель изобретения - повышение точности диагностики нарушений метаболизма соединительной ткани.

Формул а изобретен и я Способ диагностики системных заболеваний соединительной ткани путем исследования сыворотки крови, отличающий- с я тем, что с целью повышения точности способа, в сыворотке крови и в моче опре-4 деляют содержание гликозаминогликанов, причем определение в моче проводят после

фильтрования и инкубации 2-2,5 мл мочи с цетилпиридинийхлоридом в течение 25-35 мин, затем рассчитывают соотношение между содержанием гликозаминогликана- ми в сыворотке крови и в моче и при значении полученного показателя 0,07 и выше диагностируют системное заболевание соединительной ткани.