Способ определения концентраций хлорофиллов а,в,с и их феофитинов Советский патент 1990 года по МПК G01N21/64 

Изобретение относится к физико- химическим способам анализа, применяемым в гидробиологии, гидрохимии, контроле окружающей среды и предназначено для определения концентрации фотосинтетических пигментов (хлоро- филлов и их феофитинов), вырабатываемых фотосинтезирующими планктонными организмами в водоемах.

Целью изобретения является повышение точности за счет оптимизации выбора условий возбуждения и регистрации и расширение круга анализируемых объектов.

3U

Способ возможно использовать не

только для анализа проб морских вод вдали от берега, но и для проб вод любых естественных водоемов.

Определение концентрации хлорофи- лов а, Ь, с и их феофитинов включает приготовление экстракта пигментов в водном ацетоне, измерение интенсивности флуоресценции экстрак- та в красной части спектра, возбуждаемой в синей части спектра, повторное измерение интенсивности флуоресценции после подкисления экстракта соляной кислотой и определение кон- центрации пигментов по измеренным интенсивностям флуоресценции. Интенсивность флуоресценции исследуемого раствора измеряют трижды до его подкисления при трех различных условиях возбуждения и регистрации и трижды после подкисления при тех же трех различных условиях возбуждения и регистрации, причем один раз при измерении преимущественно пары хлорофилл а (хл а) - феофитин, а (фео а) длина волны максимума возбуждения устанавливается Б диапазоне 430-А40 нм, а соответствующая ей длина волны максимума регистрации интенсивности флуоресценции в диапазоне HM второй раз при измерении преимущест- венно пары хлорофилл в (хл.в) - феофитин в (фео в) соответственно в диапазонах 460-465 нм и 653-659 нм; третий раз при измерении преимущественно пары хлорофилл с - феофитин с соответственно в диапазонах 444-448 и 636-640 нмо

Указанные условия измерения выби- раются на основе следуюпшх экспериментально установленных данных:

1.Длины волн максимумов поглощения в синей части спектра (Д,.).и максимумов флуоресценции в красной части спектра (i,,) для измерения пиментов в 90%-ном водном ацетоне различны (см. табл. 1 ).

2.Кислотные факторы К, для хло- рофиллов а,Ь,с, т.е отношения регистрируемой интенсивности флуоресценции раствора до его подкисления

(FO) к регистрируемой интенсивности флуоресценции раствора после под- . киспения (F) при неизменных остальных условиях измерения также раз- личны и зависят от условий измерени

f . , ff . л eov6 . .i Р г S (от А MttfcC ; .«ахс Я Л , i5A 0,5 f

18

При выборе условий измерений исходили из следующих соображений.

Длины волн максимумов возбужде1воз макс

нйя Л « кс регистрации макс выбираются из условия .максимального различения хлорофилла от соответствующего феофитина с учетом известного кислотного фактора .- с одной стороны и получения максимального сигнала от хлорофиллов а не от их феофитинов с другой. Это означает, что при прочих равных условиях предельно обнаруживаемые концентрации для феофитинов будут несколько выше, чем для соответствующих им хлорофиллов.

Виз5

Необходимо выбирать л.и ( такими, чтобы И флуорвсценция

феофитинов (феофитина в указанной паре пигментов) была бы достаточно большой. В противном случае сигнал может оказаться ниже порога обнаружения данным прибором.

Диапазоны выбора

А MriRc f каждой пары феофитин - . xhopoфилл корректируются с учетом диапазднов двух других пар пигментов.

Ширина полос возбуждения и регистрации должна быть достаточно большой, чтобы иметь хороший рабочий диапазон концентраций с одной стороны, и достаточно малой, чтобы иметь хорошую селективность по каждому пигменту с другой.

Не фиг. - 2 представлены экспериментальные данные, снятые на спектро флуориметре -5111-4800 - спектральный ход интенсивности флуоресценции чистых пигментов при различных условиях возбуждения .и регистрации и рассчитанные на этой основе значения кислотных факторов Кф, т.е. отношений

FO/FK. ;

На основе полученных экспериментальных данных имеем, что для хл а - фео а Кф наиболее целесообразно выбирать в диапазоне 5-15. Учитьтая

значения А (хл а) 432 нм, и

(фео а) 411 нм (см.табл.1)

макс

получим, что для пары хл а - фео а Л м1Гкс необходимо выбирать в диапазоне 430-440 нм; при Л 440 нм наблюдается спад Т (хл а) и мы подхо. пвгл ./ /1

ДИМ к (хл с) 446 нм, а при

боэб нм Кф становится меньше 5. В указанный диапазон попадает

Тс ®° с учетом

BOSf .. . ЛОГ

:::;;с («° )

aApj попадает

. 429 нм (см. табл.). Поэтому для уменьшения влияния фео в и фео с необходимо сдвинуть диапазон

ры хл al - фео а от

fAVep макс

фео с) 659 нм; для пары хл а - фео а

принимаем диапазон 670-676 нм.

per ««не

На основе полученных эксперимен- .тальных данных имеем, что и для пары хл в - фео в -кислотньй фактрр К также наиболее целесообразно выбирать в диапазоне 5-15. Учитьюая значения

(хл в) 460 нм, и Д; (фео в)

приблизились бы к л д Л кроме, того при Л,,) нм очень возрастает кислотный фактор (К стано- с вится больше 100), что снижает точность определения этих пигментов. Для полосы регистрации интенсивности флуоресценции аналогичным образом имеет диапазон 636-640 нм, при 10 Л per 636 нм велик Кф, , 640 нм близко подходим к максимумам флуорес- ценции других пигментов (хл в и фео в).

При проведении подобньЕх флуори- (фео в и 15 метрических измерений важное значе ниа имеет величина ширины полосы пропускания, которая обычно указы- равный . вается по уровню 0,5 от максимума

20 ( и ) Значения cпeклГ;«пa25

. погл маис

,5

тральной ширины полос возбуждения и регистрации в данном случае выбираются любыми приемлемыми с точки зрения измерения реальных проб реальным прибором, но. они не должны превышать 12 нм по следукяцим причинам. Расстояния по шкале длин волн воз-, буждекия между установленными диапазонами выбора. для хл а - фео а и хл.

436 НМ, получим, ЧТО для пары хл в - фео в ,(t необходимо выбирать в

диапазоне 458-465-нм; при Д,.,465 нм кислотный фактор К возрастает и пре- вьппает К,/, 15, при Л9,35 458 нм К ф становится меньшим 5,. и поэтому вне этого диапазона (458-465 нм) выВОэБ

А

Мчкс

нецелесообразно. Для

полосы регистрации интенсивности флуоресценции, с учетом того же требова- иия 5 К ф 15.имеем диапазон 649 663 им, а чтобы иметь достаточное

/лакс слева и от

удаление от

(хл а) справа, иь1еем окончательно

диапазон ,;.(хл в, фео в) .653-659 нм.

Для пары хл с - фео с кислотный фактор К ф имеет значение на порядок больше, чем в предьщущих двух слу- . чаях. Учитывая, что ( с)

446 им, а , (фео с) 429 нм.

e«3f

необход ймо вы-.

получим, что ..

бирать в диапазоне 444-448 нм )при

Л 444 нм мы существенно бы приблизились к (фео в и хл а),

а при Aiejt 448 нм - существенно

20 ( и ) Значения cпeк25

30

,5

тральной ширины полос возбуждения и регистрации в данном случае выбираются любыми приемлемыми с точки зрения измерения реальных проб реальным прибором, но. они не должны превышать 12 нм по следукяцим причинам. Расстояния по шкале длин волн воз-, буждекия между установленными диапазонами выбора. для хл а - фео а и хл.

с-фео с равно 4 нм, между диапазонами хл с - фео с и хл в - фео в - 10 нм. Расстояние по шкале длин волн регистрации между указанными в формуле

per

35 диапазонами выбора . хл с - фео с - и хл в - фео в равно 13 нм, а между диапазонами хл в - фео в и хл а - фео а - 1 I нм.. Таким образом, если.спектральная ширина полосы воз- 40 буждения и регистрации (по уровню 0,5) больше 12 нм, то перекрываться будут и полосы возбуждения и полосы регистрации. Поэтому целесообразно выбирать u.o,f и мень 5 ше 12 нм, нижнее значение этой величины определяется в зависимости от типа прибора, на 1котором осуществляются измерения. Чем оно меньше, чем селективность системы будет боль0 ше, но с другой стороны, одновременно будет уменьшаться диапазон концентраций, измеряемых на выбранном

приборе, так как ухудшается соотношение сигнал/шум.

5 Пример выполнения.

Была проведена градуировка спек- трофлуориметра SLM-4800 и на нем определялись концентрации пигментов

в растворах. Условия измерения принималис

- длины волн максния и соответственно ли следующими: bosff

N

eosff

j «rtfcc

J MOKt

A 38 HM 460 KM 446 HM

- ширина полосы пропускания и по возбуждению и по регистрации (по уровню 0,5) - 8 нм;

до подкисления t ,, f уч . г f

Система уравнений, которая использовалась для отыскания градуировоч- ных уравнений, имеет следующий вид: до подкисления ,

15

Го к; С + « К;«Сфо+ К фьС ь- Fj С + Kt К Се + К;„С«„+ F , К Сс, + К V Се -ь К5„С4« К|.Сфс после подкисления

1 к;,,с;,-к;,с;с ,

Fl

4ci -4 i - 4a

к2„с л„+ к-с

г г

F Кф«С4 + KjfeC t к|сС с Cij° Cj + C+j (,b,c) Решение этой системы

Cq а, dF +. а dF + аз dFСь b, dF + + bi

Cc с, /IF t- c, dF H- сз dF

. «IF; + + (a.F a,F - a dF Сфь bJF.; + b ,F - ij jF - (b,flF + + bj dF)

c clfl- c ,Fl + (c, AF -I- C4 dF + )

ная интенсивность флуоресII

FC « величины интенсивности . Q флуоресценции исследуемо- .го раствора при различных условиях (,2,3). а - с,- F - интенсивность флуоресценции исследуемой пробы при j. i-x усжзвйях возбуждения . и регистрации (до подкисления) ,

f У

F, - то же после подкисления.

dF

К

- Fi - F K .50

пиг молярная концентрация соответствующего пигмента (п,игм а,Ь,с,фа,фв,фс).- --р

LJi- (для хлорофиллов,

С йагм

ценции пигмента при i-x условиях измерения, - козфф Щ;иенты градуировоч- ных уравнений (II),получаемые решением системы (1) относительно неизвестных С пи г/и после подстановки в (1) 18-ти из.мерен- ных кoэффициeнтoi0 К пигм Проведя градуировку прибора, т.е. определив удельную интенсивность флуоресценции пигментов всех трех условиях измерения (К ««гм) вычисляли, коэффициенты а,- - с системы (II)...Чтобы определить концентрации

,Ь,с), или

jf(для феофитинов,

BWtM

пигм фа,фв,фс) - удель пигментов в исследуемой пробе (С „„ ) для этой пробы измеряли трижды (при трех различных условиях возбуждения и соответственно регистрации) интен-размер кюветь в плоскости изме- р.ения I см.л I см; объем пробы 4 мл;

-пробы подкислялись тремя капля- ми раствора соляной кислоты (рН

0,7);

- время между подкисление и измерением составляло не менее 3 мин.

Система уравнений, которая использовалась для отыскания градуировоч- ных уравнений, имеет следующий вид: до подкисления ,

II

а - с,- .

ценции пигмента при i-x условиях измерения, - козфф Щ;иенты градуировоч- ных уравнений (II),получаемые решением системы (1) относительно неизвестных С пи г/и после подстановки в (1) 18-ти из.мерен- ных кoэффициeнтoi0 К пигм Проведя градуировку прибора, т.е. определив удельную интенсивность флуоресценции пигментов всех трех условиях измерения (К ««гм) вычисляли, коэффициенты а,- - с системы (II)...Чтобы определить концентрации

пигментов в исследуемой пробе (С „„ ) для этой пробы измеряли трижды (при трех различных условиях возбуждения и соответственно регистрации) интен .1

снвность флуоресценции пробы до () трижды после подкисления (F ее аплями соляной кислоты. Подставляя значения . dF в систему (II), вычисляли концентрации пигментов в

пробе.

Результаты градуировки приведены

в табл.2 и 3.

Для контрольных растворов чистых пигментов и их смесей в рабочем диапазоне концентраций отличие между значениями концентраций для всех хло- рофиллов, фео а и фео в, определенными описанньм флуоресцентным способом, и их истинными значениями, составляет менее 5%, а для фео с ме- нее 8,5%,

Таким образом, предлагаемый способ более точен, чем известные, так как, во-первых, ошибка определения каждого пигмента меньше, чем у предыдущих, во-вторых, способ работоспособен и зффективен в общем случае любого соотношения между хл а,в,с и фео а, в,с, т.е. применим для любых природных вод.Кроме того, предла- гаегшй способ прост с точки зрения приборной реализации, так как позволяет использовать не только спек-.j трофлуориметры, но и флуориметры.

Формула изобретения

Способ определения концентраций хлорофилпов a,Bj с,, и их феофитинов, включающий приготовление экстракта пигментов в 90%-ном водном ацетоне, возбуждение и регистрацию интенсивности флуоресценции до и после, под

73518

кисления раствора, причем измерение

интенсивности флуоресценции до под- кисления проводится при трех различных условиях регистрации, расчет кон центрации пигмента по величине интенсивности, отличающийся тем, что, с целью повышения точности за .счет выбора оптимальных усло10 ВИЙ возбуждения и регистрации и рас- пгарения круга анализируемых объектов, возбуждение флуоресценции раствора до подкисления проводится при трех различных условиях возбуждения,

15 возбуждение и регистрация флуоресценции после подкисления проводится при тех же условиях, что и до подкисления, причем условия возбуткдания и регистрации устанавливаются так,

20 чтобы удовлетворялось неравенство для хлорофиллов а и в: 5 -F,/F,, и для хлорофилла .с: 50 (F,6l50, где FO и F ингенсивность флуорес - ценции чистых пигментов до и после

25 подкисления), при этом первый раз при измерении интенсивности преимущественно пары хлорофилл а - феофи- тин а длину волны, максимума возбуждения устанавливают в диапазоне 43030 440 нм, а соответствующую ей длину волны максимума регистрации интенсивности флуоресценции в диапазоне 670-676 нм, второй раз при измерении преимущественно пары хлорофилл в - феофнтин в - соответственно в диапат зонах 460-465 нм и 653-659 нм, тре-. .. тий раз при измерении преимущественно пары хлорофилл с - феофитин с - соответственно в диапазонах 444 40 448 нм и 636-640 нмо

35

Изобретение относится к физико- химическим способам анализа, применяемым в гидробиологии, гидрохимии, . контроле окружающей среды и предназначено для определения концентрации фотосинтетических пигментов, вырабатываемых фотосинтезируннцими микроорганизмами в водоемах. Целью является повышение точности и ра сширение круга анализируемых объектов. В 90%- ном водном ацетоне приготавливают экстракт пигментов, измеряют интенсивность флуоресценции в красной части спектра, возбуждаемой в синей части спектра. Повторно измеряют интенсивность флуоресценции после подкис- ления соляной кислотой. Время между подкислением и измерением составляет 3 мин„ Измерение проводят трггады до подкисления-исследуемого раствора при трех различных условиях возбуждения, и регистрации и трижды после подкисления при тех же условиях возбу: ;- дения и регистрации. Первьй раз при измерении преимзтаественно пары хлорофилл а-феофетин, а длина вол ны максимума возбуждения устанавливается в диапазоне 430-440 им, а соответствующая ей длина волны максимума ре- ги страции интенсивности флуоресценции в диапазоне 670-676 нм,рторой раз при измерении преимущественно пары хлорофил в-феофетин соответственно в диапазонах 460-465 нм и 653-659 нм, . третий раз при измерении преимущественно пары хлорофил с-фео-. фетин соответственно в диапазонах 444-448 нм и 636-640 нм. 3 табл, 2 ил. с о с .4 Од СП 00

Таблица

Максимумы поглощения и флуоресценции фо - тосинтетических пигментов в 90%-ном

IA735J812

Таблица 2 Удельная интенсивность флуоресценции

W

660

67O

5000

О

Составитель О.Бадтиева Редактор В.Фельдман Техред-И.Beрес Корректор Л.Зайцева

Заказ 156

Тираж 51I

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР t13035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

2000

FH. ofTTff. efflOffO

Подписное