Способ исследования микроструктуры образца Советский патент 1991 года по МПК G01N21/64 

Изобретение относится к оптике н может быть исполЕ зовано в микроскопии высокого.разрешения, применяемой в биологииJ физике И технике,

Целью изобретения является исследование микроструктуры внутренних областей образца о

Предлагаемъ Й .способ иллюстрируется чертежом,i

Сущность изобретения заключается в том, ЧТО возбуждают люминесценцию o6pa3uaj помещенного в поле нескольких стоячих световых волн, вызывающих тушение люминесценции из-за вынужденных переходов из люминесци гующего : состояния в короткоживущие состояния всюду5 кроме малых окрестностей то- чек, в которых вызывающая переходы в короткоживущее состояние компонента поля (вынуждающая компонента поля) стоячих волн обращается в ноль. При этом размеры окрестностей точек, в которых тушения люминесценции не происходит уменьшаются с увеличением интенсивности поля стоячих волн, а положение точек, в которых падения люминесценции не Происходит, задает-

,ся условием, что образующие каждую КЗ стоячих вслк две бегущие ког ерект

ные волны имеют вьш1,гждаю цке конпонен™ TbSj, находящиеся в-протквофазвс

Можно сказать,.что размер получав мой области люминесценции

- .ьТЛ

Для реализации способа используется схема, показанная на чертеже. Вокруг образца 1 располагаются три канала, содержащих источники 2 3 и 4 слабофокусированного излучения и зеркала 5,6,7, создающие три взаимно перпендикулярные стоячие световые вол- ны, тушащие люминесценцию за счет вынуждеиного. излучения, система оптического возбуждения (освещения) образца или его части, содержащая источник 8 излучения и фокусирующее устройство 9, и система регистрации включающая микроскоп 10, светофильтр. 11 и , приемник 12.

При исследовании двумерных объектов (пленки, ультратонкие среды) один из каналов можно убрать.

Образец окрзшей молекулами люминофора (хромофора)5 имеющими наряду с люминесцирующим возб жденвьм .состоянием короткоживущие незаполненные возбужденные состояния или незаполнеиные колебательные подуровни основного состояния. Элементы для созданий стоячих волн включают источники 2,3,4 слабосфокусировэнного когерентного излучения и установленные перпендикут

ля-рно осям-пучков когереитного излучения зеркала 5,6,7. Необходимая ми- ниа альная длина когерентности L мд ,определяется из .требования устойчивости положения нулевых йлоскостей стоячих волн; .

МНК

И/йг,

Изобретение относится к оптике. Целью является исследование микроструктуры внутренних областей образца. Для уменьшения размеров создаваемой внешним светом области люминесценции, определяющих предельное разрешение сканирующих микроскопов j создают дополнительное поле Излучения с компонентой, уменьг5як;щей населенность возбужденного состояния вещества. Причем пересечение нескольких .стоячих волн происходит в заданной точке, в которой для каждой пары образующих стоячую волну когерентных бегущих волн удовлетворяются условия 1, Ч,-Ч г ft s г Де I, и 1 - интенсивности бегущих волн; tf, и - фазы компоненты бегущих волн, уменьшающей населенность возбужденного состояния вещества. Размер получаемой области люминесценции и достижимое разрешение сканирующего микроскопа определяется соотношением Л г -А /2 п 4b/ci где Л - .длина волны дополнительного излучения; В - вероятность спонтанных переходов из возбужденного состояния; с1 - вероятность вынужденных переходов из возбужденного состояния в точках максимума интенсивности дополнительного излучения. 1 ил..

где К - длина волны дополнительного излучения; b - вероятность спонтанных a-cl - BepoflTHocTjj вынужденных переходов из возб: гягдениого состояния. Создание малой области люминесценции вшнуж,дающим дополнительным нзлу- .ением стоячих волн возможно для образцов, в которых для некоторых типов молекул можно р еализовать уменьшение заселенности возбужденного сосг Тояния световым воздействием. Такие образ1Ц)1 должны быть хотя бы частично прозрачны для инициирующего ( даюцего) излучения, тушащего дополпи- TejibHoro излучения и излучения спонтанной люминесценции. Нужными свойствами обладает широкий класс веществ кристаллов, стекол, растворов- органических красителей и т.д., в частности веществ, близких к используемьм в рабочем теле лазеров.

где 1 - расстояние от зеркала до объекта; длина волны; & г - предельный ра зрешаемый размер,

Например, при h 6000 А| 1«1 см; &г 60 А имеем Ь;цц„ 100 см. Для достаточной устойчивости нулевых плоскостей стоячих волн требуется также чтобы максимальный угол флуктуации направления пучков света от ИСТОЧНИКОВ 2,3,4 был равен

50

55

&Ч мокс 4& АГ

о например, при иг 60 AS, 1 « 1 см

требуется 3-10 рад. Излучение источников ,4 должно лежать а полосе испускания использованного в образце красителя, но не попадать в полосу поглощения красителя. Например, для случая водного раствора родамина 6G длина волны % источнйкоа 2,3,4

должна лежать в интервале 620 им . ft tyOO нм; для флуоресцина - Na - в интервале 500 чм « X 600 нм, для ацетиламинопирентрисульфата - в интервале 450 500 нм.

Зеркала 5,6,7 расположены на элек- трострикцнонных устройствах, обеспечивающих малые перемещения зеркал. Система опти есхого возбуждения включает источник 8 излучения и фокусирующее устройство 9. Длина волны источника излучения должна лежать в полосе поглощения используемого красителя. Например, для родами- На 6G максимум поглощения соответствует 510 нм, для флуоресцеина - Na - 480 нм, для ацетиламинопирентрисульфата - 360 нк. Система регистрации свечения включает микроскоп 10,светофильтр 11 (монохроматор) и приемник 12. Светофильтр 11 пропускает лишь излучение в полосе испускания (флуоресценции) красителя, в более коротковолновой области5чем та, в которой имеется излу«4ение источников 2-4, и в более длинноволновой области, чем область излучения источника 8.

Пример Предлагаемый способ реализуется следующим образом.

Для определения плотности молекул люминофора в окрестности некоторой точки образца устанавливают зе;жапа 5,6,7 таким образом, чтобы узловые плоскости всех трех стоячих волн со- держйли некоторую точку образца.Длиннофокусные устройстваJ являющиеся частью источников 2-4 слабосфокусированного когерентного излучения, регулируются так, чтобы сходящиеся пучки отраженного от зеркал 5-7 излучения, имеющие несколько меньшую мощность, чем пучки падающего излучения (коэффициенты отражения зеркал 5-7 меньше единицы), имели в окрестности требуемой точки образца плотность излучения, близкую к .плотности излучения падающего njrqKa в этой окрестности.

При измерении включают источник ко коротковолнового освещения 8, вызывающий переход молекул люминофора в об

10

20

25

ig

374922

резце

4

30

35

40

45

1 в возбужденное состояние, и источники 2-7 более длинноволйовогй вынуждающего излучения, после чего система 10-12 регистрирует спонтан ное излучение заданной малой области образца, пропорциональное плотности люминофора в этой области, ,

Определив плотность молекул люминофора в одной точке образца, следует, подав на электрострнкциокные устройства, к которым прикреплены зеркала новое Напряжение, сдвинуть зеркала на заданную велргчину вдоль осей пучков света источников 2-4 и повторить измерение плотности люминофора в точке, сдвинутой от предыдущей таким образом, чтобы расстояния до зеркал остались н еизменными. Получаемая трехмерная карта плотности молекул, поглощающих на длине волны источника 8 и излучающих в области чувствительности приемника н будет итоговым изображением объекта.

ФормуЛа изо.бретения

Способ исследования микроструктуры образца путем создания в нем области .ттюминесценции с размерай 5 много меньше длины волны возбуждающего излучения, включающий возбуждение светом области, содержап1,ей заданную точ- ку поверхности образца, отличающийся тем, что, с ,елыо исследования микроструктуры 1-,г; Тренних областей образца, создают доно.инитель- ное поле излучения с, ком)онентой, уменьшающей населенность возб ,ткденно- го состояния вещества, путем пересечения нескольких стоячих яолн в заданной точке, в которой для ка;к,цой пары образующих стоячную кот еректных бегущих волн yAonjTeTtnopHioTCH условия

I, .,.

где I, и 1 - интеисипипсти бегущих волн; Lf, .ntpj- фазы компсшс-нт бегущ1-гх волн, уменьшающих цаселсиш сть EOS- бужденного С(;)стоян1 я ве .щ с. гра.