Способ предотвращения микробного разложения углеводных полимеров растительного происхождения в почвенных образцах Советский патент 1987 года по МПК C12N1/00 

Изобретение относится к почвоведению и сельскому хозяйству.

Цель изобретения - предотвращение загрязнения окружающей среды за счет исключения использования токсичных химических реагентов.

Способ осущест1зляют следующим образом.

Отбирают почвенргый образец. Для предотвращения микробного разложения углеводных полимеров раститсшьного происхождения в образце почвы производят следующие операции, включающие предварительную подготовку образца, собственно предотвращение микробного разложения углеводных полимеров в образце и контроль за предотвращением разложения,

Предварительная подготовка образца 20 углерода при

включает увлажнение воздушно-сухой почвы до полевой влагоемкости и инкубирование его во влажной камере при 25°С в течение педели. В случае использования естественно увлажненного образца такая предварительная подготовка не требуется,

Цредотвращение микробного разложения углеводных полимеров растительного происхождения в образце достигают внесением в почву глюкозы в количестве 1,0-3,0 мг/г почвы. Глюкозу вносят в виде водного раствора, почву тщательно перемешивают и инкубируют во влажной камере при 25 С неделю. Процесс утилизации глюкозы в почве сопровождается снижением гидролитической активности почвенных микроор- ганизмов-гидролитиков, Достигнутый уровень снижения сохраняется в почве не менее месяца, в течение этого периода происходит предотвращение раз- ложения углеводных кглчимеров микроорганизмами .

Контроль за предотвращением микробного разложения углеводных полимеров в почве осуществляют путем измерения длины грибного мицелия, развивающегося на внесенном в почву полимере растительного происхождения. Для этого из образцов почвы, прединкуби- рованных с глюкозой и без нее, готовят почвенные пластинки в чашках Петри диаметром 4 см, заполняя их полностью и получая ровную поверхность. На поверхность почвенных пластинок наносят полимер (крахмал или целлофан) в количестве не более 5 мг/г почвы. Почву инкубируют во влажной

камере при 25°С неделю. Затем измеряют длину грибного мицелия в микробном сообществе, развивающемся на внесенном полимере, с помощью светового микроскопа в отраженном свете при увеличении ЮОх, Кроме того, с помощью сканирующего электронного микроскопа следят за образованием зон гидролиза крахмала или целлофана и производят измерение скорости выделения двуокиси углерода при разложении крахмала или целлофана на газовом хроматографе. Уменьщение длины грибного мицелия на полимере в почве после внесения глюкозы по сравнению с вариантом без внесения глюкозы, отсутствие зон гидролиза на полимере и уменьшение скорости выделения двуоки0 углерода при

разложении полимера о предотвращении раз5

свидетельствуют ложения.

В результате деятельности микроор- ганизмов-гидролитиков в почве происходит синтез экзогидролаз, которые обеспечивают синхронное расщепление растительных углеводных полимеров и снабжение микробной клетки мономерами - источниками углерода и энергии.

0 Интенсивность роста микроорганизмов- гидролитиков находится в прямой связи с синтезом ими зкзогидролаз. На этом основании представляется возможным по длине мицелия микроорганизмовгидролитиков судить об уровне их гидролитической активности в почве и об интенсивности разложения ими растительных углеводов. Прямые наблюдения за гидролизом полимеров в сканирую0 цем электронном микроскопе, а также слежение за уровнем выделения двуокиси углерода при разложении полимера дополнительно свидетельствуют о изменении гидролитической активности почвенных микроорганизмов, а следовательно, об интенсивности разложения растительных углеводов. Учитывая, что в продукции двуокиси углерода могут участвовать и микроорганизмы, не относящиеся к группе гидролитиков, для количественной оценки степени снижения интенсивности разложения растительных полимеров используют от- нощение величин длин грибного мицелия в вариантах с глюкозой и без нее. Обнаружено явление длительной необратимости репрессии синтеза микроорганизмами гидролитических ферментов. Это проявляется при разовом вне5

0

5

3П42922

епии в почву небольших количеств

п т ч в к м г с с л з с л д

глюкозы. Несмотря на то, что глюкояа полностью утилизируется микроорганизмами в течение 2-3 сут после внесения в почву, ее последействие в репрессии синтеза гидролитических ферментов имеет место продолггителыюе время и может проявляться даже через месяц и более. Обычно на питательных средах лишь в присутствии мономера проявляется репрессия синтеза гидролитических- ферментов .

Пример 1. Предотвращение микробного разложения крахмала в типичном черноземе.

Образец воздушно-cyxoi o чернозема в количестве 1 кг увлажняют до полевой влагоемкости, для чего вносят 330 МП дистиллированной воды, тщательно перемешивают и инкубируют в течение недели при 25 С. Затем почву разделяют на десять равных частей, в которые вносят навески глюкозы 0,1; 10,0; 30,0; 50,0; 70,0; 100,0; 150,0; 200,0.,и 300,0 мг. Из каждой части готовят почвенные пластинки в шестикратной повторности. Пластинки инкубируют в термостате при 25 С во влажной камере в течение недели. По истечении недели длину ицeлия грибов, развившихся на внесённом крахмале, измеряют с помощью светового микроскопа в отраженном свете при увеличении ЮОх. В варианте без добавления глюкозы происходит интенсивное заселение крахмала грибами. В вариантах с внесением глюкозы в интервале концентраций от О до 0,5 мг/г почвы длина грибного мицелия остается практически неизменной и равна 200 м/см поверхности почвенной пластинки, что свидетельствует о высокой интенсивности разложения крахмала грибами в этих условиях. При увеличении концентрации глюкозы от 0,5 до 1 ,5 мг/г почвы происходит резкое сокращение длины грибного мицелия до 1-2 м/см , т.е. снижение интенсивности разложения крахмала грибами. Таким образом, при концентрации глюкозы 1,5 мг/г почвы достигается максимальное предотвращение разложения полимера поч- вениыми микроорганизмами. Дальнейшее увеличение концентрации глюкозы не приводит к дополнительному снижению интенсивности разложения крахмала.

Проводят микроскопическое исследование процесса разложения крахмала в

0

5

5

0

5

0

5

0

5

почве с помощью сканирующего электронного микроскопа. При низких значениях концентрации глюкозы в интервале от О до 0,5 мг/г почвы в местах контакта грибных гиф с зернами крахмала обнаруживаются характерные зоны гидролиза, образующиеся за счет действия грибных экзоамилаз, выделяющихся в среду. В дальнейшем процесс разложения прогрессирует, зоны гидролиза расширяются, образуя характерные борозды и каверны. В вариантах с внесением глюкозы в концентрациях свьше 1,5 мг/г почвы не происходит г идро- лиза крахмала в течение месяца наблюдений .

Пример 2. Предотвращение разложения целлюлозы микроорганизмами в вьпцелаченном черноземе и дерново- подзолистой почве.

Ход анализа аналогичен описанному в примере 1. Рассматривают целлюлозо- разрушающую активность почвенных микроорганизмов, поэтому используют целлофан в концентрации 5 мг/г почвы. В вариантах с внесением глюкозы длина грибного мицелия сокращается в обоих почвах при возрастании концентрации глюкозы в интервале от 0,5 до 3,0 мг/г почвы. При этом он почти полностью исчезает с целлофана при концентрации глюкозы, равной 3 мг/г почвы для чернозема и при 2 мг/г почвы для дерново-подзолистой почвы. Таким образом, значениями концентрации глюкозы, за пределами которых происходит максимальное снижение интенсивности разложения целлюлозы, сопровождающееся полной репрессией синтеза экзоцеллюлаз, являются для чернозема 3 мг/г, а для дерново-подзолистой почвы - 2 мг/г почвы. При этих значениях концентраций внесенной в почву глюкозы подтверждается достижение положительного эффекта, а именно предотвращение микробного разложения углеводного полш ера растительного происхождения (целлюлозы) путем снижения уровня гидролитической активности микроорганизмов в вы- щелаченном черноземе и дерново-подзолистой почве в 100 и 80 раз соответственно.

Проводят микроскопическое исследование процесса разложения целлофана в почве с помощью сканирующего электронного микроскопа. При низких значениях концентрации глюкозы в интервале от О до 0,S мг/г почвы происходит интенсивное заселение целлофана микросконическими грибаму. При этом вокруг грибных г иф обнаруживается зона гидролиза пел., образующаяся за счет выделения грибами экзоцел люлаз. В дальнеГшгем разложение прогрессирует, зоны гидролиза расширяютс и происходит полное разложение целлофана. Через 10 дне инкубации длина грибного мицелия достигает максимальной величины, начинают образовываться репродуктивные органы микромице- тов. В вариантах с внесением глюкозы в почву в концентрации выше 3 мг/г для чернозема и 2 мг/г для дерново- подзолистой почвы не происходит гидролиза целлофана в течение месяца наблюдений. Приме

Р 3.

Предотвращение разложения крахмала в дерново-подзолистой почве.

Ход анализа аналогичен описанному в примере 1. Активность в разложении крахмала микроорганизмами в дерново- подзолистой почве характеризуется длиной грибного мицелия -150 м/см, а в варианте с внесением глюкозы - 2 м/см. Таким образом, в данном примере подтверждается достижение положительного зф()екта, а именно предотвращение разложения крахмала путем снижения уровня гидролитической активности t-шкроорганизмов в дерново подзолистой почве в 75 раз.

Изучают кинетику процесса выделения двуокиси углерода, образующегося в результате разложения крахмала в почве. Ог1ределе}гие показало, что скорость продукции двуокиси углерода в варианте без глюкозы больше, начиная с четвертого дня инкубации, чем в варианте с глюкозой, в 2,8 раза. Таким образом, кинетический анализ кривых дыхания свидетельствует о том, что интенсивность разложения углеводного полимера (крахмала) может быть в значительной степени предотвращена добавлением в почву глюкозы.

П р и м е р 4. Обратимость эффекта предотвращения микробного разложения углеводных полимеров растительного происхождения.

С целью снятия действия глюкозы на способность почвенных микроорганизмов к разложению растительных материалов дерново-подзолистую почву

0

0

Ь

0

после прединкубирования с глюкозой в концентрации 0,6 мг/г почвы подвергают следующим обработкам: вакуумиро- ванию, замораживанию, кратковременному и длительному высушиванию. Затем образцу. почвы вновь увлажняют до полевой влагоемкости, интенсивность разложения углеводных полимеров микроорганизмами определяют по длине грибного мицелия, который развивается на внесенном в концентрации 5 мг/г почвы крахмале. К наибольшему эффекту приводит длительное высушивание.

5 Длина мицелия грибов в амилолитичес- ком микробном сообществе, подверженном действию длительного высушивания, в 75 раз больше, чем в сообп1естве почвы без каких-либо дополнительных обработок, т.е. высушивание полностью снимает эффект предотвращения микробного разложения углеводных полимеров растительного происхождения под действием глюкозы.

Таким образом, положительный зф- фект достигается путем внесения в почву абсолютно не токсичного для высших организмов и обычного для почвы соединения - глюкозы. Длительность действия глюкозы в почве регулируется простым лабораторным приемом - высушиванием с последующим увлажнением, как показано в примере 4. Это обусловлено обратимостью репрессии синтеза гидролитических ферментов микроорганизмами после высушивания репрессированной почвы. По предлагаемому способу достигается , строгая селективность - предотвращается только процесс разложения углеводородных полимеров микроорганизма- ми-гидролитиками (примеры 1-3). Кроме того, в предлагаемом способе не нарушается структура естественных

g микробных сообществ почвы. Согласно примерам 1-3 снижение интенсивности разложения при использовании глюкозы происходит в 75-100 раз по оценке длины мицелия грибов-гидролитиков и в 2,8 раза по оценке такого общего показателя биологической активности почв, как продукция двуокиси углерода. При этом степень влияния предлагаемого вещества на интенсивность разложения эффективнее, чем в известных способах.

Формула изобретения

Способ предотвращения микробного разложения углеводных полимеров рас5

0

0

5

7 13429228

тигельного происхождения в почвенныхпредотвращения загрязнения среды, в

образцах, предусматривающий увлажне-образец вносят глюкозу в концентрание образца, внесение в образец поли-ции 1-3 мг/г почвы в качестве ингибимера и органического вещества-ингиби-тора роста микроорганизмов-гидролититора роста почвенных микроорганизмов, ков, а оценку результатов осуществляс последующим инкубированием и оцен-ют путем измерения длины грибного

кой полученных результатов, о т л и-мицелия, развивающегося на поличающийся тем, что, с цельюмере.

Изобретение относится к области почвоведения и сельского хозяйства. Целью изобретения является предотвращение загрязнения окружающей среды за счет исключения использования токсичных реагентов. Способ заключается в следующем. Готовят образец почвы, увлажняют его и вносят глюкозу в концентрации 1,0-3,0 мг/г почвы, инкубируют образец в течение недели и затем контролируют степень воздействия глюкозы. Об интенсивности разложения растительных материалов судят по уменьшению длины грибного мицелия, развивающегося на 7 сут на внесенном полимере - крахмале или целлофане, и по отсутствию зон гидролиза крахмала или целлофана, обнаруживаемых на 7 сут разложения с помощью сканирующего электронного микроскопа, а также по уменьшению в скорости выделения двуокиси углерода при разложении крахмала или целлофана. Длительность действия глюкозы в почве регулируют высушиванием с последующим увлажнением. По данному способу достигается строгая селективность - предотвращение разложения растительных остатков только микроорганизмами из группы гидролитиков. (Л