Способ замораживания эмбрионов Советский патент 1986 года по МПК C12N5/00 A01K67/02 

1 Изобретение относится к области биологии, а именно к трансплантации эмбрионов сельскохозяйственных животных, и может быть использовано при криоконсервировании живых биоло гических клеток. Целью изобретения является повышение выхода жизнеспособных эмбрионов после процесса замораживания. На фиг. 1 представлено устройство, с помощью которого реализуется способ охлаждения и глубокого замор живания эмбрионов; на фиг. 2 - диаграмма скорости охлаждения биообъекта. Для этого теплоизоляционный контейнер с соломинкой, содержащей эмб рионы, помещают в газообразный хлад агент с неравномерным температурным полем, в котором верхняя граница соответствует точке замерзания криопротекторной среды, а нижняя на 30-35°С ниже верхней. Охлаждение эмбрионов начинают со скоростью 5 С/мин нижней части соломинки и 2,5°С/мин верхней, с постепенным уменьшением скорости охлаждения все го образца до 0°С/мин, Устройство для охлаждения и глубокого замораживания эмбрионов содержит широкогорлый сосуд Дьюара 1 (фиг. 1) с жидким азотом, соломинку 2 с биообъектом, вставленную в кон тейнер 3 цилиндрической формы, выполненный из материала с незначител ной теплопроводностью, держатель 4, газообразную среду 5 с неравномерны температурным полем и штатив 6. Уст ройство комплектуется прибором для измерения температуры с точечным да чином (термопарой). Устройство работает следующим об разом. Производят одноразовую подготовительную работу для определения та пературного поля, в котором будет происходить процесс замораживания, времени замораживания, габаритов ко тейнера и соломинки. Сосуд Дьюара заправляют жидким азотом в объеме пятой части. После прекращения кипе ния хладагента точечньм температурным датчиком с прибором определяют зону газообразного температурного поля а-Ъ, где температура в зоне а должна соответствовать точке замерзания криопротекторной среды t| (фиг. 2), в которой происходит за9мораживание зародыша, а в точке h быть в четыре раза ниже ее (t сота рабочей части соломинки 2 (фиг. 1) должна соответствовать размеру Н„, а вьюота контейнера Н быть больше на величину его радиуса. Диаметр контейнера 3 рассчитывается в соответствии с предполагаемой начальной скоростью охлаждения. Завершающая часть подготовки устройства к замораживанию заключается в определении времени замораживания Т||-Т (фиг. 2), для чего контейнер 3 (фиг. 1) без биообъекта держателем 4 опускают в неравномерное температурное поле на уровень Н с помощью штатива 6, при этом температурный датчик устанавливается в контейнер в верхней его точке на уровне зоны а и фиксируется время понижения температуры до ее стабилизации (фиг. 2/. Это время определяет длительность замораживания биообъекта. Таким образом, устройство готово к многократному использованию. Процесс охлаждения и глубокого замораживания эмбрионов проводят следующим образом. Соломинку 2 (фиг. 1) с бйообъектом опускают в контейнер 3, который устанавливают на днище держателя 4, и фиксируют время начала охлаждения Т(фиг. 2). Поскольку биообъект расположен в неравномерном тй 1пературIIOM поле, то температура нижней части соломинки достигает точки замерзания t( быстрее, чем верхней, где возбуждает внеклеточное кристаллообразование, которое медленно распространяется вверх в соломинке до конца замораживания за время Т -Т. Такой способ обеспечивает выживание зародьш1ей как в период фазовой трансформации криопротекторной среды и биообъекта (при медленном кристаллообразовании всего биообъекта осмотическая реакция клетки успевает отдать вбду во внеклеточную среду), так и в процессе всего цикла охлаждения, который происходит по заданному режиму. По истечении времени Т„-Тд контейнер 3 (фиг. 1) вынимают из сосуда Дьюара, а соломинку опускают в жидкий азот и отправляют в эмбриобанк, после чего процесс замораживания окончен. 3 Пример . Замораживание производят с использованием универсального штатива и сосуда Дьюара с гидравлическим объемом 5,5 л и диаметром горловины 190 мм. Сосуд Дьюара наполняют жидким азо том до уровня 5 см от дна (пятая часть емкости), ожидают прекращение бурного кипения хладагента и определяют температурное поле а-Ъ (фиг. 1 с помощью электронного потенциометра с точечной термопарой, градуированной по ХК-68. Рабочая зона температурного поля с учетом температурной характеристики криопротекторной ереды составляет 60 мм по высоте. Этот же размер определяет высоты рабочей части соломинки. Затем производят оценочный расчет толщины контейнера по заданному начальному режиму охлаждения в точке-Ъ (5°С/мин).по формуле г- Г 1 . п т тт где 4Тц - начальная разность темпера туры между стенкой контейнера на изменяемом уров не и газообразным азотом: +20°С-(-40°С)60 (+20С начальная температура контейнера перед охлаждением) 9 начальная скорость охлажде 0, ния,-С/с; а - коэффициент температуропроводности материала ( а /р-с, где f( - теплопроводность; р - плотность; с - теплоемкость). 494 Материалом выбран текстолит. Для него а( 1 ,5-1 ,7 ) 10 . Тогда по формуле (1), ff 1,1 см. На основании произведенного оценочного расчета толщины стенки экспериментально подбирают диаметр контейнера и его общую высоту: мм, мм. Диаметр соломинки берут стандартный - 3 мм, а гнездо контейнера на 0,2 мм больще. Расход хладагента на цикл замораживания 0,5 л. Аналогично производится выбор контейнеров для других режимов охлаждения при определении пределов замораживания эмбрионов животных. Использование способа позволяет достичь со фанности эмбрионов 89,4%. I Формула изобретения Способ замораживания эмбрионов в соломинке с криопротекторной средой путем ее помещения в вертикальный контейнер и последующего охлаждения в газообразном хладагенте, отличающийся тем, что, с целью повьщ1ения выхода жизнеспособных эмбрионов после процесса замораживания, охлаждение контейнера с соломинкой, содержащей эмбрионы с криопротекторной средой, осуществляют в газообразном хладагенте с неравномерным по высоте температурным полем , значение верхней границы которого равно точке замерза ния криопротекторной среды , а нижней границы - на 30-35 С меньше.

Изобретение относится к области биологии, а именно к трансплантации эмбрионов сельскохозяйственных животных, и может быть использовано при криоконсервировании живых биологических клеток. Целью изобретения является повьшзение выхода жизнеспособных эмбрионов после процесса замораживания. Способ заключается в том, что вертикальный контейнер с соломинкой, содержащей эмбрионы с криопротекторной средой, помещают в хладагент с неравномерным по высоте температурным полем, значение верхней границы которого равно точке замерзания криопротекторной среды, а нижней границы - на 30-35°С меньше. Применение способа позволяет достичь сохранности эмбрионов до 89,4%. Диаметр контейнера и его общую высоту Ф экспериментально подбирают на ос(Л новании произведенного оценочного расчета толщины стенки. 2 ил.