Способ определения тромбогенных свойств сосудистых протезов Советский патент 1985 года по МПК G01N33/48 

Сл

со

со

00

Изобретение относится к медицине в частности хирургии, и может быть использовано при отборе новых материалов длясосудистых иротезов и клапанов сердца.

Протезы из синтетических материалов, аллогенные и аутогетиые сосуды используют для пластики артерий среднего и малого диаметра.

Наиболее частым послеонерационш м осложнением в ранний период является окклюзия просвета тромба, в поздние сроки окклюзия возникает в результате гиперилазии неоинтимыи вторичного тромбообразования. Указанные осложнения связаны с адгезией тромбоцитов на поверхности прс)теза, активацией тромбоцитов с освобохчдением тромбоцитарных факторов и формкрова- нием агрегатов. Поэтому необходимо определение тромбогепных показателей протезов.

Известен способ оценки тромбогенных свойств сосудистых протезов при искусственной перфузии их гепаринизированной кровью Ij .

Согласно этому способу используют две параллельные системы циркуляции (опытную и контрольную), изготовленные из силиконовой резины. В опытную систему встраивают протезы длиной 15 см. Под давлением 90120 мм рт.ст. протез и контрольную систему перфузируют гепаринизированной кровью человека в режиме рецирку ляции в течение 60 мин при 37 С. Поскольку в данном способе используют гепаринизированную кровь, то до перфузии и несколько раз в течение перфузии контролируют кровь на показатели свертывания: фибриноген, гемоглобин, гематокрит, количество тромбоцитов, гепарин, адгезию и агрегацию тромбоцитов. Контрольная система необходима дня оценки влияния поверхности соединительных шлангов на коагуляционные свойства крови в системе циркуляции. Тромбогенные свойства протезов определяют по уменьшению количества тромбоцитов в перфузате через 15, 30 и 60 мин перфузии и качественно оценивают с помощью растровой электронной микроскопии по наличию тромбоцитов (особенно агрегатов) на поверхности протезов.

Недостатком способа является отсутствие количественных крчтс-риев

532932

тромбогенности поверхности сосудистых имплантатов. Кроме того, отсутствие анализа стадий адгезии и агрегации тромбоцитов на поверхности протезов не дает возможности сделать д1И1тельный послеоперационный прогноз .

Цель изобретения - повышение точности способа.

10 Поставленная цель достигается

тем, что перфузируют цитратной плазмой с тромбоцитами одновременно с исследуемыми протезами нативную и деэндотолизированную пупочную вену,

5 а затем с помощью растровой электронной микроскопии подсчитывают общее число тромбоцитов и число тромбоцито в агрегатах на поверхности образцов и определяют тромбо0 генные Т свойства,%:

Т X 100,

Ч г где Т - число тромбоцитов в агре1атах на I мм исследуе5МОго протеза;

Т - число тромбоцитов в агрегатах на I мм нативиой пупочной вены;

Т,, - число тромбоцитов в агре1 2

Qгатах на 1 мм деэндотелизированной пупочной вены.

Для определения адгезивных и тром богенных свойств протезов получапи перфузат, подготавливали для перфузии нативную пупочную вену, получали сегмент дезндотелизированной пупочной вены, собир;гли систему перфузии, включающую все исследуемые протезы и сегменты вен, после перфузии фиксировали образцы и из каждого брали пробы для а 1ализа, количественно оценивали адгезнвность и тромбогенность протезов.

Для приготовления перфузата у донора брали 100 мл крови, смешивали с антикоагулянтом, состоящим из 0,65 М лимонной кислоты, 0,85 М лимоннокислого натрия и 20% декстрозы; соотношение кровь:антикоагулянт 6:1. Кровь центрифугировали при бООд в течение 10 мин. Получали супернатант1, представляющий собой плазму, богатую тромбоцитами. Осадок вторично центрифугировали при 4000д в течение 20 мин. Супернатантом-2 разводили супернатант-1 до конечной

О

концентрации 2x10 тромбоцитов в 1 мл. Полученную плазму с тромбоцитами использовали в качестве перфу3I

гзата. Дня K(.)HTpojiJi иерфуяата и систем ци1)куляин 1 брали 2 мкл исрфучага до и после пеффузии и фиксировали в т(- чение. 2 ч в 8 мл 2,5%-ного гмюrapoBoio альдегида, приготонле ииог-о на pacTi)(jpo Тироде (рН 7,3). Фиксировали тромбоциты и осажд;гли на фильтры нуклеопоры. Тромбоциты исследовали с помощью растровой электронной микроскопии (12).

Подготовка нативной пупочрюй вены для перфузии.

Сразу после родов пугтовину промывают средой 199. В стерильном контейнере доставляют в лабораторию и используют для перфузии в течение 30-60 мин. Сохранность эндотелиального покрова пупочной вены контролировали с помощью растрового электронного микроскопа.

Подготовка деэндотелизированно-; пупочной вены для перфузии.

От нативной пупочной вены отсекают сегмент длиной 5 см. Внутрисосудистым балонным катетером Фогарти диаметром 6 мм, раздутым под давлением 400 мм рт.ст., деэндотелилировали пупочную вену. Полноту удаления эндотелия контролируют с помощью растровой электронной мик)оскопии.

Пример I. Сегменты протезов биоимплантант, изготовленный в 1нсти туте сердечно-сосудистой хирургии им. Баку., а также сегменты нативной и деэндотелизированной пупочной вены каждый длиной 5 см и диаметром 6 мм последовательно соединяют через канюли в за-мкнутую цепь и о,цновременно перфузируют в режиме рециркуляции плазмой человека при гидростатическом давлении 60 мм рт.ст. скорости тока 20 мл/МИР, температуре в течение 30 мин. Цля соединительных шлангов ncrionb3OBajni силиконовую резину с внутренним диаметром 5 мм. Объем перфузата составляет 30 Ntn.

После перфузии протезы и сегменты вен промывают 200 мл среды 199 и фиКсируют 2,5%-ным глютаровым альдегидом, приготовленным на растворе Тироде, в тече.ние 16 ч при давлении 60 мм рт.ст. Затем протезы омывают от фиксатора в течение 20 мин проточной водой, дегидратируют в раствоpax этапола возрастающей концентрации (40, 60, 80, 90, 96, 100%) и ацетоне по 15 мин при 37 С, сушат при

32934

критическгж точке, вскрывают вдоль, напьшяют жмиггом слоем 30 нм.

Ад1е:-)ириванные тромбоциты подсчитывают с помощью сканирующего элек5 rpoHHOio микроскопа OS М-35 в 50- 200 рандомически выбраннь х полях зрения площадью 450 мкм 2 при увеличении в 4000 раз.

Адгезивность протезов (А) вы-t 0 числяют по формуле,%: , - N. ,00А - N - N где Nj - общее число тромбоцитов.

на 1 мм исследуемого про- 5теза;

N - число тромбоцитов на 1 мм

нативной пупочной вены; Ы., - число тромбоцитов на 1 мм

деэндотелизированной пуQпочной вены.

Тромбогенность протезов (Т) вычисляют по формуле,%:

Т 1 X 100.

i 3 - iz

5 где Т - число тромбоцитов в агрегатах на 1 мм исследуемого протеза;

Tj - число тромбоцитов в агрегатах на 1 мм нативной пупочной нены;

Т., - число тромбоцитов и агрегатах на 1 мм деэндотелизированной пупочной вены. Для дополнительной характеристики адгезивных свойств протезов определяют в процентах количество одиночных тромбоцитов, имеющих форму сферы (первичная стадия контакт.ной активации) и количество распластанных тромбоцитов (вторичная стадия

онтактной активации).

Дополнительным критерием агрегации служило процентное содержание агрегатов по 2-5, 6-15 и более 15 45 тромбоцитов.

Б процессе перфузии происходила незначительная активация тромбоцитов в перфузате. Об этом свидетельствует снш::гние процентного содержания дискоидных форм с 54 (до перфузии) до 42% (после перфузии) и увеличение сфер с псевдоподиями с 18 до 30%; количество сфер и дисков с лсевдоподиями не менялось. Число тромбоцитов в перфузате уменьшалось с 2,0 до 1,8 X 10 мл.

S1153293

Количественные характенистики адгезивностн итромбогенности протезов и

нативнон идпэндотелизнрованной пупочной вены представлены в таблице.

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТРОМБОГЕННЫХ СВОЙСТВ СОСУДИСтаХ ПРОТЕЗОВ J путем перфузии исследуемого протеза биологической жидкостью, содержащей тромбоциты, отличающийся тем, что, с целью повышени точности. способа,одновременно с исследуемым протезом перфузируют нативный и деэндотелизированный сосуды плазмой с заданным количеством тромбоцитов, затем подсчитывают число тромбоцитов г в агрегатах на поверхности сосудов и определяют тромбогенные Т свойства, %: Т - Т; X 100, Т Т, - т, где Т, - число тромбоцитов в агрегатах на 1 мм исследуемого протеза; 1„- число тромбоцитов в агрегатах на 1 мм нативного сосуда; число тромбоцитов в агрега(Л тах на I мм деэндотелизированного сосуда.

Приведенные данные свидетельствуют, что биоимплантат по адсезивнести и тромбогенности блнзок к натипной пуночной вене. Тем не менее на биоимплантате происходит увеличение популяции первично активированных тромбоцитов и появляются агрегаты средних размеров из 6-15 тробоцитов, которые отсутствуют на нативной пупочной вене.

Использование предлагаемого способа позволяет проводить количественную оценку адгезивных и тромбогенных свойств искусственных протезов по более чувствительным критериям, чем те, которые использовались ранее. Разделььгый анализ адгезнвности и тромбо1 енности позволяет делать прогноз с ранних и поздних послеоперационных осложнениях. Предложенный подход может быть использован для сравнительного отбора протезов в качестве трансплантатов, а

.также для анализа зффекта препаратов предупреждающих адгезию и агрегацию

тромбоцитов на поверхностях.