Способ дезинтеграции микроорганизмов Советский патент 1986 года по МПК C12M1/00 B02C17/16 

Изобретение относится к биотехнике и может быть использовано в микробиологической промьшшенности, в областях народного хозяйства, использующих методы биотехнологии, а также для тонкого и сверхтонкого измельчения материалов.

Целью изобретения является повы- шение степени дезинтеграции и качества дезинтеграта.

Цель достигается путем создания высоких напряжений сдвига и сжатия при дезинтеграции клеток мелющими телами.

Согласно способу дезинтеграции микроорганизмов емкость заполняют мелющими телами, взятыми в количестве от 50 до 85% от объема емкости дезинтегратора, затем суспензией микроорганизмов сообщают им движение и перемешивание, непосредственно после сообщения мелющим телам движения увеличивают соотношение между насыпным объемом мелющих тел и объемом емкости до значений от 85 до 100%,

Изменение соотношения между объемом мелющих тел и объемом емкости осуществляют изменением объема емкости, добавлением мелющих тел, изменением центробежных сил, подвергая емкость и мелкицие тела колебаниям и так далее.

Изменение соотношения между насыпным объемом мелющих тел и объемом емкости дезинтегратора в сторону увеличения от меньшего к большему вызывает уплотнение мелющих тел - увеличение насыпного количества мелющих тел, приходящееся на единицу объема камеры или рабочей зоны емкости, где находятся мелющие тела при дезинтеграции.

Перемешивание и взаимодействие мелющих тел при достижении между насыпным их объемом и объемом емкости 100Z и более, особенно при использовании полимерных мелющих тел, достигается за счет сжатия мелющих тел (шариков) в пределах упругой деформации. Сжатрге на незначительную величину каждого шарика вызвано движение мешалки и прилегающих к ней слоев шариков, которые, вклийиваясь между соседними шариками, деформируют их, передавая деформацию всем остальным шарикам, увлекают их за собой. При движении смещаются слои шариков

относительно один другого. Например, при длине камеры 200 мм, диаметре шариков 0,2 мм, деформации каждого шарика на 0,25% (0,0005 мм) получают количество шариков в зоне линии, проведенной вдоль камеры 200:0,2 1000, деформация более ЮООх хО,,5, что более диаметров двух шариков. Таким образом, при незначительной деформации каждого шарика на доли микрона возможно перемещение шариков относительно один другого в зоне их перемешивания. Способ осуществляется в емкости

объемом 0,3 л баллистического дезинтегратора МЛ-1 или в любом дезинтеграторе с (ЕМКОСТЬЮ в виде тела вращения следующим образом.

Пример 1. В емкость дезинтегратора, свободно заполненную мелющими телами в сухом состоянии (50% от объема емкости), заливают суспензию микроорганизмов Saccharomyces serevisiae. Объем

дезинтегрируемой суспензии 200 мл. Включают дезинтегратор, сообщают мелющим телам движение и перемелива- ют суспензий микроорганизмов, устанавливают частоту вращения вала 100 об/мин и через, штуцер для загрузки мелющих тел непосредственно после сообщения мелющим телам движения досыпают в емкость мелющие тела вручную или автоматически, следя по амперметру за началом увеличения тока питания дезинтегратора, после чего досыпку тел прекращают. Увеличение тока показывает, что мелющие тела уплотнились и выбрали свободное пространство в емкости, т.е. увеличилось соотношение между насыпным объемом мелющих тел и объемом емкости от 50 до 100%.

Переключают частоту вращения вала дезинтегратора на 3000 об/мин и одновременно включают секундомер и насос подачи суспензии в режим циркуляции.

Производительность насоса 500 мл/мин. Через 1,5 мин дезинтегратор выключают. Дезинтеграт сливают через выходной штуцер камеры или после расстыковки емкости с приводом. Микроскопированием определяют зф- фективность дез нтеграции, а также

выход белка при дезинтеграции по Лоури. Эффективность дезинтеграции (степень дезинтеграции) 91 ±5%, выход белка 4,22 мг/мл. Активность тест

фермента НАДН-оксидазы 16,2 мЕ/мг белка.

Пример 2. Дезинтеграцию производят в дезинтеграторе с переменным объемом емкости. Заполняют емкость мелющими телами до 85% объем емкости. Изменение объема достигают введением в камеру через дополнительное отверстие в ней твердого вытеснителя. Заливают в дезинтегратор 10%-ную суспензию микроорганизмов Saccharomyces cerevisiae. Объем суспензии 200 мл.

Включают дезинтегратор и устанавливают частоту вращения вала 100 об/ /мин и начинают уменьшать объем камеры дезинтегратора, следя по амперметру за началом увеличения тока питания дезинтегратора, после чего уменьшение объема камеры прекращают. Начальный объем 0,3 л, конечный 0,255 л, соотношение между насыпным объемом мелющих тел и объемом емкости 100%.

Увеличение тока показывает, что мелющие тела уплотнились и выбрали свободное пространство в емкости дезинтегратора, т.е. увеличился насыпной объем мелкнцих тел по отношени к объему камеры. Переключают частоту вращения вала дезинтегратора на 3000 об/мин и одновременно включают секундомер и насос подачи суспензии микроорганизмов в режиме циркуляции. Производительность насоса 500 мл/мин.

Через 1,5 мин дезинтегратор выключают. Дезинтеграт сливают через выходной штуцер дезинтегратора или при расстыковке емкости с приводом. Зате выключают насос.

Эффективность дезинтеграции определяют микроскопированием; выход белка, определяют методом по Лоури. Эффективность дезинтеграции (степень дезинтеграции) составляет , выход белка 5,26 мг/мл. Активность

тест-фермента НАДН-оксидазы

10.7мЕ/мг белка. Пример 3. Все операции в

данном примере выполняют, как в примере 1, но дезинтегрируют суспензию клеток Eschericha coli штамм К10 .концентрацией 4,6 г/100 мл.

Эффективность дезинтеграции 90±5%, выход белка 4,0 мг/мл. Активность тест-фермента НАДН-оксидазы

26.8мЕ/мг белка.

Во всех примерах используют мелющие тела: шарики 0,25-0,4 мм из

22123 84

стирола с дивинилбензолом. Внутренний диаметр емкости 70 мм.

Пример 4. При дезинтеграции такой же суспензии Escherichia coli,

5 как и в примере 3, в емкости объемом 0,04 л с выполнением операций, как в примере 1, было получено: эффективность дезинтеграции 85(5%, выход белка 3,78 мг/мл. Активность тест10 фермента НАДН-оксидазы 22,5 мЕ/мг белка.

Для сравнения результатов в примерах 3 и 4 проводилась дезинтеграция . в емкости дезинтегратора ФУТ-1 с

15 такими же мелющими телами и суспензией микроорганизмов в течение 20 мин. Эффективность дезинтеграции низкая (от 9 до 5%), в связи с чем выход белка не измерялся.

20 Для дезинтеграции бактерий дезинтеграторы с полимерными мелющими телами не используются из-за низкой эффективности дезинтеграции.

Способ позволяет дезинтегрировать

25 бактерии полимерными шариками, что улучшает качество дезинтеграторов и удешевляет процесс дезинтеграции, так как стоимость полимерных шариков в десятки раз ниже, чем стек30 лянных.

Пример 5. Дезинтеграцию проводят, как в примере 2. Заливают в камеру 10%-ную суспензию клеток Endomyces magirusice, объем суспензии 100 мл, уменьшая при этом насьт- ной объем мелющих тел в пределах от 100 до 60% от объема камеры. Производительность и эффективность дезинтеграции при этом не снижается, так как оболочки этих клеток менее прочны, чем клеток приведенных в примерах 1-4, а качество субклеточных структур - митохондрий, возростает.

Одним из показателей качества является получение интактных субклеточных структур, например митохондрий, определяемое величиной дыхательного контроля.

Дыхательный контроль митохондрий составляет 2,8, что выше дыхательного контроля митохондрий, полученного по способу-прототипу 1j9.

Производительность предлагаемого способа в 2 раза выше при более высоких (на 11%) эффективности дез55 интеграции и выходе белка (на 31,5%), повьш1ается качество продуктов дезинтеграции, возможна дезинтеграция бактерий полимерными шариками.

35

40

45

SO

S

От воэдействия сил сдвига и смятия клетки, попадающие между мелющими телами дезинтегрируются.

В процессе дезинтеграции вовлекаются все мелющие тела. После заполнения емкости дезинтегратора суспензией микроорганизмов и мелклцими телами, взятыми в количестве от 50 до 85% объема емкости, изменением насыпного объема мелющих тел при дезинтеграции управляют производительностью дезинтеграции за счет изменения сил сдвига и смятия.

За счет увеличения соотношения между насыпным объемом (уплотнения) мелющтос тел и объемом емкЬсти. до

Составитель А. Горбачева Редактор М. Недолуженко Техред О.Гортвай Корректор В. Синицкая

Заказ 1553/34

Тираж 490

ВНИИПИ Государственного комитета СССР

по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ПШ1 Патент, г. Ужгорол, ул. Проектная, 4

212386

85 ж 100% непосредственно после сообщения мелющим телам движения создают высокие напряжения сдвига и смятия, чтобы перевести дезинтег- 5 рацию из высокоскоростного процесса в низкоскоростной, а это, в свою очередь, снижает мощность, расход . энергии, уменьшает тепловыделение и упрощает термостабштизацию, сни- О жает затраты на изготовление и обслу- живание дезинтеграторов, упро щает их конструкцию, повышает надежность.

15

Использование способа повьппает производительность и качество дезинтеграции.

Подписное