Устройство для регистрации макроскопических токов через участок наружной мембраны клетки или изолированного органоида Советский патент 1989 года по МПК C12M3/00 

Изобретение относится к физиологии клетки, а более конкретно к .устройствам исследования клеточных мембран, преимущественно, растительного происхождения.

Цель изобретения - повышение точности регистрации токов за счет компенсации паразитных параметров микропипетки.

На чертеже представлена функциональная схема устройства для регистрации макроскопических токов через участок наружной мембраны клетки или изолированного органоида.

Устройство для регистрации макроскопических токов через участок наружной мембраны клетки или изолированного органоида содержит два операционных усилителя 1 и 2, три резистора 3-5, два конденсатора 6 и 7,

усилитель 8 с регулируемым коэффициентом усиления, два переменных резистора 9 и 10, общую шину, стеклянную микропипетку 11, заполненную раствором с двумя электродами 12 и 13 в ней, один из которых подключен к первому входу операционного усилителя 1, второй последовательно через резистор 3 - к вых оду операционного усилителя 1, второй вход и выход которого соединены через резистор , а между входами его последовательно через конденсатор 6 подключен усилитель 8 с регулируемым коэффициентом усиления, второй вход операционного усилителя 1 и первый вход операционного усилителя 2 соединены через переменный резистор 9, а первый вход и выход операционного усилителя 2 - через параллельно соединенные конденсл to

со

tsD

315

сатор 7 и резистор 5. Кроме того, устройство снабжено повторителем 1 ), дополнительным электродом 15, двумя переключателями 1б и 17 и двумя калибровочными резисторами l8 и 19. Одна клемма переключателя 1б и повторитель Н подключены к дополнительному электроду 15, вторая клемма этого переключателя соединена с первым калибровочным резистором l8, перва я клемма переключателя 17 связана с первым входом операционного усилителя 2, к второй и третьей клеммам которого подключены соответственно второй калибровочный резистор 19 и переменный резистор 10, а третья клемма переключателя 16 и остальные выводы переменного резистора 10 и калибровочных резисторов 18 и 19 - к общей шине. Усилитель 8 с регулируемым коэффициентом усиления с последовательно включенным конденсатором 6 предназначены для компенсации паразитной емкости микропипетки 11. Переменные резисторы 9 и 10 служат соответственно для компенсации последовательного сопротивления микропипетки 11 и сопротивления утечки в зоне контакта микропипетки 11 с мемб раной клетки или органоида. К дополнительному электроду 15 подключен повторитель lA с большим входным сопротивлением и служит для контроля точности компенсациипаразитных параметров микропипетки 11. Переключатели 1б и 17 предназначены соответственно для подключения -калиброванного резистора. 18, имитирующего утечку в зоне контакта калиброванного ре- зистора 19 - точно компенсирующего эту искусственно введенную утечку.

Для устойчивой работы устройства необходимо выполнение условия, при котором глубина ООС операционного усилителя 1 больше или равна глубине ПОС, в противном случае операционный усилитель 1 возбуждается и амплитуда возбуждения от пика до пика определяется номиналами питающих напряжений и типом операционного усилителя. При работе с известным устройством это возбуждение при прикосновении к мембране клеток растительного происхождения приводит к

появлению стрессовой проводимости. Глубина ООС определяется делителем, состоящим из резистора 3 (0 и последовательного сопротивления микроQ Q

c

5

пипетки 11 (R.wn), глубина ППС ре- зистором h (Н2) и значением переменного резистора 9 (ИЗ) Лля обеспечения устойчивости, таким образом, требуется выполнение соотношения

М

3

На операционном усилителе 2 выполнен дифференциальный усилитель, одновременно являющийся измерителем тока. Неинвертирующий вход операционного усилителя 2 является входом устройства и операционный усилитель

2за счет наличия обратной связи на своем инвёртирую1цем входе поддерживает уровень напряжения поданного

на вход устройства. На неинвертирующий вход операционного усилителя 1 подается напряжение через делитель, образованный резисторами 9 и 4, что вызывает протекание тока по цепи ПОС и ООС операционного усилителя 1, причем протекающие токи обратно пропорциональны сопротивлениям резисторов обратной связи

(ООС) R2

Тпбс) iT

Это означает, что при равенстве глубины ООС и ПОС на кончике микропи- петки 11 поддерживается напряжение, присутствующее на неинвертирующем входе операционного усилителя 2, которое поддерживается равным напряжению на входе устройства.

Таким образом обеспечивается фиксация напряжения на участке мембраны при проведении регистрации тока.

Ток, текущий через микропипетку 11, целиком протекает через резистор

3обратной связи, при этом хлорсереб- ряный электрод 12 служит для соединения двух типов проводников - раствора в пипетке с ионной проводимостью и элементов схемы с электронной проводимостью. Хлорсеребряный электрод 13 является электродом сравнения операционного усилителя 1, через этот электрод отсутствует прохождение тока вследствие очень большого входного сопротивления операционного усилителя 1. Назначение электрода 13 - передача на инвертирующий вход операционного усилителя 1 напряжения в микропипетке 11. При использовании для этой цели электрода 1 может появиться погрешность, связанная с эффектами поляризации этого электрода

515200926

при длительном прохождении тока через кой: резистор 5 (R3) и конденсатор 7

(С2)

него.

Ток, проходящий через резистор 3 представляет из себя сумму токов утечки через сопротивление утечки в зоне контакта микропипетки 11 с мембраной и собственно тока, проходящего через участок мембраны, находящийся под микропипеткой 11, который состоит из тока утечки мембраны, связанного с н.еспец)Лфичной проводимостью, и тока, связанного с активизацией ионных каналов мембраны,.

При работе с устройством осуществляется компенсация токов утечки через сопротивление утечки в зоне контакта и тока утечки собственно через мембрану. Для осуществления компенсации используется тестовый сигнал переменной частоты малой амплитуды, не вызывающий активизации ионных каналов, при этом устройство регистрирует только ток утечки через сопротивление утечки в зоне контакта и ток утечки через участок мембраны. Для компенсации токов утечек используется переменный резистор 10. Компенсация осуществляется путем отвода из текущего в цепи ПОС через резистор 4 (R5) тока, который пропорционален току, проходящему через микропипетку, и тока, пропорционального току утечки. Для обеспечения этого должно выполняться условие

. R1

R2 R5

где RUT эквивалентное сопротивление утечки.

При обеспечении этого условия измеритель тока на операционном усилителе 2 регистрирует ток, который пропорционален току через участок мембраны

и

вых

-I .S.R

-im R2

где и jbix напряжение на выходе А2; 1„- ток, протекающий через

участок мембраны,

откуда может быть получено собственно значение тока

Ujb,«-R2 7

Для обеспечения уменьшения уровня высокочастотных шумов используется конденсатор 7 который задает частоту среза фильтра, образованного цепоч(С2)

f

27R3 C2

5

Переключатели 1б и 17 и калиброванные резисторы 18 и 19 предназначены для осуществления компенсации па0 разитных параметров микропипетки 11 при подготовке устройства к работе.

Подготовка устройства к работе осуществляется следующим образом.

Микропипетка 11, заполняемая раствором, вводится в раствор, где находится электрод 15. Переключатели 16 и 17 переводятся в правое положение по схеме, при этом обеспечивается подключение резисторов 18 и 19. На

0 вход устройства Вход подается тестовый сигнал переменной частоты с известной амплитудой, например прямоугольной или треугольной формы. После этого контролируется сигнал на выхо5 де повторителя 1. При наличии возбуждения изменением сопротивления резистора 9 добиваются исчезновения возбуждения, затем регулировкой коэффициента усиления усилителя 8 до0 биваются, чтобы форма сигнала на выходе Вых. 2 совпадала с формой сигнала, поданного на вход устройства Вход. После этого, путем регулировки сопротивления переменного резисто- ра 9 и корректировки коэффициента усиления усилителя 8, добиваются совпадения формы и амплитуды сигнала на выходе Вых. 2 с сигналом, поданным на вход устройства Вход. На этом

- завершается компенсация паразитных параметров микропипетки 11. При выполнении этой процедуры резистор 18 имитирует искусственную утечку, сопротивление резистора 1б выбирают сравнимым с сопротивлением утечки в предстоящих исследованиях. Сопротивление резистора 19 (Р7) определяется из соотношения

RJI R2

R6 R7

R7

R6 R2 ЙГ

55

После выполнения описанной процедуры гарантируется отсутствие возбуждения операционного усилителя 1 при проведении регистрации.

Для проведения регистрации микропипетку 1 1 подводят к мембране, на вход устройства Вход подают сигнал малой амплитуды, не вызывающий акти m

7152

вации ионных каналов данного объекта После этого переключатели 16 и 17 переводят в левое по схеме положение и, контролируя сигнал на выходе устройства Вых. 1, изменяя сопротивление резистора 10 (R5), добиваются исчезновения сигнала на выходе Вых. 1. На этом заканчивается этап компенсации сопротивления утечки, устройство готово к работе и в объекте, через участок мембраны которого требуется регистрировать ток, отсутствует стрессовая проводимость. На вход устройства Вход можно подавать сигнал, который поддерживается на участке мембраны и регистрирует ток через участок мембраны под микропипеткой 11, который определяется

Ue,b,i. R2

R3

где и g,, - напряжение на выходе устройства Вых. 1.

Использование новых элементов: резисторов 18 и 19, переключателей 1б и 17, и изменение вследствие этого методики подготовки устройства к работе выгодно отличает предлагаемое устройство от известного, так как позволяет осуществить подготовку устройства к работе без прикосновения микропйпетки к мембране исследуемого объекта, что предотвращает возможность возникновения стрессовой проводимости мембраны исследуемого объекта и позволяет применить предлагаемое устройство к большому классу малоизученных, в плане работы и физиологической роли ионных каналов, объектов растительного происхождения, а также увеличивает производительность устройства, так как предлагаемое устройство позволяет одновременно выполнят подготовку объекта и устройства. Формула изобрет ения Устройство для регистрации макроскопических токов через участок на

0

5

0

5

0

5

8

ружной мембраны клетки или изолированного органоида, содержащее два операционных усилителя, три резистора , два конденсатора, усилитель с регулируемым коэффициентом усиления, два переменных резистора, общую шину, стеклянную микропипетку, заполненную раствором с двумя электродами в ней, один из которых подключен к первому входу первого операционного усилителя, второй последовательно через первый резистор - к выходу первого операционного усилителя, второй вход и выход которого соединены через второй резистор, а между входами его последовательно через первый конденсатор подключен усилитель с регулируемым коэффициентом усиления, второй вход первого и первый вход второго операционных усилителей соединены через первый переменный резистор, первый вход и выход второго операционного усилителя соединены через параллельно соединенные второй кон-- денсатор и третий резистор, о т л и- чающееся тем, что, с целью повышения точности регистрации за счет компенсации паразитных параметров микропипетки, оно снабжено повторителем, дополнительным электродом, двумя переключателями и двумя калибровочными резисторами, одна клемма первого переключателя и повторитель подключены к дополнительному электроду, вторая клемма этого переключателя соединена с первым калибровочным резистором, первая клемма второго переключателя связана с первым входом второго операционного усилителя, к второй и первой клеммам которого подключены соответственно второй калибровочный и второй переменный резисторы, а третья клемма первого переключателя и остальные выводы второго переменного и калибровочных резисторов - к общей шине.

Вых. 1

0 Вход

Изобретение относится к физиологии клетки, а более конкретно к устройствам исследования клеточных мембран преимущественно растительного происхождения. Цель изобретения - повышение точности регистрации токов за счет компенсации паразитных параметров микропипетки - достигается за счет введения повторителя, дополнительного электрода, двух переключателей и двух калибровочных резисторов. Эти узлы позволяют подготавливать устройство к работе без прикосновения к мембране клетки, что гарантирует отсутствие возникновения стрессовой проводимости мембраны. 1 ил.