Способ культивирования мицелиальных грибов - продуцентов рибонуклеаз Советский патент 1990 года по МПК C12N9/22 C12N1/14 C12N9/22 C12R1/645 

(46) 30.08.90. Бюл. № 32 ; i

(21)4080583/31-13

(22)23.06.86

(71)Институт элементоорганических соединений им. Л«Н. Несмеяновй

АН СССР А Институт биохимии

им. А.Н. Баха АН СССР,

(72)И.М. Тавобилов, В.И. Лозинский, Р.Ж. Манолов (BG), Е,С, Вайнерман, С.И. Безбородова, С.В. Рогожин

и A.M. Беэбородов

(53)557.15(088.8)

(56) Авторское свидетельство СССР В 1008214, кл. С 08 J 9/26, 1982. .

Безбородова С.И. и др,.Рибонуклео деполимеризующая активность Asper- gilluis clavatus Deem. Микология и фитопатология, 1960, т. 3, с. 518- 521.

(54)СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МИЦВЛИ- АЛЬНЫХ ГРИБОВ-ПРОДУЦЕНТОВ РИВОНУКЛЕАЗ

. (57) Изобретение относится к прикладной, микробиологии, конкретно - к способу повьшения продуктивности, клеток, секретирующих рибонуклеазы (РНКазы). Изобретение может быть использовано в отраслях промьшшенности, произво дящих биохимические препараты, а также в научных исследованиях. Цель изобретения - повышение выхода РНКаз Согласно изобретению, культуры грибов выращивают на агаризованных средах до. получения спорового материала. Споры иммобилизируют в криогеле 7,5- 15%-ного поливинилового спирт а (ПВС) путем замораживания суспензии спор в водном растворе ПВС при температуре от -10° до в течение 8-24 ч с последующим размораживанием. Споры

; проращивают и культивируют в иммобилизованном состояний в питательной среде, содержащей источник углерода, ; минеральные компоненты н воду, 1 табл. S

(Л

Изобретение относится к прикладной микробиологии, конкретно к способам культивирования мицелиальных грибов, способных в определенных ус- ловиях секретировать во внеклеточную среду ферменты, деполимеризугощие рибонуклеиновые кислоты. Изобретение может быть использовано в отраслях промышленности, производящей биохимические препараты, а также в научных исследованиях.

Цель изобретения - повышение выхода целевого продукта.

Изобретение осуществляют следую- щим образом.

1. Получение спор мицелиальных грибов - культуры грибов вьфащивают в тйчение 7-9 сут при 25-27 С на агаризованной среде состава, г/100 мл: сахароза 3,0; NaNO, 0,2} 0,1; MgS04-7HjO 0,05; КС1 0,05; FeSO, 001 агар 2,0. Образовавшиеся споры смывают стерильной водой.

2) Иммобилизация спор в частицы криогеля 7,5-15%-ного поливинилового спирта (ПВС) - эта стадия осуществляется приготовлением суспензии спор в водном растворе ПВС и замораживанием порций полученной суспензии при температуре от -10 до -АО С в течение 8-24 ч с последующим размораживанием образцов. В ре1зультате получают частицы криогеля ПВС с иммобилизованными в них спорами того или ино

го мицелиального гриба.

3) Проращивание спор - для этого частицы криогеля ПВС с включенными в них спорами помещают на 48-50 ч при 25-27 С в питательную среду следующего состава, г/100 мл: глюкоза 3,0; соевая мука р,50;пептон 1,0; KN05-0, MgSO -7НаО 0,05; 2НгО 0,01,

ft) Инкубация иммобилизованных клеток в питательной среде - данная ста- дия может осуществляться как в реакторе стационарного режима с периодической сменой питательной среды, так и в реакторах проточного типа, . Частицы криогеля ПВС с включенными проросшими клетками мицелиального гриба-продуцента РНКаз загружают в . стерильный реактор (возможно также проращивание спор непосредственно в том же реакторе) и заливают питательной средой следующего состава, г/100 мл: глюкоза 5,0 (NH4)2SO 0,75; KNO, 0,2; КН,РО 0..017, MgS04 7HjO 0,05; CaCli 2Нг,0 0,02,

Q

5

0

5 Q

5

j

0

5

В случае проточного реактора питательную среду подают непрерывно. Куль- туральную жидкость (элюат из проточного реактора), содержащую секрети- рованные иммобилиэо-ванными клетками РНКазы, собирают и далее обрабатывают известными приемами йыделения и очистки целевых ферментов.

Иммобилизация ке клеток мицелиального гриба, а его спор, позволяет, во-первых, равномерно распределить микроорганизмы в гелевом носителе, и, во-вторых, это дает возможность не только сохранить биологи- . ческую активность клеток в иммобилизованном виде. Но и повысить их продуктивность в отношении секреции рибонуклеаз.

Применение в качестве носителя иммобилизованных клеток криогелей ПВС, обладающих развитой макропористой структурой, позволяет, с одной стороны, легко прорастить споры ми- целиального гриба после формирования частиц геля, а с другой - обеспечить живым клеткам благоприятные условия подвода питательных веществ и отвода метаболитов. При концентрации ПВС в криогеле ниже 7,5% механическая прочность частиц с включенными клетками мицелиальньсх грибов становится неудовлетворительной для реакторов с перемешиванием, а использование криогелей с концентрацией полимера вьш1е 15% нецелесообразно из-за большого расхода гелеобразователя.

Температура стадии иммобилизации спор мицелиальных грибов в криогели ПВС зависит от концентрации раствора полимера-гелеобразователя, объема замораживаемых порций и имеющегося холодильного оборудования. В предла гаемом изобретении режимы данной стадии выбраны на основании экспериментов и составляют по температуре от -10 до -40 , по времени - от 8 до 24 ч.

Пленки поливинилового спирта не обеспечивают необходимой для прорастания мицелия макропористости; Сшитый посредством УФ-облучения гель ПВС также непригоден для выращивания микромицетов, т.к при облучении устрачивалась способность конидий к прорастанию кпи наблюдалось снижение активнос ти РНК-азы.

Таким образом, криогель ПВС по сравнению с другими способами иммобилизации обеспечивал оптимальные условия для жизнедеятельности мицели- альных грибов - продуцентов РНК-аз.

Состяв питательных сред для получения спор мицелиальньгх грибов, для проращивания иммобилизованных спор и для секреции РНКаз иммобилизованными проросшими клетками, а также температура и продолжительность этих стадий определены экспериментально. Приводимые составы питательных сред и условия процессов являются опти-. мальными для используемых микроорганизмов.

Изобретение поясняется примерами

Пример 1. Культуру гриба Aspergillus clavatus 229719 выращивают при 25 С в течение 9 дне на агаризованной среде состава, г/100 мл: сахароза 3,0 NaNO, 0,2; KHjPO 0,1; 0,05-, KCl 0,05; FeSO 0,001, агар 2,0. Образо.- вавшиеся споры смывают стерильной водой и перемешивают смыв в течение 5 мин в миксере, после чего доводят концентрацию опор до 440 спор на мл жидкости с помощью стерильной воды.

5 мл водной суспензии полученных спор смешивают- с 45 г водного раствора ПВС, содержащего 3,75 г полимера. Порции полученной суспензии объемом по 250 МП замораживают при -10 С в течение 24 ч. После оттаивания полученные частицы 7,5%-ного криогеля ПВС с включенными спорами промывают трижды стерильной водой.

Полученные частицы криогеля ПВС с включеннь 1И спорами помещают на 48 ч при 25°С в питательную среду состав г/100 мл: глюкоза 5,0; соевая мука 0,5, пептон 1,0i KNO, 0,2; MgSO « 0,ОЬ ; CaClj-2HjO 0,01.

астицы криогеля с проросшими иммобилизованными клетками помещают в питательную среду состава, г/100 мл: глюкоза 5,0,- (Ш4)г504 О,,75, KNO, 0,2, 0,ОМ7, MgS04 0,05, 0,02. Инкубируют при 25°с в течение 12 сут, меняя среду через каждые три дня. Суммарный выход РНКазной активности

0

5

0

5

за 12 сут функционирования иммобилизованных клеток составил 10250 ед.ак т, на грамм сухого мицелия, в то время как свободные клетки в тех же условиях были способны секретировать РНКазы только в течение 3 сут, а суммарный выход РНКазной активности составил для них 1770 ед„акт. на грамм сухого мицелия.

В таблице представлены данные по- выгсоду РНК-аз .в зависимости от продуцента и условий культивирования.

Преимущества изобретения заключа- ютел в том, что повьшение выхода РНКаз достигается не за счет трудоемкой селекции штаммов продуцента, а за счет увеличения сроков продуктив- ного функционирования клеток, что позволяет получить хороший выход активности РНКаз даже в случае не очень активных штаммов (см. №№ 5 и 10 в табл.). Данное обстоятельство важно в случае продуцентов, секретн- рующих РНКазы с ценной для практических целей субстратной специфичностью.

Улучшение технологичности процесса достигается как простотой отделения клеток от культуральной жидкости при смене среды в реакторах стационарного режима, так и непрерывностью процесса в случае использования реакторов проточного типа

Формула изобрет.ения

Способ культивирования мицелиаль- ных грибов - продуцентов рибрнукле- Q. аз, предусматривающий получение спорового материала продуцента, проращивание его и последующее глубинное куль тивирование в питательной среде,

содержащей источники углерода и, азота, минеральные соли и воду, о т- личающийся тем, что, с целью повьш1ения выхода целевого продукта, споровый материал мицелиаль- ных грибов перед проращиванием иммобилизуют в частицы криогеля поливинилового спирта путем замораживания в 7,5г15%-ном водном его растворе с по- следующим размораживанием,

0

5

5

0

51405310

Выход РНК-аз и зависимости от продуцента и условий

иммобилизации

1а Aspergilм - . д

Способы культивирования продуцентов РНКаз: стационарный режим - la, - б, г; За, в; 4а, б; 5а, в,- бб, в; 7а, б; 8а, BJ 9а, б , 10а, б и 11а, в, культивирование в реакторе проточного типа - №№ 1в, 36, 56, 6а, 86 и 116.

1405310

8 Продолжение таблицы