Способ биоиндикации тяжелых металлов в морской воде Советский патент 1989 года по МПК G01N33/18 

Изобретение относится к области охраны окружающей среды и может быть применено в контроле уровня загрязнения морской среды тяжелыми металлами с использованием макроводорослей в качестве тест-организмов.

Цель изобретения - повышение точности определения, сокращение времени анализа и увеличение количества одновременно анализируемр. х проб.

Способ заключается в следующем.

Биомассу водорослей - тест-объектов помещают в камеру с чистой водой и проводят адаптацию растений к фоновому содержанию тяжелых металлов

в течение суток при красном свете интенсивностью 300-500 лк. Затем среду в опытных пробах заменяют на исследуемую воду и проводят инкубацию каждого вида по отдельности в течение 28-30 ч при периодическом освещении. 4-4,5 ч - свет интенсивностью 6000-8000 лк, 4-4,5 ч - темнота. В качестве физиологической характеристики водорослей, изменяющейся под действием металлов, измеряют окислительную активность среды. О повышении концентрации металлов в исследуемой воде по сравнению с фоновой судят по статистически достоверному отличию

Ј

СО

оо

о

окислительной активности греды в опытных и контрольных вариантах.

Пример 1. Водоросли помещают в чистую морскую воду при весовом соотношении биомассы и среды (1:500) (1:400). Пробы инкубируют в течение суток в темноте, при красном снете различной интенсивности и при обычном искусственном освещении (7000лк) Затем все пробы водорослей в течение суток содержат при освещенности 7000 лк и после инкубации определяют величину окислительной активности (ОЛ) среды.

В табл. 1 приведены результаты определения ОЛ в среде водорослей, адаптированных в темноте, при красно свете различной интенсивности и при обычном искусственном освещении (7000 лк) в течение 24 ч и затем освещаемых в течение суток (7000 лк).

Из табл. 1 видно, что режим проведения адаптации не отражается на среднем уровне окислительной активности среды, но существенно сказывается на вариабельности результатов. Наименьшие величины коэффициента вариации (Су) наблюдаются при использовании красного света интенсивностью 300-500 лк.

Пример 2. Водоросли инкубируют в морской воде с добавлением солей металлов (концентрация 0,5 мг/л по металлу) в течение сутбк при различном режиме освещения. Затем биомассу отполаскивают, высушивают, оэо ляют в концентрированной азотной кислоте и определяют содержание металлов в тканях растений атомио-абсорб- ционным методом.

В табл. 2 приведены результаты определения различий в содержании тяжелых металлов в талдомах водорослей, инкубированных в течение 24 ч на среде с фоновым уровнем металлов и их повышенной концентрацией (500 мкг/л) при разном режиме освещения .

Как видно из табл. 2, наибольшее увеличение содержания металлов в пробах водорослей наблюдается при чередовании 4-часовогр освещения и 4-часовой темноты.

П р и м е р 3. Водоросли инкубируют в морской воде при периодическо освещении рачной интенсивности.

В табл. 3 приведены средние значения ОА среды н норме для 30 видов

0

5

0

5

0

5

0

5

0

5

водорослей, инкубированных при периодическом освещении (4 ч - свет, 4ч- темнота) разной интенсивности в течение 28 ч после предварительной адаптации на красном свету.

Для всех исследованных водорослей освещенность 7000 лк обеспечивает достаточно высокий уровень ОА в норме, необходимый для проведения индикации металлов в среде по изменению ОА. Повышение освещенности сверх этого значения хотя и повышает уровень ОА, но у многих видов водорослей вызывает разрушение пигментного аппарата.

П р и м е р 4. Водоросли, очищенные от обрастаний, помещают в сосуды с чистой морской водой при весовом соотношении биомассы и среды 1:500 и инкубируют при красном свете 400 лк в течение 8-48 ч. Затем в сосудах заменяют среду, при этом часть проб заливают вновь чистой водой, а часть - водой с добавлением соли меди (500 мкг/л по металлу) и инкубируют в течение 28 ч при 18-19 С периодическом освещении 7000 лк (4 ч - свет, 4 - темнота). После окончания инкубации определяют окислительную активность как отношение скоростей окисления ДОФА в средах, содержащих водоросли, к скорости окисления ДОФА в соответствующих исходных средах.

В табл. 4 приведена окислительная активность среды водорослей с фоновой (фон) и повышенной (изб.) концентрацией меди, средние значения (М) и их среднее квадратическое отклонение (S) для 5 биологических повтор- ностей в каждом варианте.

Как видно из табл. 4, в среде водорослей, адаптировавшихся в течение 8-12 ч, наблюдаются значительные колебания ОА, затрудняющие сопоставление данных в вариантах с различной концентрацией меди. Средние значения ОА остаются в целом постоянными, но для получения статистически достоверных различий между вариантами при малых сроках адаптации необходимо большое количество повторностей. Разброс данный у водорослей, адаптированных в течение суток, существенно уменьшается и при более длительных сроках адаптации практически не изменяется. Таким образом, оптимальный срок адаптации водорослей - 24 ч, более длительная адаптация не отражает514

ся существенно на результатах анализа, но увеличивает общее время его проведения. Использование 24-часовой адаптации водорослей при слабом красном свете позволяет уменьшить число повторностей для каждого варианта до 2-3.

Пример 5. Биомассу водорослей, подготовленную аналогично санному в примере 4 и адаптированную в течение суток при красном свете 400 лк, помещают в среды с фоновым уровнем металлов и в среды с солями меди, динка или кадмия (200 мкг/л по , металлу) и инкубируют при периодическом освещении (4 ч - 7000 лк, 4ч- ). Пробы среды отбирают через 12, 20, 28, 36 и 44 ч (нечетное количество чередований световых и тем- новых периодов, так как отбору проб должен предшествовать световой период) . Определяют ОА в среде водорослей по отношению к соответствующим исходным средам и рассчитывают разность ОА (ДОА).

В табл. 5 приведена ДОА (%) при разных сроках инкубации водорослей в морской воде с добавлением солей металлов (200 мкг/л по металлу), среднее (м) и среднее квадратическое отклонение (S) для 5 биологических повторностей.

Как видно из табл. 5, в первые 12-20 ч инкубации водорослей на среде с металлами наблюдаются значительные колебания отклика, связанные с неодновременным завершением в отдельных повторностях первой фазы токсического эффекта - повышения метаболической активности, приводящего к некоторому увеличению ОА. К 28 ч инкубации токсическое действие данной концентрации металлов на водоросли проявляется в основном в значительном снижении ОА среды, достоверно регистрируемом даже при небольшом количестве повторностей. Продолжение инкубации практически не отражается на качестве получаемых результатов.

П р и м е р 6. Разные виды водорослей, предварительно подготовленные аналогично описанному в примере 4, инкубируют в течение 28 ч при периодическом освещении (4 ч - 7000 лк, 4 ч - темнота) на среде с фоновым содержанием металлов и средах с добавлением солей меди, цинка,i кадмия

98

0 g п 5

о

5

0

5

0

5

766

свинца и никеля (200 мкг/л по металлу) . Определяют ОА по отношению к соответствующим исходным средам и рассчитывают ДОА.

Результаты определения АОА для разных видов водорослей после инкубации в течение 28 ч приведены в табл. 6, среднее значение для 5 био- логических повторностей.

Из табл. 6 видно, что исследованные виды водорослей различаются по чувствительности к отдельным металлам. Учитывая, что стандартное отклонение средних значений АОА, приведенных в таблице, не превышало 25% окислительной активности, можно считать, что достоверная индикация концентрации металлов 200 мкг/л достигается при абсолютной величине &ОА, превышающей 100. В табл. 6 представлены значения U.OA, соответствующие этому критерию и выделяющие наиболее чувствительные виды водорослей, перспективные для индикации более низких концентраций тяжелых металлов в морской воде.

Специфичность чувствительности водорослей к отдельным тяжелым металлам позволяет, используя соответствующие наборы видов, не только констатировать факт повышения концентрации тяжелых металлов в среде, но и идентифицировать конкретные элементы, входящие в комплексное загрязнение.

Пример 7. Биомассу каждого вида водорослей, характеризующихся специфической чувствительностью к отдельным металлам или нескольким из них, адаптируют и инкубируют аналогично описанному в примере 6. Испытываемыми образцами служат растворы солей металлов в морской воде (концентрация около 200 мкг/л по каждому из металлов) неизвестного состава.

В табл. 7 приведены результаты определения ДОА (среднее для трех биологических повторностей для каждого вида} среднее квадратическое отклонение не превышает 25% окислительной активности). В табл. 7 указаны также элементы (на основании данных, часть которых приведена в примере 6), которые могут в каждом отдельном случае вызывать отклик данного знака и величины (знак +), и элементы, наличие повышенных концентраций которых в образце воды отрицается характером отклика (знак -).

Анализируя данные тябл. 7, можно сделать следующие выводы:

В образце 1 присутствуют медь и цинк наличие других элементов в повышенных концентрациях вызывает сомнение, так как не подтверждается реакцией большинства видов.

В образце 2 в повышенных концентрациях могут находиться свинец, цинк и кадмийJ наличие меди и никеля маловероятно.

В образце 3 повышена концентрация кадмия, никеля и цинка и маловероятно превышение меди и свинца над фоновым уровнем.

В анализируемых образцах воды с помощью атомпо-абсорбцнонной спектро фотометрии по стандартной методике определяют содержание меди, пинка, кадмия, свинца и никеля

В табл. 8 приведены коптч нграции тяжелых металлов в испытываемых средах по данным атомно-абсорбционного анализаj среднее для 4 аналитических по вторностей, стандартное отклонение не выше 5%.

Таким образом, выводы о повышении концентрации металлов в среде, сделанные на основе анализа с применением предложенного способа, совпа-. дают с результатами атомно-абсорбционного анализа проб воды.

Таким образом, использование на- боров различных видов водорослей, обладающих разной чувствительностью к отдельным металлам, дает возможность не только констатировать факт повышения их концентрации, по и выявить отдельные металлы.

П р и м е р 8. Наиболее чувствительные к тяжелым металлам при их; концентрации 200 мкг/л виды водорослей подготавливают к анализу и инкубируют на средах с металлами аналогично описанному в примере.

Используют -следующие концентрации металлов, фон, мкг/л: 5, 10, 50, 100,. После инкубации определяют ОА среды водорослей по отношению к соответствующим исходным средам и рассчитывают & ОА по отношению к ОА фоновой среды.

3 табл. 9 приведена &.ОА среды водорослей при различной концентрации металлов; среднее (К) и среднее квадратическое отклонение (S) для j биологических повторпостей.

Как видно из чабл. 9, субтоксические концентрации металлов (меньше 100 мкг/л) могут вызывать у водорослей увеличение ОА ГАОА положительная, см. также табл. 7), которое достоверно регистрируется и наряду со снижением ОА, наблюдаемым при более высоких концентрациях металлов, может быть показателем реакции водорослей на изменение Уровня металлов в среде.

Таким образом, предложенный способ позволяет повысить чувствительность и сократить время анализа, уменьшить трудоемкость определения, объемы анализируемых образцов среды при одновременном увеличении -количества одновременно испытываемых проб воды.

I

20

ормула изобретения

5

5

0

5

0

5

Способ биоиндикации тяжелых металлов в морской воде, предусматривающий помещение в камеры с чистой водой и инкубацию тест-объекта - макроводорослей, адаптацию их к фоновому содержанию тяжелых металлов, деление камер на две группы - опытные и контрольные, добавление в опытные камеры с макроводорослями исследуемой воды, 0 измерение физиологической характеристики водорослей, их сравнение и заключение о повышенном содержании тяжелых металлов в исследуемой воде по сравнению с фоном при статистически достоверном отличии значений физиологической характеристики тест- объекта в опыте по сравнению с контролем, отличающийся тем, что. с целью повышения точности определения, сокращения времени анализа и увеличения количества одновременно анализируемых проб, адаптацию проводят в течение суток при красном свете интенсивностью 300-500 лк, инкубацию в исследуемой воде проводят по отдельности каждого вида тест- объекта в течение 28-30 ч при периодическом освещении: 4-4,5 ч свет интенсивностью 6000-8000 лк, 4-4,5 ч - темнота, в качестве физиологической характеристики измеряют окислительную активность водорослей, а в качестве тест-объекта используют Clado- phora sLimpsonii, и/или Chaetomor- pha moniligera, и/или Enteromorpha intestinalis, и/или Grateloupia di- chotoma, и/или Geranium ciliatum, и/или Loureusia hybrida и/или Cycto- seira barbata, при этом для свинца

тест-объектами являются Ulva fenes- trrata, и/или Sargassum pallidium, и/или Gelidium latifolium, для цинка - Bryopsis adriatica, и/или Gra- teloupia turuturu, и/или Enteromor- pha prolifera, для кадмия - Tichocar- pus crinitus, и/или Cladophora vaga- bunda, и/или Gelidium crinale, и/или Ceramium rubrum, для никеля - Clado

phora stimpsonii, и/или Sargassum pallidum, и/или Dictyopteris divari- cata, и/или Bryopsis adriatica, и/или Cladostephus virticillatus, для меди - Ulva fenestrata, и/или Grate- loupia turuturu, и/или Dictyota di- chotoma, и/или Dictyopteris divari- cata, и/или Callitamnion granulatum,

и/или Padina pavonia. i

Таблица 1

Изобретение относится к охране окружающей среды и может быть применено в контроле уровня загрязнения морской среды тяжелыми металлами с использованием макроводорослей в качестве тест-организмов. Целью изобретения является повышение точности определения, сокращение времени анализа и увеличение количества одновременно анализируемых проб. Способ заключается в том, что водоросли (тест-объекты) адаптируют в течение суток на среде с фоновым содержанием металлов при красном свете интенсивностью 300-500 лк. Затем среду заменяют исследуемыми образцами воды (опыт) и свежей исходной средой (контроль) и в течение 28-30 ч водоросли инкубируют при периодическом освещении интенсивностью 6000-8000 лк (4-4,4 ч - свет, 4-4,5 ч - темнота), после чего определяют окислительную активность среды по отношению к соответствующим исходным средам. О повышении концентрации металлов в исследуемой воде по сравнению с фоновой судят по статистически достоверному отличию окислительной активности среды в опытных и контрольных пробах. 9 табл.

A - среднее и S - среднее квадратическое отклонение для 10 биологических повторностей.

Примечание. Среднее (М) и среднее квадратическое отклонение

(S) для 8 биологических повторностей.

Таблица2

Sargassum pallidura Bryopsis adriatica

Tichocarpus crinitus Cladophpra vagabunda

Таблицаб

Таблица

+Fb,-Cu+158 +Ni,-Cu,-Pb

+Zn,-Cu,+290 +Zn

+Cu,+Cd-114 +Cu,+Cd

+Cu,+Cd-224 +Cu,+Zn,+Cd

Продолжение табл.7

Таблица

Таблица9