СПОСОБ ОЗОН/NO-УЛЬТРАЗВУКОВОЙ ДЕЗИНТЕГРАЦИИ СУСПЕНЗИЙ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК И ИХ АГРЕГАТОВ Российский патент 2011 года по МПК C12N5/09 C12N13/00 

Изобретение относится к медицине и биотехнологии, а именно к способам и средствам дезинтеграции опухолевых клеток и их агрегатов, а также микроорганизмов, и может быть использовано в лечении онкологических заболеваний.

Уровень здравоохранения страны в немалой степени определяется инновациями в области биотехнологии и фармакологии, касающихся обоснования применения, разработки, производства и внедрения новых эффективных и биосовместимых лекарственных средств в клиническую практику, в том числе в клиническую онкологию, где смертность от рака занимает 2-е место после смертности от сердечно-сосудистых заболеваний и не имеет тенденции к снижению. Исследования в области создания новых лекарственных препаратов дают основание развитию направлений био- и медицинских технологий, использующих разные виды энергии. Известно, что энергия, дополнительно вводимая в биообъекты (бактериальные клетки, клетки грибов и пр.), являющихся открытыми термодинамическими системами, может существенно влиять на жизненно важные составляющие клетки: внешние органеллы, оболочки клеточной мембраны, внутреннее содержимое клетки, включая ДНК, РНК и пр., а следовательно, и на кинетику термодинамических, физико-химических и биохимических процессов, влияющих на жизнедеятельность клеток, стимулируя их или угнетая вплоть до гибели.

Разрушение суспензий клеток и клеточных систем с применением физических (электрическое и тепловое поле, криотемпературы, ультразвук, электрогидравлика и пр.), химических (сжиженные газы, органические растворители, ПАВ и пр.) и биохимических (литические ферменты, автолиз, вода и пр.) воздействий есть основная задача дезинтеграции, состоящей в извлечении из клетки функционально активных целевых субклеточных структур и биополимеров. Полученный дезинтеграт является исходным продуктом, используемым в дальнейшем в биотехнологических и фармакологических процессах для получения высокоактивных лекарственных веществ.

Среди физических факторов, наиболее часто применяемых в биотехнологиях для дезинтеграции суспензий микроорганизмов и клеток с целью извлечения биологически активных веществ (антигены, ферменты, белки и пр.), значительное место занимает энергия низкочастотного ультразвука.

Известны способы дезинтеграции суспензий микроорганизмов путем ультразвуковой дезинтеграции клеток с использованием в дезинтеграционном процессе специальных веществ (добавок): сонопротекторов, поглотителей свободных радикалов, лизирующих ферментов, антиоксидантов, инертных газов [1].

Однако данные способы не предназначены для дезинтеграции суспензий опухолевых клеток и их агрегатов и не обеспечивают достижения максимально возможной их дезинтеграции из-за наличия низкой степени разрушения ими межклеточных взаимодействий в многоклеточных агрегатах, присутствующих в суспензиях опухолевых клеток.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату является способ ультразвуковой дезинтеграции суспензий микроорганизмов [2], заключающийся в заполнении рабочей камеры суспензией клеток, озвучивании суспензии низкочастотным ультразвуком, отводе дезинтеграта озвученной суспензии.

Однако недостатком данного способа является то, что он не предназначен для дезинтеграции опухолевых клеток и их агрегатов и не обеспечивает введения высокоактивных химических групп веществ, например озон/NO-содержащей газовой смеси. При этом не обеспечивается достижение максимально возможной дезинтеграции опухолевых клеток из-за низкой степени разрушения межклеточных взаимодействий в многоклеточных их агрегатах, присутствующих в суспензиях опухолевых клеток вследствие малоамплитудного воздействия на озвучиваемую суспензию низкочастотным ультразвуковым коаксиальным излучателем, расположенным с внешней стороны рабочей камеры (амплитуда колебаний излучающих стенок рабочей камеры не превышает 5-10 мкм). Указанное делает невозможным достижение выраженной дезинтеграции опухолевых клеток и их многоклеточных агрегатов и, как следствие, не обеспечивает интенсификацию процесса дезинтеграции суспензий опухолевых клеток и их агрегатов для максимально возможного извлечения биологически активных веществ и субстратов (антигены, ферменты, белки и пр.).

Цель изобретения - интенсификация дезинтеграции суспензий опухолевых клеток и их агрегатов для максимально возможного извлечения биологически активных веществ и субстратов.

Задача изобретения достигается тем, что в способе озон/NO-ультразвуковой дезинтеграции суспензий опухолевых клеток и их агрегатов, заключающемся в заполнении рабочей камеры суспензией опухолевых клеток и их агрегатов, озвучивании суспензии низкочастотным ультразвуком, отводе дезинтеграта озвученной суспензии из рабочей камеры, осуществляют комплексную обработку суспензии опухолевых клеток и их агрегатов высокоамплитудным низкочастотным ультразвуком и озон/NO-содержащей газовой смесью, вводимыми непосредственно в объем озвучиваемой и барботируемой суспензии, а также озон/NO-содержащим раствором, образующимся при барботировании суспензии озон/NO-содержащей газовой смесью при следующих параметрах и режимах обработки:

- частота ультразвуковых колебаний - 26,5 кГц;

- амплитуда ультразвуковых колебаний излучающего торца волновода-инструмента при дезинтеграции опухолевых клеток и их агрегатов с применением высокоамплитудного ультразвука - 80-120 мкм;

- экспозиция барботирования суспензии озон/NO-содержащей газовой смесью, а также ее обработка озон/NO-содержащим раствором, образующимся при барботировании суспензии озон/NO-содержащей газовой смесью, при высокоамплитудной ультразвуковой обработке опухолевых клеток и их агрегатов - 1-5 сек/см³ объема суспензии;

- концентрация озона в озон/NO-содержащей газовой смеси - 3,5-25 мг/л.

Проведенный анализ показывает, что при использовании известных способов и средств дезинтеграции суспензий микроорганизмов и клеток, в том числе опухолевых клеток и их агрегатов, невозможно обеспечить интенсификацию процесса разрушения опухолевых клеток и их агрегатов с максимально возможным извлечением биологически активных веществ (антигены, ферменты, белки и пр.), коррелирующим со степенью дезинтеграции клеточного материала.

Способ основан на комплексном воздействии на суспензию опухолевых клеток и их агрегатов высокоамплитудным низкочастотным ультразвуком, озон/NO-содержащей газовой смесью, а также озон/NO-содержащим раствором, образующимся при барботировании суспензии озон/NO-содержащей газовой смесью, выступающими в качестве высокоэффективных дезинтегрирующих факторов. В комплексе и по отдельности низкочастотный ультразвук, озон и оксид азота (II) являются высокоактивными дезинтеграторами.

Высокоамплитудный низкочастотный ультразвук в процессе дезинтеграции обеспечивает:

- нарушение межклеточных взаимодействий между клетками в многоклеточных агрегатах, присутствующих в суспензиях опухолевых клеток, т.е. усиливает диспергацию многоклеточных агрегатов на отдельные клетки, по всей поверхности взаимодействующих с высокоамплитудным ультразвуком, озон/NO-содержащей газовой смесью, а также с окружающим их озон/NO-содержащим раствором, образованным при барботировании суспензии озон/NO-содержащей газовой смесью;

- кавитационное разрушение мембран клеток, вапоризацию мембран;

- интенсифицикацию гидродинамических процессов в макро- и микроокружении опухолевых клеток и их агрегатов, а также их проявление во внутриклеточном объеме;

- усиление диффузионных и реологических процессов в мембранах клеток;

- проявление тепловых микромасштабных эффектов при нахождении клетки в резко неоднородных полях температур и скоростей (холодовой удар клеток) и пр.

Озон/NO-содержащая газовая смесь и озон/NO-содержащий раствор, образованный при барботировании суспензии опухолевых клеток и их агрегатов озон/NO-содержащей газовой смесью, в процессе дезинтеграции обеспечивают:

- озониндуцированное взаимодействие с компонентами поверхности мембраны, приводящее к нарушению межклеточных взаимодействий между клетками в многоклеточных агрегатах, присутствующих в суспензиях опухолевых клеток, т.е. к усилению процесса диспергации агрегатов опухолевых клеток на отдельные клетки, по всей поверхности взаимодействующих с высокоамплитудным ультразвуком, озон/NO-содержащей газовой смесью и образованным озон/NO-содержащим раствором;

- окисление липидов мембран клетки по механизму озонолиза двойных связей C=C, приводящего к усилению проницаемости мембран, их вапоризации, а также разрушению внутриклеточных органелл;

- снижение плотности мембран клетки и вязкости цитоплазменной воды клетки, минимизирующих гидродинамические сдвиговые напряжения, требуемые для разрушения клетки под действием высоких градиентов скоростей, инициируемых в поле высокоамплитудного ультразвука и пр.

Кроме того, при комплексном воздействии на суспензию опухолевых клеток высокоамплитудным низкочастотным ультразвуком, озон/NO-содержащей газовой смесью и образованным озон/NO-содержащим раствором проявляется их синергизм в достижении полной дезинтеграции опухолевых клеток при незначительной экспозиции воздействия вышеуказанными дезинтегрирующими факторами (В.В.Педдер, М.В.Набока, О.Г.Григорук, 2009), что послужило основой предложенного технического решения.

Сущность изобретения поясняется чертежами, где изображены:

на Фиг.1 - схема реализации способа озон/NO-ультразвуковой дезинтеграции опухолевых клеток и их агрегатов;

на Фиг.2 - фотография цитограммы опухолевых клеток из суспензии опухолевых клеток и их агрегатов, подвергшейся воздействию высокоамплитудного низкочастотного ультразвука при оптимальной экспозиции озвучивания - 1-1,5 сек/см³ для исследуемого объема суспензии - 20 мл (исследование in vitro);

на Фиг.3 - фотография цитограммы опухолевых клеток из суспензии опухолевых клеток и их агрегатов, подвергшейся воздействию озон/NO-содержащей газовой смеси и образованного озон/NO-содержащего раствора при оптимальной экспозиции барботирования суспензии озон/NO-содержащей газовой смесью - 1-1,5 сек/см³ для исследуемого объема суспензии - 20 мл (исследование in vitro);

на Фиг.4 - фотография цитограммы опухолевых клеток из суспензии опухолевых клеток и их агрегатов, подвергшейся комплексному воздействию высокоамплитудного низкочастотного ультразвука, озон/NO-содержащей газовой смеси и образованного озон/NO-содержащего раствора при оптимальной экспозиции воздействия - 1-1,5 сек/см³ для исследуемого объема суспензии - 20 мл (исследование in vitro);

на Фиг.5 - фотография цитограммы опухолевых клеток из контрольной суспензии опухолевых клеток и их агрегатов в отсутствие озон/NO-ультразвукового воздействия на суспензию объемом - 20 мл (исследование in vitro);

на Фиг.6 - сравнительная гистограмма, иллюстрирующая степень дезинтеграции суспензии опухолевых клеток и их агрегатов, подвергшейся комплексному воздействию высокоамплитудного низкочастотного ультразвука, озон/NO-содержащей газовой смеси (концентрация озона - 3,5-4 мг/л) и образованным озон/NO-coдержащим раствором при оптимальной экспозиции воздействия - 1-1,5 сек/см³ для исследуемого объема суспензии - 20 мл как по отдельности, так и сочетанно с достижением, в последнем случае, синергического эффекта в дезинтеграции опухолевых клеток (исследование in vitro).

Для реализации предлагаемого способа озон/NO-ультразвуковой дезинтеграции суспензии опухолевых клеток и их агрегатов применяют аппаратный комплекс «Онкодест-Л» (не показан), включающий: генератор ультразвуковой низкочастотный 1 (например, ультразвуковой аппарат «Кавитон», г. Омск) с присоединенным к нему низкочастотным ультразвуковым излучателем 2, состоящим из акустического узла 3, сопряженным с волноводом-инструментом 4 с развитым излучающим торцом; генератор озон/NO-содержащей газовой смеси 5 (например, аппарат для газовой озонотерапии «Озотрон», г. Омск); рабочую камеру 6, герметизирующую крышку 7, ограничитель пенообразования 8. Герметизирующая крышка 7 снабжена тремя отверстиями, позволяющими проведение через нее волновода-инструмента 4, подающего озон/NO-содержащую газовую смесь, полимерного патрубка 9, соединяющего генератор озон/NO-содержащей газовой смеси 5 с полостью рабочей камеры 6, заполненной исходной суспензией опухолевых клеток и их агрегатов 10, а также отводящего полимерного патрубка 11, соединяющего полость рабочей камеры 6 с дезактиватором избыточного озона 12. У основания рабочей камеры 6 установлен выпускной кран 13 для сбора, образованного из суспензии опухолевых клеток и их агрегатов 10, дезинтеграта.

При этом генератор ультразвуковой низкочастотный 1 генерирует колебания низкочастотного диапазона - 26,5 кГц и обеспечивает получение амплитуды колебаний излучающего торца волновода-инструмента 4 - от 0 до 120 мкм. Генератор озон/NO-содержащей газовой смеси 5 генерирует из атмосферного воздуха озон/NO-содержащую газовую смесь с концентрацией озона - до 5 мг/л, а при подключении его к концентратору кислорода - не менее 25 мг/л.

Предлагаемый способ озон/NO-ультразвуковой дезинтеграции опухолевых клеток и их агрегатов осуществляют следующим образом.

Полость рабочей камеры 6 на 1/2 объема заполняют суспензией опухолевых клеток и их агрегатов 10, которую необходимо дезинтегрировать. Герметизирующую крышку 7, на которой закреплены акустический узел 3, сопряженный с волноводом-инструментом 4, подающий озон/NO-содержащую газовую смесь полимерный патрубок 9 и отводящий полимерный патрубок 11 с присоединенным дезактиватором избыточного озона 12, устанавливают и закрепляют на рабочей камере 6. После этого одновременно включают аппарат ультразвуковой «Кавитон» 1 и генератор озон/NO-содержащей газовой смеси - аппарат «Озотрон» 5. Реализуется процесс озон/NO-ультразвуковой дезинтеграции суспензии опухолевых клеток и их агрегатов. По истечении заданной экспозиции процесса дезинтеграции одновременно выключают аппарат ультразвуковой «Кавитон» 1 и генератор озон/NO-содержащей газовой смеси - аппарат «Озотрон» 5. Открывают выпускной кран 13 и отводят образованный из суспензии опухолевых клеток и их агрегатов 10 дезинтеграт из полости рабочей камеры 6. Далее полученный дезинтеграт как исходное сырье направляют на следующий этап биотехнологического процесса для получения фракционированных и очищенных субстратов с целью извлечения из них в дальнейшем биологически активных веществ, представляющих интерес для фармацевтической промышленности.

Пример. Интенсификация процесса дезинтеграции суспензий опухолевых клеток и их агрегатов необходима как фактор, позволяющий получить дезинтеграт в качестве субстрата для извлечения в дальнейшем биологически активных веществ, могущих выступать в качестве перспективных лекарственных веществ, обладающих свойствами стимуляции специфического противоопухолевого иммунитета in vivo. Кроме того, дезинтеграт может выступать в качестве субстрата для создания («воспитания») клонов эффекторных клеток специфического противоопухолевого иммунитета (Т-лимфоциты, макрофаги) и иммунокомпетентных клеток (лимфоцитов, макрофагов), инкубируемых in vitro для стимулирования в последующем специфических антигенных свойств.

Получение суспензии опухолевых клеток и их агрегатов в клинических условиях производили забором асцитической жидкости, содержащей опухолевые клетки, в количестве не менее 200 мл путем процедуры лапароцентеза у пациента с установленным диагнозом злокачественного образования - цистаденокарцинома яичника. Параллельно производили стандартные цитологические исследования путем микроскопии седимента асцитической жидкости. Суспензию гомогенизировали, стряхивали и распределяли по рабочим камерам объемом 20 мл.

Суспензию опухолевых клеток и их агрегатов подвергали обработке озон/NO-содержащей газовой смесью с концентрацией озона 3,5-4 мг/л в сочетании с воздействием низкочастотным ультразвуком путем погружения в камеру волновода-инструмента, колеблющегося с амплитудой порядка 80-100 мкм и частотой колебаний 26,5 кГц в течение 60 секунд (3 сек/см³). Конечной целью этой обработки являлось получение дезинтеграта суспензии опухолевых клеток и их агрегатов как субстрата для извлечения биологически активных веществ, могущих выступать в качестве перспективных лекарственных веществ, обладающих свойствами стимуляции специфического противоопухолевого иммунитета in vivo, а также инкубации клонов эффекторных клеток специфического противоопухолевого иммунитета in vitro.

Для контроля проводилось исследование двух контрольных серий суспензий (по 3 образца), распределенных в рабочих камерах объемом 20 мл. Первая контрольная серия суспензий обрабатывалась только низкочастотным ультразвуком путем погружения в камеру волновода-инструмента, колеблющегося с амплитудой порядка 80-100 мкм и частотой колебаний 26,5 кГц в течение 60 секунд (3 сек/см³). Вторая контрольная группа суспензий подвергались обработке барботированием озон/NO-содержащей газовой смесью с концентрацией озона 3,5-4 мг/л в течение 60 секунд (3 сек/см³).

Для оценки результатов воздействия по отдельности низкочастотного ультразвука и озон/NO-содержащей газовой смеси, а также при их сочетанном воздействии на суспензию опухолевых клеток и их агрегатов готовили препараты на цитоспин-центрифуге, предварительно гомогенизируя жидкости на встряхивателе, обеспечивая монослой клеток с высокой концентрацией на контрольной площадке в 6 мм². Полученный дезинтеграт окрашивали по стандартной методике Май-Грюнвальда. Окрашенные препараты оценивали при помощи световой микроскопии с увеличением ×100 с иммерсией. Оценивались клеточный состав полученного дезинтеграта, фон, количество опухолевых клеток в поле зрения, наличие морфологических комплексов опухолевых клеток (агрегатов), а также раздельно расположенных клеток. Подсчет клеточного состава дезинтеграта производился в 5 различных полях зрения с учетом среднего показателя.

Сравнительный анализ полученных результатов приведен на Фиг.2-6.

На Фиг.2 приведена цитограмма дезинтеграта суспензии опухолевых клеток и их агрегатов, подвергшейся воздействию только высокоамплитудного низкочастотного ультразвука. Как видно из цитограммы, в поле зрения обнаруживаются отдельные неповрежденные комплексы опухолевых клеток. Указанное свидетельствует о недостаточно полном дезинтегрирующем эффекте низкочастотного ультразвука как в отношении отдельных опухолевых клеток, так и их агрегатов. В поле зрения микроскопа обнаруживаются неповрежденные морфологические комплексы опухолевых клеток (агрегаты).

На Фиг.3 приведена цитограмма дезинтеграта суспензии опухолевых клеток и их агрегатов, подвергшейся только воздействию озон/NO-содержащей газовой смеси и образованного озон/NO-содержащего раствора. Как видно из цитограммы, при воздействии на суспензию опухолевых клеток и их агрегаты только озон/NO-содержащей газовой смесью также имеет место недостаточно полное дезинтегрирующее действие, как и при ультразвуковом воздействии на суспензию.

На Фиг.4 приведена цитограмма дезинтеграта суспензии опухолевых клеток и их агрегатов, подвергшейся комплексному воздействию низкочастотным ультразвуком и озон/NO-содержащей газовой смесью. Обнаружен выраженный дезинтегрирующий эффект, носящий синергический характер (Фиг.6). Имеет место массовое разрушение как отдельных опухолевых клеток, так и их морфологических комплексов (агрегатов). В поле зрения микроскопа обнаруживаются разрушенные опухолевые клетки, фрагменты разрушенных нетипируемых клеток, а также обилие бесструктурных белковых масс, палочковидных свернутых белковых фрагментов.

На Фиг.5 приведена цитограмма суспензии опухолевых клеток и их агрегатов в отсутствие озон/NO-ультразвукового воздействия на суспензию (основной контроль).

На Фиг.6 изображена сравнительная гистограмма, иллюстрирующая степень выраженности дезинтеграции суспензии опухолевых клеток и их агрегатов, подвергшейся комплексному воздействию высокоамплитудного низкочастотного ультразвука, озон/NO-содержащей газовой смеси и образованным озон/NO-содержащим раствором как по отдельности, так и сочетанно с достижением, в последнем случае, синергического эффекта в дезинтеграции опухолевых клеток и их агрегатов.

Предлагаемый способ позволяет повысить эффективность процесса дезинтеграции суспензии опухолевых клеток и их агрегатов для максимально возможного извлечения из них биологически активных веществ путем комплексного воздействия на суспензию опухолевых клеток и их агрегатов высокоамплитудным низкочастотным ультразвуком, озон/NO-содержащей газовой смесью и образованным при барботировании суспензии озон/NO-содержащей газовой смесью озон/NO-содержащим раствором.

Источники информации

1. Фихте Б.А., Гуревич Г.А. Дезинтеграторы клеток. - М.: Наука, 1988. - С.99-103.

2. Авторское свидетельство СССР 745946, МПК В01F 11/02, С12K 1/00, 1980.

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способу озон/NО-ультразвуковой дезинтеграции суспензий опухолевых клеток и их агрегатов. Способ предусматривает заполнение рабочей камеры суспензией опухолевых клеток и их агрегатов. После чего осуществляют комплексную обработку суспензии опухолевых клеток и их агрегатов высокоамплитудным низкочастотным ультразвуком и озон/NО-содержащей газовой смесью, вводимой непосредственно в объем озвучиваемой и барботируемой суспензии, а также озон/NО-содержащим раствором, образующимся при барботировании суспензии озон/NО-содержащей газовой смесью. Предложенное изобретение позволяет повысить эффективность процесса дезинтеграции суспензии опухолевых клеток и их агрегатов для максимально возможного извлечения из них биологически активных веществ. 6 ил.

Способ озон/NО-ультразвуковой дезинтеграции суспензий опухолевых клеток и их агрегатов, заключающийся в заполнении рабочей камеры суспензией опухолевых клеток и их агрегатов, озвучивании суспензии низкочастотным ультразвуком, отводе дезинтеграта озвученной суспензии из рабочей камеры озвучивания, отличающийся тем, что осуществляют комплексную обработку суспензии опухолевых клеток и их агрегатов высокоамплитудным низкочастотным ультразвуком и озон/NО-содержащей газовой смесью, вводимой непосредственно в объем озвучиваемой и барботируемой суспензии, а также озон/NО-содержащим раствором, образующимся при барботировании суспензии озон/NО-содержащей газовой смесью, при следующих параметрах и режимах обработки:
частота ультразвуковых колебаний 26,5 кГц;
амплитуда ультразвуковых колебаний излучающего торца волновода-инструмента при дезинтеграции опухолевых клеток и их агрегатов с применением высокоамплитудного ультразвука 80-120 мкм;
экспозиция барботирования суспензии озон/NО-содержащей газовой смесью, а также ее обработка озон/NО-содержащим раствором, образующимся при барботировании суспензии озон/NО-содержащей газовой смесью, при одновременной высокоамплитудной ультразвуковой обработке опухолевых клеток и их агрегатов 1-5 с/см³ объема суспензии;
концентрация озона в озон/NO-содержащей газовой смеси 3,5-25 мг/л.