Способ определения гепарин-кофакторной активности антитромбина ш в плазме крови,содержащей гепарин Советский патент 1989 года по МПК A61K35/16 

СЛ

Изобретение относится к гематологии. Цель изобретения - повышение точности. В пробирку вносят гепарин, раствор тромбина и дефибринированную плазму пациента. Соотношение объема плазмы к общему объему смеси равно 1:11, а содержание гепарина 3,0-3,6 ед/мл смеси. Смесь инкубируют. В смесь добавляют раствор эуглобулиновой фракции донорской плазмы крови и регистрируют время образования сгустка. Образцы зуглобулиновой фракции стабилизированы этилендиаминтетраацетатом, их можно хранить в течение 7-10 дней.

1

Изобретение относится к медицине, в частности к гемокоагулогии, и может быть использовано при лабораторной диагностике нарушений свертывания крови.

Целью изобретения является повышение. точности.

Способ осуш,ествляют следующим образом.

Получение дефибринированной обедненной тромбоцитами плазмы исследуемого: из локтевой вены в пробирку забирали кровь с 3,8%-ным раствором лимоннокислого натрия (9:1). Кровь центрифугировали при 1500 об/мин 7 мин. Снимали богатую тром- бицитами плазму и вновь центрифугировали при 4000 об/мин 20 мин. Надосадоч- ный слой снимали, полученную обедненную тромбоцитами плазму прогревали при 56° 6 мин, затем центрифугировали при 4000 об/мин 20 мин. Надосадочный слой - обедненную тромбоцитами дефибринированную плазму снимали для проведения исследования.

Получение контрольной обедненной тромбоцитами плазмы: образцы обедненных тромбоцитами плазм, полученных от 10 здоровых доноров, смешивали в равных объемах.

Получение раствора эуглобулиновой фракции: в пробирку наливали 8 мл дистиллированной воды, 0,18 мл 1%-ного раствора уксусной кислоты и 0,5 мл контрольной обедненной тромбоцитами плазмы. Полученную смесь инкубировали 30 мин при +4°С, затем центрифугировали 5 мин при 1500 об/мин. Надосадочную жидкость удаляли, осадок растворяли в смеси 0,1 мл 1 %-ного раствора этилендиаминтетрауксусной кислоты и 0,4 мл буфера Михаэлиса рН 7,8. Образцы эуглобулиновой фракции можно готовить заблаговременно и хранить их 7-10 сут. Для этого полученный осадок эуглобулиновой фракции хранится при (-20)°С, а непосредственно перед использованием его размораживают и растворяют в указанной смеси.

Од

1

а

N9

Построение калибровочной кривой проводили по соотношению скорости образования сгустка в смеси с контрольной плазмой и разведения этой плазмы. В качестве контрольной использовали обедненную тром- боцитами донорскую плазму, принимая ее активность за 100%, разведение в 2 раза - 50%, в 4 - 25% и в 8 раз - 2,5%.

Ход определения. В отдельную пробирку вносили 0,1 мл раствора гепарина концентрацией 10-12 ед/мл, 0,2 рабочего раствора тромбина с активностью 4-5 с и 0,03 мл дефибринированной, обедненной тромбоцитами плазмы исследуемого. Полученную реагирующую смесь, в которой соотноше- ние объема исследуемой плазмы к общему объему смеси равно 1:11, а содержание гепарина 3,0-3,6 ед/мл смеси инкубировали при 37°С 3 мин, затем добавляли 0,2 мл раствора эуглобулиновой фракции и тотчас вклю- чали секундомер. Регистрировали время образования сгустка. По калибровочной кривой

определяли гепарин-кофакторную активность AT III в плазме крови (%).

Воспроизводимость способа ,3, известного способа ,6%.

Формула изобретения Способ определения гепарин-кофактор- ной активности антитромбина III в плазме крови, содержащей гепарин, путем получения обедненной тромбоцитами плазмы, инкубации ее с тромбином с добавлением избытка гепарина и вещества, индуцирующего образование сгустка, и регистрац ии времени образования сгустка, отличающийся тем, что, с целью повышения точности, плазму дополнительно дефибринируют, гепарин добавляют в концентрации 3,0-3,6 ед. на 1 мл смеси при соотношении объемов плазмы и смеси, равном 1:11, а в качестве вещества, индуцирующего образование сгустка, применяют эуглобулиновую фракцию донорской плазмы крови, стабилизированную эти- ленди аминтетраацетатом.