Способ определения концентрации гемоглобина в фекалиях Советский патент 1989 года по МПК G01N33/72 

Изобретение относится к медицине, а именно к способам определения концентрации гемоглобина в фекалиях.

Цель изобретения - повышение точности и ускорения способа.

Цель достигается за счет превращения нефлуоресцирующего гемоглобина в порфирин при нагревании в присутствии щавелевой кислоты и оксалата железа, полученный порфирин определяют флуоресцентным анализом в экстракте При длине волны возбуждения 408- 410 нм и испускания 660 нм, при этом учитывают величину неспецифической флуоресценции определяя в отдельном образце, в котором лимонная кислота или другое аналогичное нереагирующее соединение заменяет систему щавелевая кислота - оксалат железа. Вычитая величину флуоресценции, полученную в лимонной кислоте из величины, найденной для анализируемого образца, получают величину флуоресценции, которая связана с порфирином, полученным из гемоглобина.

На фиг.1 изображен спектр флуоресценции гелеобразной реакционной смеси (щавелевая кислота: оксалат железа) с добавлением гемоглобина и без него; на фиг.2 - вторая производная от спектра флуоресценции; на фиг.З - график сравнения спектров флуоресценции гемоглобина в растворе щавелевая кислота - оксалат железа и гемоглобина в растворе лимонной кислоты (по вертикали - уровни флуоресценции,

Јъ СЛ Јь

СО

СлЭ

Ш

3147549

по горизонтали - длины волн испускания); на фиг.4 - график сравнения спектра флуоресценции образца фекалий в растворе щавелевая кислота - окса- , лат железа со спектром того же самого образца в растворе лимонной кислоты; на фиг.5 - линейная зависимость между уровнем гемоглобина и флуоресценцией в растворе щаведевая кисло- JQ та - оксалат железа, в который добавлено железо в виде FeSO. (по оси абсцисс - концентрация гемоглобина, по оси ординат - уровень флуоресценции) .15

Способ осуществляется следующим образом.

Определение слагается из трех стадий. Первая включает приготовление тестового образца фекалий, вторая - 20 количественное превращение гемоглобина образца во флуоресцирующий порфи- рин, третья - измерение флуоресценции порфирина в тестовом образце и в t

На фиг.5 концентрации обработанного в автоклаве гемоглобина отложены в зависимости от интенсивности флуоресценции для концентрации сульфата железа: 0,0%; 0,1%; 1,0% и 3,0%. Как видно кривая 1, полученная без FeSO, нелинейна при больших концентрациях гемоглобина, а кривая 2 в присутствии FeSO - линейна. На фиг.5 А возб. 410 нм, а 1 исп. 660 нм. Образцы перед флуоресцентным анализом разбавляют до исчезновения окраски.

После превращения тема в протопор- фирин смесь оставляют остывать. Затем к ней добавляют в соотношении 4:1 раствор, содержащий этилацетат и ледяную уксусную кислоту, взятые в соотношении 1:12. Полученную смесь центрифугируют. Для флуоресцентного анализа используют супернатант, которьй благодаря добавлению этилацета- та и „ледяной уксусной кислоты по

Изобретение относится к области медицины, в частности, к способам определения концетрации гемоглобина в фекалиях. Цель - повышение точности и ускорение способа. Цель достигается за счет превращения гемоглобина в порфирин при нагревании в присутствии щавелевой кислоты и оксалата железа

полученный порфирин определяют флуоресцентным анализом в экстракте при λ возбуждения 408-410 нм и испускания 660 нм. При этом учитывают величину неспецифической флуоресценации, определяя ее в отдельном образце, где лимонная кислота или другое аналогичное нереагирующее соединение заменяет систему щавелевая кислота-оксалат железа.3 з.п.ф-лы,5 ил.

бланковом образце (в котором исполь- 25 лучается прозрачным

зуют вместо смеси щавелевая кислота Спектрофлуориметрирование проводят

на приборах фирм Аминко Боуман или

Перхин Элмер (например, Перхин Элмер

модель MPF-44B). 2Q В качестве бланкового раствора,

для учета присутствия в образце друоксалат железа, лимонную кислоту) и сравнение разности во флуоресценции с контрольным стандартом известной концентрации гемоглобина.

Вначале отбирают и взвешивают тес

товое количество образца фекалий - 0,5 г В образец добавляют 20-40 мл 0,85%-ного хлористого натрия, смесь гомогенизируют до равномерной дисперсии фекалий. Полученный тестовый образец хранят в замороженном состоянии при температуре от (-15) до (-30 С) до востребования. Концентрация материала 2,5%.

Затем тестовый образец смешивают с реакционной смесью, содержащей 0,3- 3% сульфата двухвалентного железа или 1% оксалата двухвалентного железа в 2М щавелевой кислоте при объемном соотношении гомогенизированный материал: реакционная смесь 1:20. Полученную смесь нагревают до растворения ингредиентов (120°С в течение 90 мин). Добавление оксалата или сульфата же- леза, которые действуют как дополни- тельные восстанавливающие агенты (наряду со щавелевой кислотой), обеспечивает полные превращения тема гемоглобина в порфирин и это обеспечивает прямолинейный график флуоресценции в интервале концентраций гемоглобина, достаточном для всех возможных уровней его в фекалиях (фиг.5).

5

0

55

45

гих флуоресцирующих веществ, используют тестовый образец, в котором ща- ведевую кислоту и оксалат, сульфат Fe2 заменяют на 1,5 М лимонную кислоту, остальные процедуры идентичны описанным, для анализируемого тест- образца, так как в присутствии лимонной кислоты не происходит превращения заметного количества тема (менее 0,2%) в порфирин, получаемый бланковый тест-образец позволяет оценить базовьй уровень порфиринов в фекалиях.

На фиг.З и 4 изображены спектры флуоресценции как смеси с лимонной кислотой, так и смеси щавелевая кислота - оксалат Fe42.

На фиг.З показан спектр флуоресценции добавленного гемоглобина в системе щавелевая кислота - оксалат Fe24 - кривая 1 и спектр флуоресценции (кривая 2) добавленного гемоглобина в системе лимонной кислоты.

На фиг.4 изображен спектр флуоресценции (1) образца фекалий с гемоглобином в системе щавелевая кислота - оксалат и спектр флуоресценции

(2) того же образца в бланковой системе лимонной кислоты.

Таким образом, разность флуоресценции между спектрами 1 и 2 отражает количество превращенного порфирина в исследуемом образце фекалий.

П р и м е рр 1. Приготавливают 2,5%-ный фекальный гомогенат в 0,85%- ном растворе NaCl. Затем приготавли- вают 100 г реакционной смеси, объединяя 25,2 г щавелевой кислоты, 1,0 г порошка Fe04 или оксалата Fe+ в

до употребления. Приготавливают также 100 г контрольной бланковой смеси, объединяя 28,8 г лимонной кислоты и

120 С оставляют остывать, проводят экстрагирование этилацетатом как описано ранее и измеряют флуоресценцию, так как протопорфирин составляет око- ло 3,37% молекулярного веса гемоглобина, величины, полученные для .порфирина умножают на 100/3,37 или на 29,67 для получения соответствующего значения гемоглобина. Затем определя- ют величину гемоглобина в миллиграммах на грамм фекалий, умножая на соответствующие коэффициенты разбавления .

П р и м е р 2. Для сохранения реакционной смеси в нее дополнительно вводят полиэтиленгликоль при следующем соотношении компонентов: 73,8 г полиэтиленгликоля; 25,2 г щавелевой кислоты, 1,0 г порошка оксалата или 1,0 г сульфата Fe+2.

В бланковую смесь дополнительно вводят 71,2 г полиэтиленгликолей и 28,8 г лимонной кислоты. Вышеуказанные смеси дают концентрации 4 М щавелевой кислоты и 1,5 М лимонной кислоты соответственно.

5

0

5 0

(- 0

5

5

Для получения ожидаемого результата могут быть использованы 70%-ный или 75%-ный полиэтиленоксид.

При анализе спектров гелеобразной реакционной смеси применение вторых производных спектров флуоресценции может дать существенные преимущества (фиг.1 и 2).

Формула изобретения

.1 . Способ определения концентрации гемоглобина в фекалиях путем по- лучения суспензии исследуемого материала, превращением тема гемоглобина в порфирин в присутствии щавелевой кислоты и восстанавливающей соли с последующим изменением флуоресценции полученного образца, отличающийся тем, что, с целью повышения точности и ускорения способа, суспензию, получают гомогенизацией в растворе 0,85%-ного хлорида натрия при концентрации материала 2,5%, затем вводят гомогенизированный материал в реакционную смесь, содержащую 0,3-3% сульфата двухвалентного железа или 1% оксалата двухвалентного железа в 2 М щавелевой кислоте при объемном соотношении гомогенезированный материал: реакционная смесь 1:20, полученную смесь нагревают до растворения ингредиентов и добавляют к ней в соотношении 4:1 раствор, содержащий этилацетат и ледяную уксусную кислоту, взятые в соотношении 1:12, и в верхнем слое смеси измеряют флуоресценцию при 660 нм и длине возбуждающего света 408-410 нм.

1j1

&ездо$а8ки гемоглобина (с до5а8кой гемоглобина

550 600650

Длина Волны испускания, нм . Фиг. 1

2,000

С да5а8кой гемоело5ина

Длина &олны испускания, нм Фив. Z

I

I

t

т но

Длина долны испускания,нм Фиг.З

о ю т looo

Концентрация гемовлоЯина, мке/мл раствора Фие.5

1

600 550 Длина Волны испускания, ни Фиг. : Ч