Способ выделения нативных фракций из одноклеточных микроорганизмов Советский патент 1987 года по МПК C12N1/06 

112

Изобретение относится к микробиологической промьппленности, в частности к способам выделения нативных фракций из одноклеточных микроорганизмов методом механической дезинтег- рации с целью изоляции отдельных фракций или их смесей, и может быть использовано при приготовлении концентратов пищевого протеина

Известен способ выделения нативных фракций из одноклеточных микроорганизмов путем баллистической дезинтеграции (авт.св. № 810808,С 12 М 1/00 1978).

При применении баллистических дезинтеграторов можно в промышленном масштабе при непрерывной технологии достичь любой необходимой степени разрушения клеток при соответствующем продолжении времени переработки материала.

Недостатками этого способа являются локальный перегрев обрабатывае

мого вещества, что приводит к необхо- г инактивации внутриклеточных энзимов

димости- интенсивного охлаждения; повторное разрушение уже полученны клеточных фрагментов с образованием чрезвычайно мелких частиц (от единиц до сотых долей микрона), что значительно усложняет дальнейшее разделение твердой и жидкой фаз. Все это вместе взя-тое, т.е. увеличение расхода воды для охлаждения, электроэнергии, более длительное время обработки биомассы, удорожает процесс дезинтеграции и повышает конечную стоимость продукта. I .

Наиболе близким по технической сущности и достигаемому эффекту к предлагаемому является способ выделения нативных фракций из одноклеточных микроорганизмов путем механической дезинтеграции с использованием эффекта декомпрессии (авт.св.№60265 кл. С 12 М 1/04, 1975). Суспензия микроорганизмов насыщается газом под давлением (азотом, воздухом, уг лекисльм газом), который не должен реагировать с внутриклеточными компонентами и также не должен ингиби- ровать энзимы, особенно эндофенные ядра, используемые для деградации нуклеиновых кислот в микробиальном белке. При этом газом насьш;аются и клетки до выравнивания парциального давления с обеих сторон клеточной оболочки, после чего суспен5

5

0

зия резко переводится в зону атмосферного давления. Результатом является градиент давления газа в клетке, направленный во внешнюю среду. Поскольку скорость вьпсода газа из клетки выше скорости диффузии через клеточную оболочку происходит разрыв последней.

Дезинтеграция способом быстрой декомпрессии осуществляется в устройстве, состоящем из компрессора газа, насоса-дозатора высокого давления дЛя суспензии микроорганизмов и двух цилиндров высокого давления для насыщения и перевода суспензии. Преимущество декомпрессионной дезинтеграции заключается в том, что клетки или же клеточные оболочки после дезинтеграции остаются целыми или незначительно размельченными и, следовательно, их можно легко отделить от протоплазмы при помош;и сепарации.

Описанный способ не приводит к

0

5

0

5

0

5

и позволяет вьщелять химические компоненты клеток в нативном состояйии. Энергетические затраты при декомпрессионной дезинтеграции низкие и cocтaвJJяют 0,06 КВТ Ч/кг, тогда как при экструзИонном или баллистичес- ком разрушении клеток расходуется 0,2-0,4 кВт/ч/кг.

Однако процесс декомпрессионной дезинтеграции не обеспечивает достаточно; высокой степени выхода внутриклеточных химических компонентов во внешнюю среду, а также на него оказывает значительное влияние рН перерабатываемой суспензии, поэтому необходимо процесс дополнить экстракцией . биомассы разрушенных клеток.

Это проиллюстрировано в таблице, где показана величина рН суспензии дрожжей Sacharomyces cerevisiae в зависимости от степени извлечения водорастворимого белка во внутриклеточную среду (супернант) из клеток, разрушенных декомпрессионным способом. Для сравнения приведены значения для одно- и шестикратной дезинтеграции .

Количество водорастворимого белка в неразрушенной клетке составляет 20% от общего содержания протеина (NX 6,25).

Как видно из таблицы практически все количество водорастворимого белка освобождается из дезинтегрированных клеток только при рН 9,0. Степень извлечения белка при рН 11, превышающую 100%, можно объяснить .дополнительным растворением щелоче- растворимых фракций протеина. Раз- 15ушающее действие декомпрессии на оболочку клетки длится сотые доли секунды. После этого клетка уже не подвергается механическому напряжению и из нее вытекает только часть протоплазмы, содержащей протеин. При повторном декомпрессионном воздействии, в межклеточное пространство переходит еще некоторая часть белка, количество которого зависит от рН внешней среды и количества дезинтеграции. Нарушений оболочки клетки однако, уже больше не происходит. Таким образом, существует пропорциональная зависимость между количест- вом выделяющегося из клетки белка и числом операций дезинтеграции, а также значением рН суспензии. I

Недостатком известного способа является низкий выход белка во время дезинтеграции суспензии при рН около 7,0, необходимы также более высокие значения рН для более полного освобождения или даже выделения белка из разрушенных клеток, степень выхода внутриклеточных нуклеаз более низкая чем при дезинтеграции баллистическими дезинтеграторами.

Целью изобретения является выде- ление внутриклеточных химических компонентов в нативном состоянии из биомассы микроорганизмов на более короткое время и при более низких энергетических затратах с высоким выходом и получением суспензии, содержащей довольно крупные клеточные ферменты, отделение которых на стандартных сепараторах не представляет трудности.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу выделения нативных фракций из одноклеточных микроорганизмов путем механической дезинтеграции суспензию клеток микроорганизмов с концентрацией 1-20 мае,% при рН 4,5-9,5 и температуре 0,70 С сначала подвергают дезинтеграции в декомпрессионном дезинтеграторе с рабочим давлением 3-30 МПа, после чего предварительно раздробленную суспензию обрабатывают в баллистическом дезинтеграторе.

При этом суспензию клеток микроорганизмов подвергают дезинтеграции в декомпрессионном дезинтеграторе 2-6 раз, а одноклеточными микроорганизмами являются дрожжи вида Sacha- rorayces cerevisiae, Candida, Toru- lopsis, Rhodomorula, Gidium, Pichia, Hansenula, бактерии вида Megateri- um, Methanomonas, Escherichia coli грибы и водоросли.

I

Предлагаемый способ осуществляют

следующим образом.

В.ыделение нативных фракций из одноклеточных микроорганизмов производят из их водной суспензии с концентрацией клеток 1-20 мас.%, при 0-70 С и рН 4,5-9,5. Суспензию один или несколько раз обрабатывают в периодическом или непрерывном дезинтеграторе. В качестве рабочего газа применяют воздух, азот или любой другой газ, химически инертный по отношению к клеткам. Суспензию насыщают сжатым воздухом под давлением 3-30 МПа, вьщерживают под давлением 15-60 с и переводят в область барометрического давления. При этом происходит декомпрессионная дезинтеграция клеток микроорганизмов.

Далее суспензию обрабатывают в баллистическом дезинтеграторе, содержащем мелющие тела с диаметром 0,4- 0,5 мм, преимущественно при соотношении насыпного обьема сухих мелющих тел к объему суспензии клеток 1,7:1. При этом за 5-10 мин дезинтеграции в раствор переходит 80-95% водорастворимых клеточных фракций в нативном состоянии, которые выделяются и очищаются известными методами.

Пример 1. Водную суспензию дрожжей Sacharomyces cerevisiae с коцентрацией клеток 9,8 мас.%, имеющую температуру 20°С и рН 8,4, однократно обрабатывают в лабораторном декомпрессионном дезинтеграторе периодического действия, состоящем из цилиндрической камеры - преобразователя высокого давления рабочей емкостью 35 мл, снабженной запорным клапаном, циклона-расширителя и приемного сосуда. Суспензию помещают в камеру, насьш1;ают сжатым азотом под избыточным давлением 9-10 МПа и после 25-секундного насьщения газом выстреливают через запорньй клапан в циклон-расширитель. Дезинтегрированную суспензию собирают в прием

5129

ный сосуд и перерабатывают на одно- дисковом баллистическом вертикальном дезинтеграторе со скоростью вращения диска 180 м/с и стеклянными шариками диаметром 0,4-0,56 MMj отношение объема суспензии к насыпному объему сухих шариков в дезинтеграторе 1:1,7. Эффективность дезинтеграции оценивают по выходу растворимого в воде белка в межклеточную среду.

Для сравнения проводят опыт, в Котором биомассу обрабатывают только в баллистическом дезинтеграторе.

Кривые на чертеже изображают результаты дезинтеграции на баллистическом дезинтеграторе в сравнении с предлагаемым способом в зависимости от времени, где кривая 1 - ход комбинированного дробления предлагаемым способом с одним предварительным дробле- нием; кривая 2 - то же, с двумя предварительными дроблениями, кривая 3

то же, без предварительного дробления .

Как видно из чертежа в опыте с предварительной декомпрессионной дезинтеграцией практически весь водорастворимый белок переходит в раствор в течение 5 мин баллистической дезинтеграции; при баллистической дезинтеграции без предварительной декомпрессионной обработки для перехода в раствор того же количества водорастворимого белка требуется 24 мин. Таким образом, предварительная де- компрессионная дезинтеграция позволяет сократить время баллистической , дезинтеграции на 21%.

П р и м е р 2. Опыт проводят на той же суспензии и в тех же условиях, что и в примере 1, но предварительную декомпрессионную дезинтеграцию проводят двукратно. Временной ход опыта и выход представлены кривой 2 на чертеже 1.

50

5

О 5

П р и м е р 3. Водную суспензию дрожжей Sacharomyces cerevisiae с концентрацией клеток 15 мас.%, имеющую температуру и рН 7,5, однократно обрабатывают в декомпрессион- ном дезинтеграторе при давлении 19- 20 МПа. Остальные условия такие же, как в примере 1. Выход белка за тот же период времени 16% к абсолютно сухому весу дрожжей (как в примере 1) .

П р и м е р 4. Вместо суспензии дрожжей Sacharomuces cerevisiae дезинтеграции подвергают суспензию бактерий Methanomonas. Условия дезинтеграции такие же, как в примере 1. Выход белка за тот же период времени 19% к абсолютному сухому весу бактерий.

Таким образом, использование предлагаемого способа позволяет сократить время обработки клеток в баллистическом дезинтеграторе в 4-5 раз, если суспензия предварительно подвергалась декомпрессионной дезинтеграции. При этом значительно снижается степень нагрева суспензии, что приводит к повьшению производительности баллистического дезинтегратора, экономии охлаждающей воды и энергии.

В случае выделения каких-либо термонеустойчивых фракций клеточного содержимого повьш1ается их выход и сохраняется активность. Применение предлагаемого способа позволяет выделять клеточные энзимы в активном состоянии, например внутриклеточную нуклеазу,и использовать ее далее для разрушения нуклеиновых кис- лот, содержащихся в клетках микроорганизмов.

Признано изобретением по результатам экспертизы, осуществленной Ведомством по изобретательству Чехос- 5 ловацкой Социалистической Республики.

0

/.

г I 1 I II I I I

00 lO { « O 2t-

lydWWOdQ fOWVUj5o уОУЛД OHUJO/irODfff

nwsg diifnntfogwoo(

- :

1. Способ выделения нативных фракций из одноклеточных микроорганизмов путем механической дезинтеграции, отличающийся тем, что суспензию клеток микроорганизмов с концентрацией 1-20 мас.% при рН 4,5-9,5 и температуре подвергают дезинтеграции в декомпресси- онном дезинтеграторе с рабочим давлением 3-30 МПа, затем предварительно раздробленную суспензию обрабатывают в баллистическом дезинтеграторе. 2.Способ ПОП.1, отличающийся тем, что суспензию клеток микроорганизмов подвергают дезинтеграции в декомпрессионном дезинтеграторе 2-6 раз. 3.Способ по П.1, отличающийся тем, что одноклеточными микроорганизмами являются дрожжи вида Sacharomyces cerevisiae, Candida р Torulopsis, Rhodotorula, Oidium, Pichia, Hansenula. 4.Способ no П.1, отличающийся тем, что одноклеточными микроорганизмами являются бактерии вида Megaterium, Methanomonas, Escherichia coli, грибки и водоросли. е (Л

Редактор Н.Егорова

Составитель В.Глимбет

Техред М.Ходанич Корректор В.Бутяга

Заказ 204/29

Тираж 500Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4