Способ определения активности антитромбина- @ в плазме крови Советский патент 1989 года по МПК G01N33/86 

j

(20 А231374/28-14

(22) 17.04.87

(46) .89. Бюл. № 34

(71)Московский медицинский стоматологический институт им. Н.А. Семашко

(72)В.Н. Александров, Г.Н. Будякова, И. Г. Бобринская, Т .И. Таранова

и Л.Ф. Кармолина

(53).07(088.8)

(56)Hensen А., Loeliger Е.А. Anti- thrombin III: Its metabolism and its function in blood coagulation. Stuttgart, 1963. In Abildgaard U.5 Gra- vem K., Godal H. Thromoos, Diathes, Haemorrh., -1970, v 24, N 1/2, p. 224.

(54)СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ АНТИТРОМБИНА -111 В ПЛАЗМЕ КРОВИ

(57)Изобретение относится к медицине, в частности к гемокоагулологии, и может быть использовано при диаг- ностн нар т11ений гемостаза. Целью изобретения является повышение точности способа. Для этого исследуемую

плазму смешивают со стабилизатором. Затем из нее путем центрифугирования осаждают тромбоциты. Обедненную тромбоцитами плазму дефибринируют нагреванием до на водяной бане. Затем к раствору тромбина, прогретого на водяной бане при 37 С в течение 2 мин, добавляют исследуемую плазму, инкубируют смесь. Прогревают фибриноген и вносят в него смесь тромбина и плазмы, сразу отмечая время начала реакции, определяют время образования сгустка фибрина, дополнительно проводят пробу с добавлением 0,01-0,02 мл 1%-ногО раствора протаминсульфата или 1,0-1,5 мг на 1 мл смеси полиб- рена. Строят калибровочную кривую для обеих проб а расчет активности антитромбина-111 проводят с учетом данных дополнительной пробы. Способ позволяет более точно определить активность антитромбина-111, кроме того, он прост и воспроизводим в любой биохимической лаборатории.

W

Изобретение относится к медицине , в частности, к гемокоагулологии, и может быть использовано при диагностике нарушений гемостаза. Целью изобретения является повышение точности способа. Для этого исследуемую плазму смешивают со стабилизатором. Затем из нее путем центрифугирования осаждают тромбоциты. Обедненную тромбоцитами плазму дефибринируют нагреванием до 56°С на водяной бане. Затем к раствору тромбина, прогретого на водяной бане при 37°С в течение 2 мин, добавляют исследуемую плазму, инкубируют смесь. Прогревают фибриноген и вносят в него смесь тромбина и плазмы, сразу отмечая время начала реакции, определяют время образования сгустка фибрина, дополнительно проводят пробу с добавлением 0,01-0,02 мл 1%-ного раствора протаминсульфата или 1,0-1,5 мг на 1 мл смеси полибрена. Строят калибровочную кривую для обеих проб, и расчет активности антитромбина-3 проводят с учетом данных дополнительной пробы. Способ позволяет более точно определить активность антитромбина-3, кроме того, он прост и воспроизводим в любой биохимической лаборатории.

Изобретение относится к медицине, а именно к гемокоагулологии, и может быть использовано в клинико-диагностических и научно-исследовательских лабораториях при диагностике нарушений гемостаза.

Цель изобретения - повышение точности способа за счет проведения дополнительной пробы с добавлением к де- фкбринированной бедной тромбоцитами плазме протаминсульфата или полибре- на и определения времени образования

:л

70

сгустка в присутствии тромбина и фибриногена (для представления активности антитромбина-111 в процентах строится калибровочная кривая).

Способ осуществляется следующим образом.

Исследуемую плазму смешивают со стабилизатором в обычном соотношении. .Затем из нее путем центрифугирования осаждают тромбоциты. Обедненную тром-- боцитами плазму дефибринируют. Де31508

фибринирование производят нагреванием до в водяной бане.

Растворы для стандартной смеси: раствор тромбина с активностью 15- 16 с (т.е. в количестве мл, способный за с свернуть -0,3 мп 0,4%-ного раствора коммерческого фибриногена); раствор фибриногена 0,;4 в буфере Михаэлиса, рН 7s8,

Ход определения.

Проба I. Раствор тромбина инкуби- руют при 37°С и добавляют к нему исследуемую плазм . Затем смесь переносят Б раствор-фибриногена; прогретого также до 37 С, замечают время образования сгус тка фи : рина в секундах.

Проба II. Такую же смесь тромбина с исследуемой плазмой вносят в раствор фибриногена к добавляют раствор npOTai-шнсульфата или полибрена. Отмечают время образования сгустка фиб рина в секундах.

Строят калибровочную кривую зависимости активности антитромбина-Ш и скорости образования сгустка фибрина в смеси тромбин - донорская плазма фибриноген, причем донорскую плазму анализируют цельную и рззво- дят в 2,4 VS 8 раз соответственно, принимая активность антктромбина-111 за 1008 25 и 12;5%, Строят дополнительную калибровочную криву о добав ляют во все разведения протамисульфат или полибрен. Эти кривые строятся од1 алс; 1Ы и при точном приготовлении буфера могут не неняться,

Эстраполиру от время образования сгустка в первой пробе на процент активности по первой кривой,, а время образования сгустка во второй пробе - на процент активности по второй кривой. Показатели второй пробы - активность антитромбина-111,

Пример 1 , Из вень больного Д., 43 лет, с диагнозом тяжелая черепно-мозговая травма взяли кровь (первые 0,5 мл сливают) и смешали ее в пластмассовой пробирке с 358%-ным раствором цитрата натрия в соотноше-- НИИ 9:1. Центрифугировали при 1500 об/мин в течение 5 мин. Отсосали богатую тромбоцитами плазму и вновь центрифугировали при 4000 об/ /мин в течение 20 мин. Отсосали бед- ную тромбоцитами плазму и прогревали ее на водяной бане при (этот параметр долзкен строго соблюдаться) в течение 5 мин. Центрифугировали

10 мин при 4000 об/мин. Надосадочный слой плазмы отсасывали для анализа.

Ход определения.

Проба 1, В пластмассовую пробирку набирали 0,8 ш раст . юра тиомби на, прогревали на водяной бане при 37 С в течение 2 мин и добавляли к нему 0,2 1-40 исследуемой плазмы. Инкубировали при в течение 3 мин. Прогревали 0,3 раствора фибриногена в течение 1 мин при и вносили в него смесь тромбина и плазмы сразу отмечая время начала реакции. Определяли, зремя образования cryciKa фибрина - 75 с По калибровочной кри вей нашли активности антигронбина--11 1 0%.

Проба 2. В пластмассового пробирк у набирали 0,8 мл раствора тромбинаj прогревали на водяной бане при в течение 2 мин и добавляли к нему О,, 2 мл. исследуемой плазмы смешанной с OjOl мл 1%-ного ком:мерческого раствора протаминсульфата и проинкубированной при 37 С в течение 1 мин Инкубировали при 37 с в течение 3 мин Прогревали 0s3 мл раствора фибриногена в течение 1 M-IH при 37 С и вносили в него смесь тромбина к плазмы сразу отмечая вре;-1Я начала реакции. По калибровочной кривой каиш:и активность ант1 Тром6ина-Т II с протамин- сульфатом - 63%, при тоМ; что время образования сгустка составляло 42 с . Проба 3. Б пластмассовую пробирку набирали 0.8 мл раствора тромбина, г рогревали на водяной бане при 37 С в течение 2 мин и добавляли к нему 0,2 1-1Л исследуемой плазмы, предварительно смешанной с полибрепом в соотношении i мг в мл и проинкубированный при 37 С в течение 1 мин. Инкуби- рова,пи при 37 С в течение 3 .Прогревали 0,3 мл раствора фибриногена в течение 1 мин при 37 С и вносили в него смесь тромбина и плазмы, сразу отмечая время начала реакции. Определяли время образования сгустка фибрина - 41 с. По калиброБОчной кривой нашли активность антитромбина 111 с полибреком - 63%,

Для экстраполяции времени образования сгустка фибрина в активности антитромбина-Ш строится калибровочная кривая,

Дня зтого определяют время образования сгустка фибрина в смеси тромбин - цельная смесь дашзмьг 10 здоро515

вых доноров - фибриноген: 60 с. Таким же образом определяют время свертывания сгустка в смеси тромбин плазма доноров, разведенная в 2 раза, фибриноген: 35 с, затем - время образования сгустка в смеси5 содержащей гшазму доноров, разведенную в 4 раза, 27 с, и разводят смесь донорских плаз в 8 раз и определяют время образова- НИН сгустка - 23 с. Строят кривую зависимости времени образования сгустка фибрина от активности антитромби- на-111, условно принимая активность антитромбина-Ш в цельной смеси до- норских плазм за 100%, разведенной в 2 раза - за 50%,-в 4 раза - за 25%, в 8 раз - за .

Таким образом, определение активности антитромбина-Ш по способу-про тотипу (проба 1) показало завьш1еннь Й результат (110%), В то же время, тяжесть состояния больного, наличие у него ДВС-синдромаJ сопровождающегося гиперкоагуляцией крови и потреблением антитромбина-Ш - фактора противо- свертывающей системы крови, объективно свидетельствовало о снижении активности антитромбина-Ш .

Анализ по предлагаемому способу (пробы 2 и 3) показал, что активность антитромбина-Ш у этого больного снижена до 63%. Добавление протамин- сульфата или полибрена в пробы позволило подавить активность эндогенного гепарина (присутствие которого замедляло скорость образования сгустка фибрина за счет образования комплексов фибриноген - геп арин или тромбин - гепарин, а следовательно, завы- шало расчетную активность антитром- бина-111) получить действительную величину активности антитромбина-111.

Пример 2. Из вены больной Ч. 32 лет, взяли кровь (первые 0,5 мл сливают) и смешал-и ее в пластмассовой пробирке с 3,8%-Hbw раствором цитрата натрия в соотношении 9:1. Центрифугировали при 1500 об/мин в течение 5 мин. Отсосали богатую тромбоцитами плазму и вновь центрифугировали при 4000 об/мин в течение 20 мин. Отсосали бедную тромбоцитами плазму и прогрели ее на водяной бане при 56 С (этот параметр должен строго соблюдаться) в течение 5 мин. Центрифугировали 1 мин при 4000 об/мин. Надоса- дочный слой плазмы отсасывали для анализа.

69

Ход определения.

Проба 1. В пластмассовую пробирку набирали 0,8 мл раствора тромбина. прогревали на водяной бане при 37 С в течение 2 мин и добавляли к нему 0,2 мл исследуемой плазмы. Инкубиров ли при 37°С в течение 3 мин. Прогревали 0,3 мл раствора фибриногена в течение 1 мин при 37 С и вносили в него смесь тромбина и плазмы, сразу отмечая время начала реакции. Определяли время образования сгустка фибрина - 81 с. По калибровочной кривой нашли активность антитромбина-111 - 142%.

Проба 2. В пластмассовую пробирку набирали 0,8 мл раствора тромбина, прогревали на водяной бане при 37 С в течение 2 мин и добавляли к нему 0,2 мл исследуемой плазмы, предварительно смешанной с протаминсульфатом в количестве 0,02 мл 1%-ного коммерческого раствора и проинкубированной при 37°С в течение мин. Инкубировали при 37 С в течение 3 мин. Прогревали 0,3 мл раствора фибриногена в течение I мин при 37 С и вносили в него смесь тромбина и плазмы, сразу отмечая время начала реакции. Определяли время образования сгустка фибрина - 37 с. По калибровочной кривой нашли активность антитромбина-111 с протаминсульфатом - 41%.

Проба 3. В пластмассовую пробирку набирали 0,8 мл раствора тромбина, прогревали на водяной бане при 37°С в течение 2 мин и добавляли к нему 0,2 мл исследуемой плазмы, предварительно смешанной с полибреном в соотношении 1,5 мг в i мл и инкубировали при 37 С в течение 1 мин. Инкубировали при 37 С в течение 3 мин. Прогревали 0,3 мл раствора фибриногена в течение I мин при 37°С и вносили в него смесь тромбина и плазмы, сразу отмечая время начала реакции. Определяли время образования сгустка фибрина - 36 с. По калибровочной кривой нашли активность антитромбина-111 с полибреном - 41%.

Таким образом, при определении активности антитромбина-111 по способу- прототипу величина активности составляла в примере 1 110%, в примере 2 - 142%, что явилось ложно завышенным результатом из-за присутствия в плазме больных повышенной концентрации эндогенного гепарина (наличие увеличенного содержания гепарина в плазме было подтверждено анализом по методу Soulier, 1959). .

Определение предлагаемым способом показало, что общая антитромбиновая активность составляла в примере 1 110%, активность собственно антитром- бина-111 - 63%.

В примере 2 общая антитромбиновая активность составляла 142%, активност собственно антитромбина-111 - А1%. Эти показатели соответствуют тяжести состояния исследованных реанимационных больных.

Четко прослеж1.: :;:шотся ложно завышенные результаты анализов при определении по способу-прототипу. При определении по предлагаемому способу есть возможность одновременно более точно определить активность собственно антитромбина-111о

Пример 3, Ход определения такой же, как в примере 2. Но в пробу 2 добавляли 0,03 мл 1%-ного раствора протаминсульфата. Сгустка фибрина не образовалось. В пробу 3 добавляли 2 мг полибрена. Сгустка фибрина не образовалось,

Таким образом увеличение дозы протаминсульфата или полибрена больше предлагаемой является передозировкой при этом сгусток фибрина не образуется . Доза протами 1сульфата меньше 0.0 мл или полибрена меньше 1 мг в пробе не инактивирует полностью действие гепарина и дает ложно завышенные цифры активности исследуемого продукта.

Редактор М. Келемеш

Составитель Т. Ковалева

Техред М.Моргентал Корректор А. Обручар

Заказ 5536/48

Тираж 789

Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР I 13035s Москва,; Ж-355 Раушская наб.„ д. 4/5

Изобретение позволяет повысить точность определения активности антитром- бина-111 по сравнению с прототипом (см. таблицу),

0

0

5

Как видно из таблицы, ошибка (-м) ±20% больше., чем±3,1%9 и разброс сигмы (б) 8,9 большеу чем К8 по способу- прототипу, чем по заявляемог-гу способу соответственно, следовательноj предложенный способ точнее способа-прототипа

Способ прост и воспроизводим Б любой биохимической лаборатории.

Формула изобретения

Способ определения активности антитромбина-111 в плазме крови путем инкубации тромбина с дефибринирован- ной бедной тромбоцитами плазмой добавления полученной смеси к фибриногену,, определения образования сгустка и расчета активности антитромбина-111, отличающийся тем,, что 5 с целью повышения точности способа, дополнительно проводят пробу с добавлением 0,01-0,02 мл на 1% раствора протаминсульфата или J,0- 15 5 мг на i мл смеси полибрена j а расчет активности антитромбина-Ш проводят с учетом данных этой пробы.

Подписное