Устройство для замораживания биологических объектов Советский патент 1993 года по МПК F25D3/10 

контакта с хладагентом. В гнезде вставлены контейнеры для биологических объектов.

Замораживатель выполнен из легкого материала с низким коэффициентом теплопроводности.

Благодаря хорошей теплопроводности металлических стержней и гнезд происходит замораживание биообъектов в контейнерах почти с постоянной скоростью.

Однако в объеме зоны замораживания возникает достаточно большой модуль градиента температуры в газовой среде хладагента (т.к. верхняя часть контейнеров находится в парах хладагента, а часть контейнера через теплопроводящие стержни контактирует с жидким хладагентом), что приводит к снижению сохранности биологических объектов.

В известном, устройстве отсутствует возможность инициирования льдообразования во внеклеточной среде, что также снижает сохранность биологических объектов.

Регулировка скорости охлаждения биологического материала в известном устройстве осуществляется за счет смены стержней различного диаметра, т.е. допускается только дискретная регулировка скорости охлаждения, а не плавная.

Целью настоящего изобретения является повышение сохранности биологических объектов в процессе замораживания, путем снижения модуля градиента температуры в зоне замораживания и обеспечения плавной регулировки скорости охлаждения объектов с инициированием начала льдообразования во внеклеточной среде для снижения начального переохлаждения.

Поставленная цель достигается тем, что в устройстве для замораживания биологических объектов, содержащем выполненные из материала с низким коэффициентом теплопроводности корпус, контейнеры для биообъекта и установленный в корпусе с возможностью расположения на поверхности жидкого хладагента держатель контейнеров, включающий диск с гнездами для контейнеров, согласно изобретению держатель снабжен крышкой, установленной на диске с образованием между ними полости, расположенной вдоль вертикальной оси диска, трубой с укрепленными на ее концах радиаторами и регулировочным клапаном, установленным в отверстии верхнего конца трубы. При этом диск выполнен утолщенным и имеет вокруг трубы центральный вертикальный канал и расположенную у нижнего основания диска камеру для образования паров хладагента, сообщенную с каналом в диске и с рабочим объемом корпуса ниже предполагаемого уровня хладагента в нем. Канал диска связан посредством капиллярных трубок с зонами размещения каждого контейнера для подвода газообразного хладагента к их стенкам.

Верхний радиатор трубы расположен в полости держателя над контейнерами, а нижний - в камере для образования паров хладагента.

Благодаря выполнению держателя кон0 тейнеров в виде диска с крышкой, образована полость для замораживания биообъекта в контейнерах с регулируемой клапаном подачей паров хладагента по трубе центрального канала и перемешиванием в этой

5 полости паров хладагента верхним радиатором. В результате значительно снижается модуль градиента температуры во всей полости и, соответственно, во всем объеме каждого из контейнеров с биологическим

0 материалом.

Снижение модуля градиента температуры в зоне нахождения каждого из контейнеров с биообъектами повышает их сохранность при криоконсервировании по

5 сравнению с прототипом.

Выполнение капилляров от центрального канала к каждому контейнеру позволяет подвести пары хладагента непосредственно к стенке контейнера и инициировать льдооб0 разование внутри контейнера во внеклеточной среде. Образовавшиеся кристаллы льда являются затравочными для кристаллизации всей воды в контейнере. При этом во всем содержимом контейнера практически

5 исключается, переохлаждение, что также способствует повышению сохранности биологических объектов при криоконсервировании, что не достигалось у прототипа. Нижний радиатор на трубе в расширен0 ной части центрального канала у основания диска держателя контейнеров способствует испарению жидкого хладагента за счет переноса тепла из зоны замораживания от контейнеров и верхнего радиатора.

5 Количество подаваемых паров хладагента в полость держателя контейнеров плавно регулируется клапаном в верхней части трубы.

При поиске по патентной и научно-тех0 нической литературе не выявлены объекты с признаками заявляемого технического решения, на основании чего можно сделать вывод, что оно соответствует критерию существенные отличия.

5 На чертеже показан вертикальный разрез общего вида устройства для замораживания биологических объектов.

Устройство содержит корпус 1 с крышкой 2, заполненный жидким хладагентом 3, например, азотом. Внутри корпуса 1 на поверхности хладагента 3 расположен держатель в виде диска А с утолщенным телом 5 и крышкой 6, образующих полость, расположенную вдоль вертикальной оси диска 4.

В теле 5 диска 4 выполнены гнезда 7, с установленными в них контейнерами 8 для биологических объектов.

В теле 5 диска 4 образован по крайне мере один вертикальный центральный канал 9 с расширенной частью у нижнего основания диска 4. образующей камеру 10.

От канала 9 отходят капилляры 11 к зоне размещения каждого контейнера 8.

Внутри канала 9 расположена труба 12, на нижнем и верхнем концах которой установлены радиаторы 13 и 14, соответственно. Нижний радиатор 13 находится в камере 10. Верхний радиатор 14 расположен.в полости держателя над контейнерами 8.

В верхней части трубы 12 установлен регулировочный клапан 15.

Участок трубы 12 между телом 5 диска 4 и радиатором 14 изолирован теплоизоляцией 16.

К нижнему основанию диска 4 с наружной стороны прикреплен балласт 17 с отверстием 18, соосным каналу 9.

Корпус 1 с крышкой 2, диск 4 с крышкой 6 и контейнеры 8 выполнены из материала с низким коэффициентом теплопроводности. Радиаторы 13 и 14, а также труба 12 выполнены из высокотеплопроводного материала, например, из алюминия, меди.

П р и м е р 1. Использовали цилиндрический корпус 1 с внутренним диаметром 190 мм и высотой 400 мм, в который залили три литра жидкого хладагента 3 (азота).

Цилиндрический диск 4 из пенопласта имел внешний диаметр 170 мм и высоту 150 мм. Полость мэжду телом 5 диска 4 и крышкой 6, образующая рабочую зону охлаждения, имела размеры: диаметр 120 мм и высоту 80 мм.

Пластиковые контейнеры 8 имели наружный диаметр 15 мм с толщиной стенки 1,5 мм и высоту 80 мм.

Для контроля за скоростью охлаждения и начальным переохлаждением внеклеточной среды содержимого котейнеров 8 использовали дифференциальную медь - копелевую термопару с соответствующей регистрирующей аппаратурой (на чертеже не показаны), Измерительный спай термопары располагали в центре объема одного из контейнеров 8,

Замораживание биологических объектов в контейнерах 8 проводили со скоростью 1бС/мин до -40°С с дальнейшим погружением в жидкий азот.

Кот роль за температурой в рабочей зоне в полости диска 4 производили в шести точках также термопарами с соответствующей регистрирующей аппаратурой (на чертеже не показаны). Каждая из шести точек располагалась на расстоянии 10 мм от поверхности стенки контейнера 8. По высоте измерительные точки располагались на 1/3 и 3/4 высоты контейнеров 8. В плане точки

чередовались через 60 угловых градусов.

В контейнеры 8 заливали по 8 мл лейко- концентрата, полученного из донорской крови человека, разбавленного в соотношении 1:1 криопоотектором - 10%-ным раствором диметилсульфоксида. Контейнеры 8, после заполнения их биологическим объектом, герметично закрывали.

Семь таких контейнеров 8 с положительной начальной температурой при снятых крышке 6 и радиаторе 14 устанавливали в гнезда 7 тела 5 диска 4. Затем закрепляли радиатор 14, регулировочным клапаном 15 устанавливали скорость охлаждения 1°С/мин. После этого закрывали крышку 6 и

диск 4 погружали в корпус 1 и закрывали его крышку 2.

Тепло от контейнеров 8, газовой среды в рабочей зоне и радиаторе 14 по трубе 12 и каналу 9 передавалось в камеру 10 к радиатору 13. Благодаря этому теплу жидкий азот в камере 10 закипал, и его пары поступали потрубе 12 через регулировочный клапан 15 в рабочую зону диска 4. Радиатор 1.4 способствовал выравниванию температуры вовсем объеме полости. С заданной скоростью температура в контейнерах 8 снижалась до криоскопической. Одновременно пары азота из камеры 10 по каналу 9 и капилляры 11 поднимались непосредственно к стенкам

контейнеров 8. Локальные воздействия паров азота на стенки контейнеров 8 вызывает внутри них практически в точечном объеме понижение температуры относительно всего объема содержимого контейнеров 8. В

результате достигалось локальное охлаждение раствора, достаточное для образования кристаллов льда из водной компоненты раствора, которые являлись затравочными для кристаллизации водной

компоненты всей основной массы внеклеточной среды биологического объекта при переходе воды в лед.

При этом во всем содержимом контейнеров 8 практически исключалось переохлаждение (см. результаты измерений).

В процессе замораживания при достижении в точке № 1 контрольных температур, одновременно измеряли температуру в точках № 2; № 3. № 4, № 5 и № 6.

Результаты измерений температур в шести точках в период замораживания приведены в табл.1 в виде усредненных значений по трем (п 3) испытаниям. Замеры проводились с интервалом времени (10 ± 0,05) мин.

В табл.2 представлены данные о начальном переохлаждении во внеклеточной среде внутри одного из контейнеров 8.

Семь аналогичных контейнеров 8 с тем же биологическим объектом замораживали в устройстве - прототипе со скоростью охлаждения 1°С/мин до -40°С с последующим погружением в жидкий азот.

В устройстве - прототипе скорость охлаждения клеточной суспензии и начальное переохлаждение внеклеточной среды контролировали аналогичной термопарой, измерительный спай которой располагали внутри одного из контейнеров.

Так же. как в заявляемом устройстве, контролировали температуру в шести точках рабочей зоны замораживателя.

Результаты измерений приведены в табл,1 и 2.

Размораживание клеточной суспензии лейкоконцентрата в обоих случаях проводили до 0°С на водяной бане с температурой 37°С.

В нативной и размороженной суспензии клеток подсчитывали общее количество клеток и определяли их жизнеспособность после окраски витальными красителями.

В табл.3 представлены полученные результаты. Недостоверность Р количественной оценки жизнеспособности клеток оценивается по условиям эксперимента величиной Р 0,05.

Из анализа результатов измерений, представленных в табл.1, следует, что при охлаждении биологического объекта в устройстве - прототипе модуль градиента температуры в рабочей зоне варьируется в широких пределах - от 0.4°С до 2б,4°С, что приводит к неравномерным условиям охлаждения каждого из контейнеров (верхней их части).

Охлаждение биологического объекта в заявляемом устройстве позволяет снизить варьирование модуля градиента температуры в рабочей зоне в полости диска 4 до (0,5-3,2)°С, что примерно в 10 раз меньше, чем у прототипа.

Из табл.2 видно, что в устройстве - про тотипе при замораживании биологического объекта имеет место значительное переохлаждение (около 6,3°С) содержимого контейнера, а в предлагаемом устройстве переохлаждение практически не наблюдается, т.е. близко к 0°С.

Неравномерность охлаждения каждого из контейнеров, а также большое переохлаждение водной компоненты внеклеточной среды при фазовом переходе вода - лед снижает жизнеспособность биологического объекта при замораживании в устройстве - прототипе. Этих недостатков лишено заявляемое.устройство, что подтверждается та.бл.З. Жизнеспособность клеток деконсер- вированной лейкоцитарной массы, замороженной в заявляемом устройстве, на 14% выше по сравнению с прототипом.

Пример 2. В заявляемом устройстве и устройстве-прототипе замораживали ге- мопоэтические клетки, полученные из эмбриональной печени свиней и разбавленные всоотношении 1:1 защитным раствором, содержащим раствор Хэнкса - 90% и димет- сульфоксид - 10%.

Подготовленную суспензию разливали по 8 мл в пластиковые контейнеры 8, герметизировали их и помещали в замораживатель заявляемого устройства и устройства-прототипа.

В дальнейшем замораживание и отогрев биологических объектов проводили аналогично примеру 1, но уже без контроля

температур, т.к. использовали ранее оттари- рованные устройства.

Жизнеспособность нативных и размороженных клеток суспензии определяли после окраски витальным красителем (Метиленовый синий).

Количество клеток в суспензии подсчитывали в камере Горяева. Недостоверность оценки параметров объектов оценивается, как и ранее, величиной Р 0,05,

Результаты представлены в табл.4.

Из данных, приведенных в табл.4, видно, что сохранность клеток, замороженных в устройстве-прототипе (около 14%).

Таким образом, заявляемое устройство

за каждый цикл замораживания (1,5-2 ч) позволяет сохранить на 14% больше жизнеспособных клеток биологических объектов, по сравнению с устройством прототипом.

Формула изобретения Устройство для замораживания биологических объектов, содержащее выполненные из материала с низким коэффициентом теплопроводности корпус, контейнеры для биообьекта и установленный в корпусе с возможностью расположения на поверхности жидкого хладагента держатель контейнеров, включающий диск с гнездами для контейнеров, отличающееся тем, что держатель снабжен крышкой, установленной на диске с образованием между ними полости, расположенной вдоль вертикальной оси диска, трубой с укрепленными на ее концах радиаторами и регулировочным кла0

5

паном, установленным в отверстии верхнего конца трубы, при этом диск выполнен утолщенным и имеет образованный вокруг трубы центральный вертикальный канал, расположенную у нижнего основания диска камеру для образования паров хладагента, сообщенную с каналом и с рабочим объемом корпуса ниже предполагаемого уровня хладагента в нем, причем канал связан посредством капиллярных трубок с зонами размещения каждого контейнера для подвода газообразного хладагента к их стенках, верхний радиатор расположен в полости держателя над контейнерами, а нижний - в камере для образования паров хладагента.

Таблица 1

Таблица 2

Таблица 3

Таблица 4