Способ определения количества микроорганизмов в почве Советский патент 1987 года по МПК C12Q1/06 

Изобретение относится к почвенной микробиологии и может быть использовано для оценки микробиологических факторов плодородия почвы, эффективности действия бактериальных удобрений, при санитарно-гигиеническом обследовании природных объектов.

Цель изобретения - повышение точности способа путем измерения количества микроорганизмов (биомассы или численности клеток) по скорости протекания микробиологического предела непосредственно в почве.

На основании изучения особенностей кинетики роста микроорганизмов в почве разработан прием прямого определения козффициента пересчета величины скорости процесса и величины микробной биомассы или численности.

Скорость V превращения микроорганизмами подавляющего большинства экзогенных субстратов зависит от их концентрации и от количества микроорганизмов

g-S-X

(1)

где X S

q

биомасса микроорганизмов; концентрация субстрата; максимальная удельная скорость микробиологического процесса;

константа насьпцения; численно равная той концентрации

субстрата, при которойУ 0,5У,акс

При внесении в почвунасьпцающих

концентраций субстрата(S К) ура неииЕ (I) упрощается

KB или

V q-X

(2)

где V - скорость потреблеиия субстрата в начальный момент после внесения его в почву, мг/ч«г почвы;

q -. пересчетный коэффициент, удельная скорость метаболизма, мг субстрата/ч-мг биомассы.

Для измерений q определение V проводят один раз с известным количест- вом микроорганизмов, это количество устанавливают весовым методом путем микроскопического подсчета клеток и т.д.

Применительно к почве нахождение q подобным образом невозможно, так как истинные размеры микробной био- массь в почве неизвестгш, а внесенные в почву микроорганизмы не тождественны эндогенной микрофлоре.

Это диктует необходим9сть нахождения величины q для каждой конкретной ситуации. нахождения q заключается в прослеживании динамики нарастания скорости потребления субстрата в процессе роста микроорганизмов и расчета по формуле:

5

0

5

0

5

0

5

Q

с

din V

(U

где

q - r:-v- v- (3)

«/5 4/s

- удельная скорость роста микроорганизмов;

- экономический коэффициент, выход биомассы на единицу потребленного, мг биомас- сы/мг субстрата;

t - время инкубации.

Для экспериментального определения достаточно получить данные по динамике нарастания V в первые часы или сутки после внесения в почву субстрата. Величина YX/S представляет собой для данной физиологической группы относительно постоянную величину, например: для микроорганизмов, использующих глюкозу 1 0,6 гС биомассы/гС-субстрата: для нитрификаторов 0,7-10 кле- ток/мкг N; для денитрификаторов Yx/g 2,67 г сухого веса биомассы/г N; величину находят по справочным данным для каждого конкретного случая,(Либо определяют экспериментально, исходя из соотношения

Y . dS

Согласно предлагаемому способу в почву вносят субстрат не только для измерения V, но и для того, чтобы микроорганизмы, использующие данный субстрат, работали по экспоненциальному закону:

X Х„ ехр (U (t -t ),

где - продолжительность лаг-перио- да.

Условия, необходимые для реализации экспоненциального роста микроорганизмов:

в почву вносится субстрат, ассимилируемый микроорганизмами, метаболизируемьт, но не дающий прироста количества клеток субстрат (подобный тет- разолиуму и .прочим ксенобиотикам) применяться не может, химическая лривают пробкой егде раз на 30 мин и повторяют измерение скорости образования СС , после чего инкубируют 30 мин

без пробки и т.д. Всего приводят пять измерений скорости образования СО через каждый час. Результаты определений сведены в табл.1.

гт dlnV

По формуле |ц -----находят среднее

Величину

принимают равной 0,67 г С биг омассы. Отсюда находят , мкг С/мкг С биомассы и биомассу микроорганизмов , способных расти на глю- раций (5-96 ч). Расчет величины лсу- 15 козе, 355 мкг С/г почвы.

Пример 2. 5г типичного мощного чернозема помещают в пеницил- линовый флакон, вносят 12,5 мг глюкозы в виде концентрированного раство20 Ра, закрывают герметично резиновой пробкой и инкубируют при 2510,1 С течение 30 мин. После этого отбирают шприцем пробу воздуха, измеряют в ней концентрацию СО на газовом хромато25 графе и снимают резиновую пробку с флакона. В течение последующих 30 мин флакон инкубируют без пробки при той же температуре 25°С, затем флакон закрывают пробкой еще раз на 30 мин

30

рода ассимилируемого субстрата диктуется задачей исследования, т.е. тем, количества каких микроорганизмов требуется определить;

количество вносимого субстрата S должно многократно превышать констан-/0 значе ние ги 0,021 ч ту насыщения микроорганизмов К (10 М для большинства видов) и обеспечить .нелимитированный рост на протяжении по крайней мере 0,3-3 генераций (5-96 ч). Расч€ ществляют по формуле

S, Х„п/У, где Хд - предполагаемое количество

п

микроорганизмов в почве; - число генераций.

На практике численное значение Х трудно оценить заранее, но эмпирически установлено, что для обеспечения 0,3-3 генераций микроорганизмов в почву достаточно внести 0,5- 2,5 мг/г субстрата, являющег 9ся источником энергии;

продолжительность выращивания микроорганизмов зависит от удельной скорости их роста или времени их генерации . Чем вьше и, тем короче срок инкубации. Практическим критерием для выбора срока инкубации является следующий: величина V должна достоверно возрасти по сравнению с V - численным значением V в момент

сения субстрата в 1,2-12 раз. Эквивалентная форма рекомендации по установлению срока инкубации: 0,3-3 времен генерации микроорганизмов или 5-96 ч.

Пример 1 . Определение . массы микроорганизмов, способных использовать глюкозу.

5 г дерново-подзолистой почвы помещают в пенициллиновый флакон, вносят 12,5 мг глюкозы в виде концентрированного раствора, закрывают герметично резиновой пробкой и иикубии повторяют измерение скорости образования COj, после чего инкубируют 30 мин без пробки и т.д. Всего проводят пять измерений скорости образования СО, через каждый час. Реэуль35 таты определений приведены в табл.2. Результаты вычислений: р 0,03 , q 0,0201 мкг С/ч мкг С биомассы, биомасса микроорганизмов 299 мкг С/г почвы.

40 П р и м е р 3. Определение коли- Ч1е;с:тва микроорганизмов, окисляющих NH4.100 г почвы помещают в стеклянный кристаллизатор, вносят, сульфат аммо45 НИН в количестве 0,59 мг/г почвы (125 мкг N/r) и инкубируют при 25 С в течение 3 сут. Периодически отбирают пробы почвы (1 г) и определяют остаточное содержание аммония с

50 реактивом Несслера в солевой (КС1) вытяжке. Результаты определения приведены в табл.3.

руют при 25iO,l°C в течение 30 мин. После этого отбирают шприцем пробу воздуха, измеряют в ней концентрацию СО,, на газовом хроматографе и снимают резиновую пробку с флакона. В течение последующих 30 мин флакон инкубируют без пробки при той же температуре 25 С, затем флакон закрылиет-ри 1298246

вают пробкой егде торяют измерение ния СС , после чего инкубируют 30 мин

и повторяют измерение скорости образования COj, после чего инкубируют 30 мин без пробки и т.д. Всего проводят пять измерений скорости образования СО, через каждый час. Реэультаты определений приведены в табл.2. Результаты вычислений: р 0,03 , q 0,0201 мкг С/ч мкг С биомассы, биомасса микроорганизмов 299 мкг С/г почвы.

П р и м е р 3. Определение коли- Ч1е;с:тва микроорганизмов, окисляющих NH4.100 г почвы помещают в стеклянный кристаллизатор, вносят, сульфат аммоНИН в количестве 0,59 мг/г почвы (125 мкг N/r) и инкубируют при 25 С в течение 3 сут. Периодически отбирают пробы почвы (1 г) и определяют остаточное содержание аммония с

реактивом Несслера в солевой (КС1) вытяжке. Результаты определения приведены в табл.3.

Результаты вычислений: li 1,25 , Величину YV,S принимают равной 0,7 х10 клеток/мкг N. Величину биомассы нитрификаторов рассчитывают по формуле (2):Х 2,6610 клеток/г почвы или 0,35 мкг С биомассы/г почвы.

м е р 4. Определение биомассы денитрифицирующих микроорганизмов

100 г чернозема южного помещают в вакуум-эксикатор и инкубируют при в атмосфере чистого азота с нитратом калия. Количество вносимого субстрата денитрификации 2,5 мг/г почвы (ЗАО мкг N/r) время инкубации А сут (96 ч). Сразу после внесения сопи а также на 1-А сут инкубации отбирают пробы почвы по I г и определяют в них остаточное содержание NOj с дисульфофеноловой кислотой. Результаты определения приведены в табл.А.

Удельная скорость роста микроорганизмов |U в среднем равна 0,01 , учитывая, что экономический коэффициент для данной физиологической группы микроорганизмов ,67 г биомассы/г азота, получают величину q 3,7А 10 мкг N/Ч Мкг биомассы. Количество биомассы денитрифицирую- щих микроорганизмов равно О,92/3,7Ах ч10 или 256 мкг. ,

О

Пример 5. Определение проводят по примеру А, но с внесением в почву 0,5 мг/г нитрата калия (69 мкг N/r почвы), время инкубации 5 ч. Результаты определения приведены в табл.5.

Результаты расчета: (,09A ч q 3,52510 мкг N/ч мкг биомассы, X 238 мкг.

. Пример 6. Определение количества микроорганизмов в йочвб методом посевов.

1 г дерново-подзолистой почвы растирают в фарфоровой ступке, заливают 100 мл стерильной воды, диспергируют на улеьтразвуковом дезинтеграторе (0,2 А, 2 мин) и готовят серию развеч-Э

-

дений в стерильной воде

-,-5

(10

) 0,05 мл из каждого разведения наносят на поверхность агаризо- ванной среды (МПА, бульон, предварительно разбавлен в 10 раз), разлитой в чашки Петри. После 7-суточной инкубации прикомнатной температуреподсчиПредлагаемый способ как метод по севов, выявляет приблизительно равные запасы микробной биомассы в дву почвах, но дает не условные, а абсо лютные значения микробной биомассы. Кроме того, он позволяет найти причину более высокой ферментативной активности в черноземе: в этом почвенном образце численное значение q выше, чем в дерново-подзолистой почве. При этом выявляет только жиз неспособные и метаболически активны микроорганизмы (покояш 1еся микроор- ган измы не успевают прорасти на внотывают количество выросших колоний. Ре- 50 симом в почву субстрате за несколь- зультаты учетаЗ, клеток/г почвы.

ко часов измерений), рост микроорга низмов протекает непосредственно в почве, т.е. в естественных услови ях, что гарантирует точность и полноту учета.

Аналогично проводят определение количества микроорганизмов в образце типичного мощного чернозема. Результаты учета 3,110 клеТок/г почвы,

Пример. Определение биомассы клеток по скорости восстановления красителя тетразолиума.

5

10 г дерново-подзолистой почвы помещают в коническую колбу, вносят 10 мл 1%-ного раствора трифенил- те.тразолийхлорида (ТТХ) в О, М трис-НС1 буфера рН 7,6. Суспензию перемешивают и Инкубируют ванаэроста- те (разрежение 1 атм) при 37 С в течение 2 ч. Затем в колбу вносят 10 мл экстрагента (смесь ацетона, СС1 и этанола в соотношении 7:2:1), встряхивают, фильтруют через бумажный фильтр и измеряют оптическую плотность на спектрофотометре при 5А6 нм. По калибровочной кривой, свя- зьтающей оптическую плотность раствора с концентрацией формазанов (Ф) находят скорость реакции восстановления красителя 35 мкг Ф/ч-г почйы.

Аналогично проводят определение с образцом типичного мощногоtчернозема. Результаты определения 150 мкг Ф/ч-г почвы.

Таким образом, применение известного способа (пример 7) позволяет по- Лучить лишь условные величины микробной биомассы в единицах ферментативной активности - так назьшаемая де- гидрогеназная активность почв (ДА).

В черноземе ДА в А раза вьппе, чем в дерново-подзолистой почве, т.е. чернозем содержит в А раза больше микроорганизмов. Однако Метод посева выявляет приблизительно равное количество микроорганизмов в двух исследованных почвах.

Предлагаемый способ как метод посевов, выявляет приблизительно равные запасы микробной биомассы в двух почвах, но дает не условные, а абсо- лютные значения микробной биомассы. Кроме того, он позволяет найти причину более высокой ферментативной активности в черноземе: в этом почвенном образце численное значение q выше, чем в дерново-подзолистой почве. При этом выявляет только жизнеспособные и метаболически активные микроорганизмы (покояш 1еся микроор- ган измы не успевают прорасти на вно0

5

0

5

5

0 симом в почву субстрате за несколь-

50 симом в почву субстрате за несколь-

55

ко часов измерений), рост микроорганизмов протекает непосредственно в почве, т.е. в естественных услови- ях, что гарантирует точность и полноту учета.

Формула изобретения

Способ определения количества микроорганизмов в почве путем внесения субХ1трата в анализируемый материал, инкубирования, измерения начальной .-.корости потребления субстрата и последующего расчета количества микроорганизмов по отношению на- чапьной скорости потребления субст- рата к метаболическому коэффициенту, отличающийся тем, что, с целью повышения точности способа, используют ассимилируемые фор- мы .субстрата, субстрат вносят в количестве 0,5-2,5 мг/г почвы, инкубиВремя инку- бации, ч

5,0 5,05 5,21 5,32 5,46 5,6

Время инку- О 1 2 3 | 4 | 5 бации, ч

Скорость образования COj , мкг С/ч.г 6,0 6,2 6,4 6,5 6,8 7,0

Таблица 3

Время инкубации, чО 12 24 38 48 62 72

Остаточное содержание аммония, мкг N/r125 122 112 100 80 50 О

Скорость потребление аммония, мкг N/ч.г 0,25 0,83 0,86 2,00 2,14 5,0

Таблица 4 Время инкубации,ч О 24 48 72 96

Остаточное содержание нитратов, мкг N/r 340 318 284 246 200

Скорость потребления нитратов, мкг N/Г.Ч0,94 1,42 1,58 1,92

рование осуществляют в течение 5-, 96 ч, дополнительно измеряют скорость потребления субстрата в процессе инкубирования, а метаболический коэффициент определяют по формуле

1 din V

Ч -у dt- .

где V - скорость потребления-субстрата;

Y - экономический коэффициент; t - время инкубации. Таблица 1

Таблица 2

129824610

Таблица 5

Время инкубации, ч10| 2,5I 5,0

, ч J О 2,5 1 5,(

69,10 67,00 64,85

0,840,86

Изобретение относится к области микробиологии. Целью изобретения является повьшение точности способа. Непосредственно в почве измеряют количество микроорганизмов по скорости протекания микробиологического процесса. Для этого в почву вно- . сят субстрат, ассимилируемый микроорганизмами. Химическая природа субстрата диктуется задачей исследования, т.е. тем, количество каких микроорганизмов требуется определить. Для определения биомассы денитрифицирующих микроорганизмов в образец сгочвы вносят нитрат калия, для нит- рификаторов - сульфат аммония. Количество вносимого субстрата составляет 0,5-2,5 мг/г почвы. Продолжительность выращивания микроорганизмов зависит от удельной скорости их роста и составляет 5 - 96 ч. В исследуемые образцы почвы вносят субстрат и инкубируют при 25 С в ультратермостате. В процессе инкубирования измеряют скорость потребления субстрата. Рассчитывают метаболический коэффициент (q) по формуле 1:Y dlnVrdt, где V - скорость потребления субстрата; Y - экономический коэффициент; t - время инкубации. Разделив величину скорости потребления субстрата в начальный момент после внесения его в в почву на величину метаболического коэффициента, получают величину биомассы микроорганизмов г исследуемом образце почвы. Способ позволяет определять не условные, а абсолютные значения микробной биомассы, выявля- ет только жизнеспособные и метаболи-- чески активные микроорганизмы. Рост микроорганизмов протекает непосредственно в почве, т.е. в естественных условиях, что гарантирует точность и полноту учета. 5 табл. (Л