Способ оценки повреждающего действия веществ, контактирующих с роговицей Советский патент 1990 года по МПК G01N33/52 

., Изобретение относится к офтальмо- ,логии и может быть применено при исследовании новых ирригационных и влагозамещающих растворов, а также изучении . биологических свойств полимеров, используемых для интраокулярной и контактной коррекции.

Цель изобретения - увеличение точности способа за счет повышения его физиологичрости,

Способ осуществляется следующим образом.

Используют роговицу кроликов сам- цов породы шиншилла весом в среднем 2,0 кг. После забоя животных глаза сразу же знуклеируют, а затем из глаз

выделяют с-помощью трепана центральный диск роговицы диаметром 7,7 мм. Роговичный диск помещают на дно инкубационной кюветы э щотелием вверх в сре,цу, содержащую 2,0-3,0 мл 0,9%-но- го физиологического (NaCl) или исследуемого нлагозамещающего раствора, содержащего тестируемый агент. Процедура вьщеления роговицы занимает 8- 15 мин с момента забоя животного до получения готового исследуемого образца. Инкубацию роговицы проводят при комнатной температуре. Поддерживают нейтральньп 7j0-7,3 показатель рН среды. Кинетику окисления экзогенных пиридиновых нуклеотинов (НАДН

а

со

:i

,йли НАРФН), добавленных в среду с ioмeнтa начала инкубации роговицы в 1|:онцентрации , измеряют флюоресцентным способом (возбуждбние при 360 нм, регистрация при длине волны максимума испускания 460 нм). Все флюоресцентные измерения выполняют на спектрофлюориметре. Для снижения влияния возможных оптических артефактов флюоресценцию возбуждают узким пучком совета (1-3 мм), направленным вдоль Передней (обращенной к регистрирую- ,1|1ему монохрома тор у) стенки кварцевой : ювьты. По увеличению скорости оки- .еления пиридиновых нуклеотидов (ско- $)ости спада интенсивности флюоресценции) судят о степени повреждения роговицы. За скоростью окисления нуклеотидов можно следить и спектрофотомет- I |5ически при 340 нм.

П р и м е р Т. Проводили исследование поверждающего действия на рого- Ьицу 0,9%-ного физиологического раствора.

Роговицу кролика вьщелили из глаза. При помещении роговицы кролика в 0,9%-ный физиологический раствор в течение первых 10 мин увеличивалась интенсивность флюоресценции раствора В том случае, если роговица после извлечения из глаза предварительно инкубировалась в течение 20 мин в физиологическом растворе, не содержащем НАДН, в результате ее значи- тельного повреждения к этому времени в окружающей среде накапливались вещества, обладающие НАДН-дегидрогеназ ной активностью. Добавка пиридиновог нуклеотида на 20 мин инкубации ткани немедленно приводила к увеличению. НАДН-окислительной активности роговицы и одновременному снижению интенсивности исходного уровня флюоресценции. Указанная экспериментальная кинетика окисления НАДН полностью соответствует ожидаемой.

П р и м е р 2. Исследование действия ра роговицу сбалансированного солевого раствора о

При инкубации изолированной роговицы кролика в среде, содержащей сбалансированный солевой раствор, и добавлении пиридиновых нуклеотидов отмечался менее выраженный двухфазный характер изменения интенсивности флюоресценции раствора. Таким образо сбалансированньй солевой раствор

ограничивает осмотическое повреждение ткани роговицы.

П р и м е р 3, Исследование действия на роговицу влагозамещающего раствора - таурина (тауфона),

Известно, что указанный раствор (0505%, рН 7,2) благоприятно влияет на процессы регенерации при повреждении задных слоев роговицы с формированием тонкого рубца. Данные, полученные при помещении изолированной роговицы кролика в раствор тауфона, свидетельствовали о предотвращении повреждения мембран клеток роговицы. Указанный эффект проявлялся в равной степени и на снижении уровня выхода флюоресцирующих субстратов из ткани роговицы, и на снижении их НАДН-оКи- слительной активности.

Пример 4. Исследование действия на роговицу карнозина (/3- аланил-1-гистидина), 10 мМ раствора, рН 7,2-7,3.

Установлено, что репаративные процессы в тканях, транспорт ионов Са 5 Na, К и реакции окислительного фосфорилирования после предварительного их нарушения, вызванного повреждающими воздействия, протекали на более благоприятном уровне в присутствии гистидиноБьк депептидо в силу сохранения дипептидами физиологических свойств мембран и уменьшения утечки ионов. Целью исследования действия карнозина - природного соединения гистидиновых дипептидов, на нарушение барьерных свойств.мембранных структур клеток роговицы кролика было определение возможности использования карнозина в клинике ка влагозамещающего раствора. В присутс .ВИИ карнозина (10 мМ) сравнительно с физиологическим раствором отмечался существенный зашдтный эффект на ранних стадиях повреждения клеточных структур роговицы. Оё этом свидетельствуют незначительные изменения флюоресценции экзогенного НАДН (т..е. наличие малой скорости его окисления) , присутствующего в среде инкубации роговицы.Таким образом,карнозин можно реко мендовать для дальнейших испытаний ка к вещество, защищающее роговицу от повреждающих воздействий и перспективное для апробации в клинике в виде влагозамещающего раствора-.

Пример 5. Изолированную ткань роговицы, инкубировали в растворе HuPi (), содержащем НАДФН (5« ) сбалансированньШ раствор Хэнк са. Кинетику окисления НАДФН регистри ровали по снижению оптической плотности поглощения при длине волны 340 нм на спектрофотометре ShimadzXi UV-260. Через Т5-20 мин инкубации отмечали зна1чительный спад поглощения (от 0.80 и 0,68) отбираемых проб инкубационной среды. Снижение величины оптической плотности при 340 нм раствора, содержащего НАДФН, свидетельствовало об освобождении водорастворимых ферментов (например, глутатион-редукта- зы), обладающих НАДФГ-дегидрогеназной активностью, из ткани роговицы.

Предлагаемьй способ позволяет по сравнению с прототипом повысить точность способа за счет повышения его физиологичности,

Применение способа обеспечивает метаболический контроль роговицы на ранних этапах ее повреждения агентом, что позволяет повысить точность тестирования агента. Предлагаемьй способ дает возможность изучать механизм i и последовательность био- Лпчических реакций, приводящих к отеку роговицы и потере ее прозрач16

10

5

7377. .

ности. Способ позволяет осуществлять выбор биологических соединений, способных защищать эндотелий роговицы от повреждения, указывать оптимальный состав ирригационных жидкостей и вла- гозамещающих растворов, изучать биологические свойства полимерных материалов, используемых в офтальмологии. Прямее и продолжительное определение редокс-состояния НЛ/Щ в среде инкубации роговицы позволяет количественно судить об активности процессов, происходящих при токсических воздействиях на роговицу.

15

Формула изобретения Способ оценки повреждающего действия веществ , контактирующих с роговицей, включающий добавление исследуемого вещества в среду инкубации препарата изолированной роговицы и регистрацию окислительно-восстановительных реакций в среде инкубации, от.личающийся тем, что, с целью увеличения точности способа за счет повышения его физиологичности, в среду инкубации дополнительно вводят раствор восстановленного пиридинового нуклеотида и регистрируют скорость его окисления, по которой оценивают степень повреждающего действия,

Изобретение относится к области медицины - офтальмологии и может быть использовано при исследовании новых ирригационных и влагозамещающих растворов, а также изучении биологических свойств полимеров, используемых для интраокулярной и контактной коррекции. Цель изобретения - повышение точности способа за счет увеличения его физиологичности. Способ состоит в инкубации препарата роговицы с исследуемым веществом и регистрации скорости окисления восстановленных пиридиновых нуклеотидов (НАДН или НАДФ Н), добавленных в среду инкубации. Скорость окисления регистрируют флюорометрически или спектрофотометрически, и по ее величине оценивают степень повреждающего действия вещества. Способ позволяет исследовать биологическое действие на роговицу материалов и препаратов, используемых в фармакологии.