Способ индикации сообщества поч-ВЕННыХ МиКРООРгАНизМОВ Советский патент 1981 года по МПК C12K1/04 

1

Изобретение относится к микробио логии, а именно микробиологическому анализу почвы при воздействии на нее различными антропогенными факторами.

Известен способ индикации сообщества почвенных микроорганизмов путем инкубирования образцов почвы с последующим микробиологическим изучением микроорганизмов. По данному способу в почву закладывают предметные стекла и оставляют на определенный срок. Поверхность стекол обрастает микроорганизмами, и их микроскопируют в световом микрюскопе. Дранный способ позволяет определить- общее количество и биомассу микроорганизмов в почве 1 .

Однако известный способ недостаточно чувствителен, так как не дает информации о микробном соойцестве в целом, его структуре, соотношении отдельных групп микроорганизмов,взаимоотношении и взаимодействии медду отдельными популяциями микроорганизмов в сообществе, об истинном дамянировании тех или иных микроорганизмов .

Цель изобретения - повышение чувствительности способа.

Поставленная цель достигается тем, что образцы почвы перед инкубированием покрывают слоем крахмала, инкубируют в условиях постоянной температуры и влажности и исследуют выросшие на поверхности крахмала микроорганизкйл с помощью сканиру1эщей электронной микроскопии.

Пример..Исследуемую почву в воздушно-сухом состоянии растирают в ступке, предварительно удалив крупные корешки, просеивают через сито в 1 мм, увлажняют дистиллированной

йодой до 60% от полной влагоемкости, добавляют, если нужно, изучаемый агент вместе с водой и тщательно перемешивают. Пастообразную массу вросят в чашки Петри диаметром 4 см и

слегка уплотняют шпателем так, чтобы образовалась ровная горизонтальная поверхность. Чашки с почвой помещают в обычно используемые в микробиологни чашки Петри диаметром 10 см.

На дно большой чашки Петри наливгиот дистиллированную воду для йоддержания постоянной влажности. В таком состоянии чашки вьщерживают в термостате при температуре 25с в течение

всего опыта.

Так как микроорганизмы в почве находятся в рассеянном состоянии, то их инициируют субстратом. Испытание большого числа различных органических субстратов показывает, что наиболее удобным является картофельный водорастворимый крахмал. Так Как не существует специфической микрофлоры, разрушающей крахмал, его может ис-пользовать самый широкий набор почвенных микроорганизмов/ что видно из практики использования в микробиологии крахмало-аммиачного агара. Кроме того, крахмал нельзя считать чужеродным материалом для почвы, он является основным запасным полисахаридом растений. Особенно велика роль крахмала в почвах агроценозов.

KpaxMcui наносят через неделю после выдерживания увлажнённой почвы в термостате. Наносят на поверхность почвы полоской, шириной около 1 см по диаметру чашки. Производится зто следующим образом.

На тонкий слой крахмала осторожно накладывают два чистых листа бумаги, чтобы щель между ними была равна 1 см чашку с почвой, переворачивают и аккуратно по диаметру чашки прикладывают на 1 с к образовавшейся полоске. Затем быстро сдувают лишнее количество крахмала охатым воздухом, так чтобы на почве осталась тонкая полоска не более 2-3 слоев крахмальных эГерен. При таком способе нанесения концентрация крахмала составляет около 0,05% от веса почвы.За развитием микроорганизмов на полоске крахмала проводят регулярное наблюдение (визуальное), документируя макросъемкой в масштабе 1:1 на цветную обратимую фотопленку. В дальнейшем эти фотографии позволяют воссоздать последовательность развития микробного сообщества. Наблюдение за развитием микробного сообщества проводят с помсяцью светового микроскопа в отраженном свете при увеличениях от 5 до 50 крат, фотографируя отдельные участки.

Для детального наблюдения за амилолитическим микробным сообществом используют сканирующий злектронный микроскоп. Техника взятия образцов сводится к следующему. Из почвы вырезают цилиндрический монолит площадью 0,5 см с тем объектом н.а поверхности J который необходимо микроскопировать. Монолит наклеивают электропроводящим клеем на объектный столик микроскопа. Образцы фиксируют в парах четырехокиси осмия в течение суток над 2%-ным раствором. Япя обезвоживания образцов в большинстве случаев применяют воздушную сушку при комнатной температуре в течение суток. В случае, если микробные клетки сильно деформировались при воздушной сушке, применяют лиофильное высушивание из замороженного состояния.

Для зтого почвенный монолит помещают в жидкий фреон и высушивают при постоянном, охлаждении в вакуумном универсальном посте. При микроскопировании чистых культур отдельных микроорганизмов проводят их фиксацию 2,5%ным раствором глютаральдегида в фосфатном буфере ,2) при в течение часа. Затем образцу промывают

буфером 30 мин при . Обезвоживание производят в серии растворов этанола при 50%-ный раствор спирта 30 мин, 70%-ный 30 мин, 90%-ный 1 час 90%-ный 12 ч, 95%-ный 30 мйн, 95%ный 30 мин, 100%-ный трижды сменяют спирт через 30 мин. Далее замещают спирт на .амилацетат, йлсушивание обр.азцов проводят по критической точке, замещая амилацетат.жидкой углекислотой на установке НСР-2. Напыление об разцов углеродом и золотом проводят в вакуумном испарителе. Толщина напыляемого слоя приблизительно 100 А. Просмотр препаратов проводят в сканирующем электронном микроскопе.

Под контролем наблюдения в световом микроскопе проводят выделение отдельных микроорганизмов с полоски крахмала на твердые питательные среды с помощью препаровальной иглы. Для вьщеления микромицетов используют агаризованную среду Чапека, для бактерий и актиномицетов - крахмалоаммиачный агар, для дрожжей - суслоагар. В большинстве случаев удается выделять организмы сразу в чистые культуры, так как подавляющая часть микроорганизмов развивается достаточно обособленно.

Для сбора почвенных беспозвоночных применяют традиционный метод воронки. Через фильтр из мельничногогаза нематоды выгоняют водой, а клещи - светом и фиксируют спиртом.

С помощью данного способа оценено микробиологическое состояние 2-ух типов почв при воздействии ряда антропогенных факторов. В дерново-подзолистой почве - влийние различных доз аммиачной формы азотных удобрений сульфата аммония, в черноземе - .загрязнение почвы различными концентрациями соли свинца (свинцом азотнокислым) .

Првдлагае1|«лй способ позволяет выявить различные группы микроорганизмовчленов инициированного микробного сообщества различных почв. Прокариотные микроорганизмы- бактерии можно встретить в инициированном микробном сообществе, как правило, на поздних стадиях развития, через несколько месяцев. Бактерии часто развиваются на отмерших грибных гифах. Кроме бактерий, хорошо колонизирукядих субстрат, можно встретить стебельковые бактерии в рассеянном состоянии. Видовая идентификация бактерий очень сложна и трудоемка. Выявляемые с помощью сканирукицего электронного микроскопа морфологические особенности отдельных бактерий позволяют проводить их предварительную групповую идентификацию. Так как эти организмы не являются доминантам в инициированном микробном сообществе, предварительноIEO разделения на группы часто вполн. достаточно.

Актиномицеты также являются членами амилолитического микробного сообщества, особенно на ранних стадиях его развития. Эти микроорганизма морфологически характеризуются хороию развитым и однородным по толщина мицелием и ярко выраженными спиральными йпороносцами, состоящими из отдельных спор. Эти организмы часто развиваются отдельными микроколониями и легко могут быть вычленены в чистую культуру. Предварительная идентификация возможна и баз выделения в чистую культуру.

Основными деструкторами крахмала являкггся микроскопические грибы. Степень покрйтия крахмала микромицетами чаще всего приближается к 100%, и они всегда ввделяются как доминанты инициированного микробного сообщества. Многие из них не всегда удается выделить на питательные среды, и тогда данные электронно - микроскопического анализа, выявляющие большое количество морфологических особенностей данной группы микроорганизмов, являются единственным источником информации для их идентификации. Представители рода Реп i с ПIi urn хорошо выявляются благодаря своему характерному строению конидиального аппарата. Плодовые тела сумчатых грибов рода Chaetomium имеют на своей поверхности характерные выросты,что облегчает их предварительную идентификацию. Для выделения сумчатых грибов в чистую культуру необходимоиспользовать специфические среды, содержащие клетчатку. Пикнидиальные несове яиенные грибы трудно вьщелить в чистую культуру, и их идентификаци может быть осуществлена на основе мофологических особенностей, выявляемых с помощью электронного микроскопа.

Дрожжевые организмы также могут быть членами инициированного Микробного общества, причем они могут занимать значительные пространства и являться доминантами микробного сообщества на более поздних стадиях его развития. В морфологическом отношении дрожжи являются более однородной группой, но по своим размерам они могут сильно варьировать. И даже в этой группе микроорганизмов сканирующий электронный микроскоп выявляет много морфологических особенностей, к сожалению, недостаточных для их идентификации. В то же время по микрофотографиям можно судить о состоянии дрожжей в данном сообществе.

На более поздних стадиях развития (через несколько месяцев) инициированного микробного сообщества, когда с частично уже прошла минерализация крахмала, можно встретить и автотрофные микроорганизмы, т.е. диатомовые водоросли класса Centricae и класса Pennatae. Особенно много водорослей 1 проявляется при проведении их на свету. Выявляемые на микрофотографиях морфологические особенности дают ценную информацию для идентификации этих организмов.

Следующей группой в инициированг 5 JIOM микробном сообществе являются . Тсонсументы второго порядка-организ;мы,поедё1ющие первичных потребителей крахмала.К этой группе /ложно отнести разнообразных представителей простейших и микроскопических беспозвоночных животных.Видовое разнообразие этой группы обычно невелико,Наблюдения свидетельствуют,что раковинные амебы отряда Testacida и рода Cent5 гррух is питаются главным образом дрожжами и встречаются только при интенсивном развитии последних.Нематоды из группы микроскопических кольчатых червей отряда Tylenchidae и Q микроартроподовые клещи семейства lAcaridae одинаково хорошо питаются как дрожжевыми клетками,так и микроскопическими грибами и актиномнцетами.Причем нематоды избирательно поедают только грибной мицелий,в то вре5 .мя как клещи могут питаться как мицелием грибов,актиномицетов,так и их спорами. Идентификация этой группы проводится на основе морфологических особенностей, выявляемых с помощью 0 светового .и электронного микроскопов. Эти микроорганизмы завершают пирамиду структуры микробного амилолитического сообщества и встречаются в нем на более поздних этапах, обычно после с Месяца инкубации.

Предлагаемый способ позволяет с большой степенью достоверности определить всех представителей иницииро- ванного микробного сообщества (бактеQ рий, актиномицетов, грибов, водорослей, простейших, микроскопических беспозвоночных), что нельзя сделать ни одним из известных способов. Способ позволяет изучить не только структуру, но и особенности инициированного микробного сообщества, т.е. ис тинкое доминирование, соотношение отдельных групп микроорганизмов, вза имодействие и взаимоотношения между iOтдeльными популяциями микроорганизO :мов в сообществе, биологические осо|бенности доминирующих организмов, скорость и характер роста отдельных -популяций микроорганизмов в соойществе и их сукцессию. Совокупность этих 5 показателей служит критерием для объективной и интегральной оценки влияния различных антропогенных загряз-; нений на истинное микробиологичвекоа состояние почвы.

Формула изобретения

Способ индикации сообщества почвенных ишкроорганиэмов путем иккубирования Образцов почш с послевУПф1М ьсккробиологическим исследоваммем микроорганизмов, о т л и ч а щ м й- с я тем, что, с целью повышения чув1 ствнтельности способа, образцы почвы перед инкубированием покрывают слоем крахмала, инкубируют в условиях постоянной температуры и влажностж и исследуют выросшие на поверхности К9)тял« м1срооргаииз « с помощью сканярую1йей электронной микроскопии.

Ксточники информации, ПРЙЯЯПМ во внимание при экспертизе

ЛШабьева И.О., Агре и.С. Практическое руководство по биологии почв. М., Изд-во МГУ, 1971, с. 2223.