Способ определения цитохромоксидазы в фотосинтезирующих организмах Советский патент 1989 года по МПК C12Q1/26 G01N21/63 

Изобретение относится к экспериментальной биохимии и физиологиии растений, а именно к экспресс-методам определения ключевого дыхательного, фермента цитохромоксидазы в целых клетках и тканях фотосинтези-

рукядих организмов, и может быть использовано в научных исследйваниях по растениеводству и биотехнологии культур фототрофных микроорганизмов- для диагностической характеристики типа и функционального состояния дыхаот

ни

способа за счет предотвращения инак- ти:зации фермента путем сохранения структурной целостности образца,

На чертеже спектры действия пог- лойения 0 при фотодиссоциации комп- лехсов цитохромоксидаза-СО в клетках хлэреллы (а) и листе пшеницы (б) на импульсном монохроматическом свету с не1рерывным фоновым облучением све- то|и 650-700 нм 1,2 ВТ/м . Концентра-

ци|я диурона 10 Пример

гельного метаболизма в зависимости внутренних и внешних факторов. Целью изобретения является ускоре2, упрощение и повышение точности

-S

м.

1. Одноклеточные зелеи 0

В

Pl

ные водоросли хлорелла (Chlorella vulgaris) выращивают 5 дней на агаровом субстрате с минеральной средой

мин в атмосфере воздуха +1% СО пр1и непрерьшном освещении люминесцен тцыми лампами ЛБ-40 5 Вт/м.

На поверхность платинового электрода площадью 20 мм наносят тонкий стой суспензии клеток хлореллы, содержащих 0,5-1 мкг хлорофилла, и фиксируют его целлофановой мембраной. Пс лярографическую ячейку заполняют Щ Одутым газовой смесью 10-20% 0

80-90% СО раствором 0,05 М КС1,

05 М натрий-Лосфатно-го буфера Ч-5

(Н 6,8) и диурона.

Образец освещают непрерывным фоновым светом в области 650-700 нм 1,2 Вт/м. Через несколько минут включают импульсный измерительный срет с длительностью световых и темн X интервалов 1 и 10 с. Спектр изме

тельного света монохроматора со

с}1ектральной шириной щелей 3-10 нм с|санируют в области 400-650 нм со с|соростью 15-20 им/мин. Оптимальная интенсивность измерительного света д|ля всего спектра составляет 1 10 Вт/м. На самописце регистриру- Ю|Т импульсы уменьшения полярографи- ч|еского тока, соответствующие скорос- т|и поглощения С при фотодиссоциации Комплексов цитохромоксидаза - С0„

Измеряют амплитуду импульсов тока Ц после коррекции на распределение ;|нергии измерительного света строят 1| рафик зависимости, относительной; ве-40

45

50

Способ может быть использован не/|голько для качественного определения цитохромоксидазы, но и количественной оценки активности фермента в одноклеточных фотосинтезирующих микроорганизмах.

Приме рЗ. Культуры однокле- точньш водорослей Chlorella vulgaris CALU-246 и Stichococcus mirabilis CALU-256 выращивают на агаровом субстрате со средой № 6 CALU в атмосфере воздуха +1% при освещении 5 Вт/м Образец 7-дневной культуры водорослей фиксируют на электроде и помещают в среду как в примере 1. Образец освещают через монохроматор непрерывным фоновым светом 680 нм 1 Вт/м. Затем на 1г 2 мин включают измерительный свет в области 400-600 нм интенсив Ычины скорости поглощения 0 от дли- 100 Вт/м, который выделяют из

itbi волны (а).

Из спектра действия видно, что ком- itineKC цитохромоксидаза-СО хлореллы имеспектра лампы накаливания светофильтром СЗС22. Регистрируют величину уменьшения полярографического тока

5

0

0

5

0

5

0

5

0

ет полосы поглощения 425-430 и 590- 593 нм (а).

Таким образом, характерная структура спектра действия фотостимуляции поглощения 0 служит основным критерием в качественном определении фермента у исследуемого образца.

П р им е р 2. Проростки яровой пшеницы сорта Московская 36 выращивают 14 дней на вермикулите при световом режиме 14 ч освещения люминесцентными лампами 16 Вт/м и 10 ч темноты.

t

На поверхности платинового электрода фиксируют кусочек листа площадью 20 мм, который инфильтрирован раствором М диурона. Дальнейшая процедура аналогична примеру 1. В связи с более высоким диффузионным сопротивлением ткани листа длитель-, ность импульсов измерительного света увеличивают до 10с, а тет-шовых интервалов до 30 с. Для ограничения времени записи спектра пределами 15- 20 мин диапазон 400-650 нм регистрируют по точкам с интервалами 10- 20 1€м.

Спектр действия фотодиссоциации комплекса цитохромоксидаза-СО в листе шпеницы (б) подобен спектру водорослей. Отличия соотношения амплитуд полос в двух спектрах объединяются более сильным экранирующим эффектом хлорофилла в тканях растения.

Способ может быть использован не/|голько для качественного определения цитохромоксидазы, но и количественной оценки активности фермента в одноклеточных фотосинтезирующих микроорганизмах.

Приме рЗ. Культуры однокле- точньш водорослей Chlorella vulgaris CALU-246 и Stichococcus mirabilis CALU-256 выращивают на агаровом субстрате со средой № 6 CALU в атмосфере воздуха +1% при освещении 5 Вт/м . Образец 7-дневной культуры водорослей фиксируют на электроде и помещают в среду как в примере 1. Образец освещают через монохроматор непрерывным фоновым светом 680 нм 1 Вт/м. Затем на 1г 2 мин включают измерительный свет в области 400-600 нм интенсивно тью 100 Вт/м, который выделяют из

спектра лампы накаливания светофильтром СЗС22. Регистрируют величину уменьшения полярографического тока

на, измерительном свету и рассчитываю скорость поглощения 0 при световом насыщении реакции фотодиссоциации комплексов цитохромоксидаза-СО в клетках образца (по закону Фарадея 1 моль О,/с 3,86 А).

В образце 20 мкл суспензии хлореллы, содержащей 0,85 г сухого вещества клеток на 1 л суспензии, за- регистрирована величина уменьшения полярографического тока при световом насыщении фотостимулированного дьсса- ния 7,9.. Расчет активности (V) цитохромоксидазы в клетках образ да:

V

-10

-i

3,86-10 -2 ,86

1,2

. -«

сух, массы кл. с

В серии из пяти измерений на раз- ньк образцах клеток водорослей эта величина у хлореллы составляет (12i. )103, а у стихококкус () 10 моль сух. массы клеток. . Таким образом, способ выявляет видовые различия в активности реакции фермента.

Количественным критерием активност фермента в образце принимают макси- мальную скорость поглощения 0 при насыщающих интенсивностях света в области 400-600 нм.

Предлагаемый способ определения цитохромоксидазы позволяет определять непосредственно в фотосинте- зирукщем организме без предварительного разрушения образца, вьщеления и очистки фермента, что в сочетании с применением быстрого метода регистрации спектров действия значительно (в 16-33 раза) сокращает время на проведение анализа.

Способ упрощает и повьшает точност определения, так как при очистке те- ряется до 40% фермента, а неопределенные потери его на предшествзтощих стадиях не позволяют оценить содер

0

5

5

5

0

жание и активность цитохромоксидазы в целых клетках и тканях.

Способ позволяет с достаточной точностью диагностировать функциональное состояние дыхательного метаболизма фотосинтетических организмов в зависимости от внешних и внутренних факторов.

Формула изобретения

Способ определения цитохромоксидазы в фотосинтезирующих организмах, вкл рчающий заполнение полярографической ячейки буферным раствором, продувку раствора смесью Oj и СО, вне:сение исследуемого образца, полярографическую регистрацию спектров действия фотостимуляции ингибированной

.окисью углерода реакции поглощения кислорода при воздействии измеритель™ него света в области 400-600 нм с последующей качественной оценкой, отличающийся тем, что, с целью ускорения, упрощения способа и повышения точности за счет предотвращения инактивации фермента путем сохранения структурной целостности образца, в буферньй раствор дополнительно вносят 5-10 мкм диурона, в качестве образца используют клетки или ткани объекта, образец фиксрфу- ют мембраной на поверхности электрода, причем полярографическую регистрацию осуществляют при одновременном непрерывном облучении фоновым светом 650-700 нм интенсивностью 1 Вт/к, а воздействие измерительным све том осуществляют монохроматическим светом переменной дпины волны интенсивностью 1-10 Вт/м, в импульсном режиме дпительностью 1-10 с с темновыми интервалами 10-60 с, с последующей количественной оценкой содержания фермента в образце по максимальной скорости поглощения кислорода при световом насыщении реакции.

-.

.. .

««««««« «

50 500 550 BOO S50 tffi

50 500 550 BOO fiH

«

V

««ui,

Изобретение относится к экспериментальной биохимии и физиологии растений и может быть использовано в научных исследованиях по растениеводству и биотехнологии культур фототрофных микроорганизмов для диагностических целей. Целью изобретения является ускорение, упрощение и повышение точности способа за счет предотвращения инактивации фермента путем сохранения структурной целостности образца. Для определения цитохромоксидазы в фотосинтезирующих микроорганизмах измеряют спектры действия фотостимуляции ингибированного окисью углерода дыхания. При этом исключают этап препаративного получения фермента из разрушенных образцов. Спектры действия реакции цитохромоксидазы регистрируют непосредственно в целых клетках или тканях фотосинтезирующих организмов, у которых селективно подавляют изменения фотосинтетического газообмена О₂. Фотосинтетическое выделение О₂ подавляют ингибитором диуроном. Реакцию фотопоглощения О₂ хлоропластами стабилизируют в режиме светового насыщения путем непрерывного воздействия на образец фоновым светом 650 - 700 нм, который избирательно возбуждает хлорофилл. Ускорение записи спектров действия достигается за счет использования режима импульсного возбуждения комплексов цитохромоксидаза - СО монохроматическим светом переменной длины волны в области 400 - 600 нм, мощностью 1 - 10 Вт/м², длительностью 1 - 10 с с темновыми интервалами 10 - 60 с и полярографической регистрации быстрых фотоиндуцированных изменений скорости поглощения О₂ у зафиксированного на поверхности платинового электрода образца. Количественным критерием активности фермента в образце принимают максимальную скорость поглощения О₂ при насыщающих интенсивностях света 400 - 600 нм. 1 ил.