Способ исследования апо-В-липопротеинов в сыворотке крови Советский патент 1990 года по МПК G01N27/26 G01N33/68 

Изобретение относится к биологии и медицине, а именно к биологической и медицинской химии, и может быть использовано для диагностики.

Цель изобретения - повышение точности способа за счет увеличения числа белковых фракций, идентифицируемых в составе апо-В-липопротеинов (ЛП), и сохранения нативности апобелков при одновременном упрои1ении способа за счет сокраи1ения числа трудоемких операций.

Способ осуществляется следующим образом.

Одновременно проводят электрофорез двух проб наттивной сыворотки и пробы сыворотки, из которой предварительно удаляют апо-В-липопротеины. Затем окрашивают на белок электро- форограммы пробы, лишенной апо-В- липопротеинов, и одной пробы нативной сыворотки и на углеводы вторую пробу нативной сыворотки. Сравнивают элект- рофорограммы, окрашенные на белок, и выявляют апо-В-липопротеины. Сравнивают электрофотограммы нативной сыворотки, прокрашенные на белок и углеводы, и определяют нагруженность

00 N5

00

фракций апо-В-липопротеинов углеводами.

Пример. КО,5 мл сыворотки (плазмы) крови добавляют 0,ОА мл ге- парима (1000 МЕ/мл) и 0,05 мл раство ра хлористого марганца (2 моль/л). После получасовой экспозиции пробы в ледяной бане и последующего ее центрифугирования в течение 30 мин при 3000 .g отбирают пипеткой 0,05 м надосадочной жидкости (т.е. сыворотки, лишенной апо-В-содержащих липо- протеинов) и производят диск-электро форетическое исследование спектра белков, фракционированных в столбиках полиакриламидного геля.

Способ диск-электрофоретического фракционирования белков (гликрпротеи нов) сыворотки крови и супернатанта, не содержащего апо-В-ЛП.

. Реактивы. Исходные реагенты: 1 н. НС1 , ТРИС) тётраметилэтилендиамин (ТЕМЕД), метиленбисакриламид (БИС ил МБА) I персульфат аммония} .рибофлавин сахароза, уксусная кислота ледяная;; 1 н. раствор КОН; 1 моль/л раствора ортофосфорной кислоты.

Схема получения исходных растворо для полимеризации геля.

Раствор 1: рН 8,9; 1 н.НС - ЦВ мл ТРИС - 36,6 г; ТЕМЕД - 0,23 МЛ ,-во- да - до 100 мл.

Раствор 2: акриламид - 30,0 г; БИС - 0,8 Г} вода - до 100 мл.

Раствор 3: аммоний надсернокислый (персульфат аммония) - 0,1 г, вода - до 100 мл (раствор должен храниться не более 7 сут в холодильнике).

Раствор k: рН 6,8, 1 Н.НС1 - 8 мл ТРИС - 5,98 г; раствор ортофосфорной кислоты - 25,6 мл; вода - до 100 мл.

Раствор 5: акриламид - 10, О г,БИС- 2,5 г, вода - до 100. мл.

Раствор 6: рибофлавин - 0,004 г; вода - до 100 мл.

Раствор 7: сахароза - 40,0 г; вода - до 100 мл.

Растворы могут сохраняться в течение нескольких недель (до 4 мес. в темных склянках в холодильнике при ) .

Схема приготовления мелкопористого разделяющего геля с концентрацией по акриламиду kQ г/л; рН 8,9 (смесь 1 ш): 1 объем раствора 1, 2 объема раствора 2{ 1 объем бидистиллирован- ной воды , рН 8,9. К полученной смеси добавляют равный объем раствора 3.

В конечном итоге схема приобретает следующий вид: 1 объем раствора 1-, 2 объема раствора 2, 1 объем бидис- тиллированной воды, рН 8,9, объем раствора 3.

Схема приготовления крупнопористого концентрирующего геля: 1 объем раствора 2; 2 объема раствора 5; 1 объем раствора 6; k объема раствора 7.

Схема приготовления основного раствора для электродного буфера: ТРИС - 6,0 ri глицин - г , вода дистиллированная - до 1000 мл , рН 8,3.Перед употреблением разбавлять в 10 раз.

Схема приготовления раствора красителя: бромфенол синий - 0,001 г; вода дистиллированная - до 100 мл.

Схема приготовления красящего раствора - фиксатора: амидо-черный 10 В - 1,0 г; раствор уксусной кислоты концентрации 10 г/100 мл - до 100 мл.

Консервирующим раствором - дифференциатором является раствор уксусной кислоты концентрации 7 г/100 мл. Оборудование. Для проведения аналитического диск-электрофореза в ПААГ используются отечественные приборы, предназначенные для этой цели: ПЭФА - 1, некторые другие .и аппараты венгерской фирмы Реанал (модель № б9).

Ход выполнения методики. Хранимые в холодильнике реактивы перед исследованием вынимают и выдерживают некоторое время при комнатной температуре для их согревания. Стандартные стеклянные трубочки с отшлифованными концами укрепляют в специальной подставке согласно инструкции, прилагаемой к прибору. Далее приготовляют раствор мелкопористого геля с рН 8,9. Основные растворы (1 объем смеси 1 и 1 объем раствора 3) тщательно смешивают в небольшой склянке. С целью предотвращения образования в Процессе полимеризации геля воздушных пузырьков, в значительной мере препятствующих процессу разделения, желательно удалить из основных растворов воздух, для чего можно использовать подключенный к склянке водоструйный или другой отсос.

в стеклянные -трубочки пипеткой вносят по 2 мл раствора мелкопористого геля, слепя за тем, чтобы в не не попали пузырьки воздуха. На по- верхность этого раствора наслаивают 0,2-0,3 мл дистиллированной воды или разведенного буфера. Для ускорения полимеризации трубки освещают лампой дневного света. По истечении 30 - 0 мин процесс завершается, о чем можно судить по слабому нагреванию стеклянных трубочек, а также по образованию хорошо различимой границы между полиакри.ламидн.ым гелем и водной фазой. Быстрым движением руки осторожно стряхивают с геля наслоенную жи дкость (ее можно удалить из трубок и с помощью фильтровальной бумаги).

При приготовлении раствора крупнопористого (верхнего) геля, отсасывать воздух из| . раствора необязательно, однако готовящуюся смесь желательно предохранять от воздействия яркого света (из-за чувствительности к нему рибофлавина). Стеклянные трубочки ополаскивают 0,1-0,2 мл раствора мономера: (для полного удаления други компонентов) и в каждую колонку пипеткой вносят 0,2 мл раствора мономера, используемого для приготовления крупнопористого концентрирующего геля. Затем известным способом наслаивают 0,1-0,2 мл бидистиллиро- ванной воды.

Полимеризацию геля осуществляют за счет фоточувствительного катализатора рибофлавина. Поэтому штатиоы с гелями располагают около ультрафиолетовой лампы мощностью 250-500 Вт иди другого источника яркого света:

но завершении полимеризации верхнего слоя (на что требуется около получаса) нанесенную жидкость сливают с крупнопористого геля, а геле- вые трубочки ополаскивают-раствором крупнопористого мономера, ранее приготовленного для анализа.

Сформированный (объем 0,2 мл) диск, соприкасающийся с мелкопористым гелем, производит концентрирующий эффект.

В колонку (трубку) вносят 0,01 мл анализируемой сыворотки и. наслаивают электродный буфер, разбавленный в 10 раз. В случае, если пробу вно- сят вместе с крупнопористым мономером, полимеризацию его желательно проводить при ультрафиолетовом освещении. При применении же в качестве разбавителя биологической жидкости

0

раствора мономера с сахарозой (раст- , вор 7) полимеризации не требуется. Верхнюю часть прибора стыкуют с нижним буферным резервуаром, который предварительно заполняют разбавленным в 10 раз буферным раствором. Ухудшающие электрический-контакт воздушные пузырьки удаляют с концов труQ бочек, входящих в буферный раствор нижнего резервуара, многократным, но осторожным встряхиванием раствора или иным способом (например, шприцем с иглой, заполненным электродным бу5 фером). Осторожно приливают в верхний резервуар десятикратно разбавленный буферный раствор. Камеру желательно поместить на время проведения электрофореза в холодильник.

В течение первых 15 мин электрофорез проводят при силе тока, не превышающей 2 мА на каждую отдельную трубочку (для этого нужно установить необходимо напряжение). Затем силу тока следует увеличить до 5 мА на каждую трубочку. Ток пропускают до тех пор, пока окрашенное кольцо буфера не достигает уровня, отстоящего на 5 мм от нижнего края столбика поQ лиакриламидного геля (на что уходит 1 - 1,5 ч). После завершения электрофореза гелевые трубочки вынимают из верхнего резервуара. Гель из стеклянных трубочек можно легко удалить, перемещая стальную иглу в промежутке

между гелем и трубочкой под слоем дистиллированной воды. Извлеченный гель погружают на 20-30 мин в раствор-фиксатор, &несенный в пробирки. После окрашивания гели обеспечивают электрофоретически с помощью специального для этого приспособления.

5

0

Для выявления гликопротеинов столбики полиакриламидного геля фиксируют в течение ночи в водном растворе изопропанола (250 г/л), затем 2 ч отмывают дистиллированной водой и погружают на 50 мин в раствор йодной кислоты концентрацией 10 г/л, приготовленной в 0,2 моль/л раствора

ацетата натрия. После повторного отмывания дистиллированной водой (в течение 1 ч) столбики полиакриламидного геЛя помещают на 50 мин в реактив Шиффа. Затем столбики геля обрабатывают в течение 30 мин (лучше 3 раза по 10 мин) свежеприготовленным 5 г/л раствором метабисульфита натрия и отмывают дистиллированной

водой. Гели хранят в растворе уксусной кислоты концентрации 70 г/л.

Телеграммы белков и гликопротеи нов одной и той же пробы сыворотки (плазмы) сканируют на микроденситометре. Денситограммы диск-электро- фореграмм обрабатывают количественно (путем нахождения площадей пиков, составляющих отдельные фракции белко и гликопротеинов, их суммации и определения относительного количественного содержания)J предварительно осуществив качественную идентификацию белков и гликопротеинов.

Полученные денситограммы дискэлектрофореграмм трех проб одной и той же сыворотки (плазмы) крови,две из которых составляют спектр белков нативной сыворотки (плазмы) и сыворотки (плазмы). Лишенной апо-В-ЛП, а третья - спектр гликопротеинов нативной сыворотки (плазмы), сопостаЁ- ляют, обращая внимание на исчезнувшие (по сравнению со спектрбм сыворотки, лишенной апо-В-ЛП) белки нативной (цельной) сыворотки или плазмы крови (они являются апо-В-липопро ,теинами).и на изменение соотношения .между белковым и углеводным компонен тами в выявленных зонах белков.

При сравнении между собой диск- электрофореграммы белков супернатан та плазмы и диск-электрофореграммы белков .плазмы видно отсутствие в спектре белков супернатанта плазмы ряда белковых фракций, обнаруживаемых в плазме крови между линией старта и трансферрином.

Более полное представление об это дают деиситограммы соответствующих диск-электрофореграмм белков супер- натанта плазмы, лишенной апо-В-ЛП и самой плазмы.

Следовательно, используя предлагаемый способ получения, апо-В-ЛП, становится возможным не только выявить их место в диск-электрофорети

ческом спектре белков, но и судить о.б изменении (если таковое -имеет место) соотношения между углеводными и белковыми компонентами в апо-В- ЛП при разных формах патологии.

Использование изобретения позволяет повысить точность исследования за счет увеличения числа белковых фракций, идентифицируемых в составе апо-В-липрпротеинов, а также за счет двухкратного снижения ошибки измерения, упростить способ за счет сокращения трудоемких операций (в 1,3 раза) и времени исследования (в )| сохранить нативность исследуемых апобелков.

Форм, ула изобретения

Способ исследования апр-В-липо- протеинов в сыворотке крови, включающий осаждение апо-В-липопротеинов и идентификацию апобелков дискэлектфорезом в полиакриламидном геле, о т л и ч а ю щ и и с я тем, что, с целью повышения точности способа за счет увеличения числа белковых фракций, идентифицируемых в составе апо-В-липопротеинов, и сохранения нативности апобелков при одновременном упрощений спос.оба за счет сокращения числа трудоемких операций, одновременно проводят электрофорез

двух проб нативной сыворотки и пробы сыворотки, из которой предварительно удаляют апо-В-липопротеины, затем окрашивают на белок электрофореграммы пробы, лишенной-апо-В-липопротеинов,

и одной пробы нативной сыворотки и на углеводы вторую пробу нативной сыворотки, сравнением электрофореграмм, окрашенных на белок, выявляют апо-В- липопротеины, а сравнением электрофореграмм нативной сыворотки, прокра- шенных на белок и углеводы, определяют нагруженноСть фракций апо-В-липопротеинов углеводами.

Изобретение относится к области биологии и медицины, а именно биологической и медицинской химии, и может быть использовано для диагностики. Цель изобретения - повышение точности исследования за счет увеличения числа белковых фракций, идентифицируемых в составе апо-В-липопротеинов, и сохранение нативности апобелков при одновременном упрощении способа за счет сокращения числа трудоемких операций. Способ заключается в том, что одновременно проводят электрофорез двух проб нативной сыворотки и пробы сыворотки, из которой предварительно удаляют апо-В-липопротеины, затем окрашивают на белок электрофореграммы пробы, лишенной апо-В-липопротеинов, и одной пробы нативной сыворотки и на углеводы вторую пробу нативной сыворотки. Сравнивают электрофореграммы, окрашенные на белок, и выявляют апо-В-липопротеины. Сравнивают электрофореграммы нативной сыворотки, прокрашенные на белок и углеводы, и определяют нагруженность фракций апо-В-липопротеинов углеводами. Способ позволяет выявить соотношения между углеводными и белковыми компонентами в апо-В-липопротеинах при разных формах патологии.