СПОСОБ ОЦЕНКИ ПОВРЕЖДАЮЩЕГО ДЕЙСТВИЯ ВЕЩЕСТВ НА ТКАНЕВЫЕ СТРУКТУРЫ ГЛАЗА Российский патент 1998 года по МПК G01N33/68 A61F9/00 

Предлагаемое изобретение относится к офтальмологии, а именно к способам оценки повреждающего действия различных веществ, применяемых для внутриглазного введения.

При разработке способов лечения глазных болезней, требующих введения лекарственных препаратов во внутренние среды глазного яблока, необходимо осуществлять подбор доз, при которых минимально травмируются клеточные структуры. В настоящее время для экспериментальной оценки подтверждающего действия лекарственных препаратов и других веществ на внутриглазные клеточные структуры используют гистологические способы. Подобные способы проводятся на энуклеированных глазах, требуется длительное время для их осуществления, кроме того происходит обнаружение только сильно выраженных изменений. Таким образом, ведущим недостатком гистологического способа является его недостаточная информативность, обнаружение только выраженных, грубых изменений, а также невозможность использования in vivo, что усложняет проведение экспериментальных исследований.

Описанный способ является способом-прототипом (В.Н.Ермакова с соавт. Пролонгирование полиглюкином действия клофеллина.- Хим.-Фарм. Журн., 1990, т. 24, N 3, с. 86-88).

Лактатдегидрогеназа (ЛДТ) - фермент класса оксидоредуктаз, катализирующий на последней стадии гликолиза обратимую реакцию окисления молочной кислоты до пировиноградной.

ЛДГ находится главным образом в клеточной цитоплазме и легко выходит из клетки при нарушении проницаемости цитоплазматической мембраны. Поэтому изменение выхода ЛДГ во внеклеточное пространство можно использовать для раннего обнаружения повреждения клеток.

Анализ литературы за последние 14 лет показал, что этот тест наиболее часто используется в клинике в комплексной диагностике инфаркта миокарда. При инфаркте миокарда рост активности ЛДГ в сыворотке крови наблюдается в первые 12-24 часа после инфаркта, максимальная активность отмечается в 24-48 часов. Повышенная активность фермента держится вплоть до 10 суток. Активность ЛДГ в сыворотке крови коррелирует с размерами повреждения миокарда (Долгов В. с соавтор. Клинико-диагностическое значение лабораторных показателей. - М., 1995).

Тест применялся в дерматологии для оценки раздражающего действия некоторых видов шампуней на кожу. Тест проводился на модели культуры эпидермальных кератиноцитов (Eun H.C., Jung S.Y., 1994).

В офтальмологической литературе имеются следующие сведения об использовании этого метода для выявления повреждения клеток.

Это количественный метод оценки повреждения эпителия роговицы и конъюктивы после применения местных глазных препаратов, содержащих цитотоксические консерванты, при этом определение ЛДГ происходило в слезной жидкости (Haeringen, 1976, Fullard, 1985).

Тест для оценки степени повреждения эпителия роговицы при использовании контактных линз, также с определением ЛДГ в слезной жидкости (Lshijima, 1992).

В качестве метода оценки жизнеспособности культуры ткани слезной железы использовали измерение активности ЛДГ в инкубационной среде: если активность ЛДГ в среде не возрастала выше базального уровня в течение 40 мин инкубации, то это свидетельствовало об отсутствии лизиса клеток во время инкубации (Bromberg, 1986).

Однако лечение и профилактика многих глазных заболеваний требует введения лекарственных препаратов, различных веществ во внутренние среды глазного яблока: стекловидное тело и переднюю камеру, механического, в том числе и лазерного воздействия на внутриглазные структуры. ЛДГ-тест не использовался для оценки повреждений внутриглазных структур, а изменение активности ЛДГ в слезной жидкости при этом не происходит.

В данной работе исследовали активность ЛДГ в стекловидном теле и во влаге передней камеры для оценки цитотоксического действия инъецированных интравитреально и в переднюю камеру растворов. В экспериментах на кроликах при помощи данного способа были определены токсические эффекты на ткани глазного яблока различных концентраций озонированного физиологического раствора, физиологического раствора и гентамицина, а также произведено измерение активности ЛДГ в интактных глазах здоровых животных и изменение активности ЛДГ в ответ на травму, производимую при пункции стекловидного тела и парацентезе роговицы.

Результаты биохимических исследований показали следующее.

Уровень общей активности лактатдегидрогеназы интактного глаза здорового животного колебался в пределах 12,54 ± 1,28 мкмоль/мин•мл.

Воздействие травмы глазного яблока, необходимой для введения в полость стекловидного тела исследуемого раствора, а именно прокол склеры и забор 0,1-0,2 мл стекловидного тела, по результатам экспериментов не оказало практически никакого влияния на уровень активности ЛДГ в стекловидном теле. Активность составила 13,07 ± 1,15 мкмоль/мин•мл.

Введение стандартного физиологического раствора в стекловидное тело повысило уровень активности ЛДГ до 14,51 ± 2,71 мкмоль/мин•мл. При этом разница между данными всеми тремя показателями статически не достоверна.

Интравитреальное введение гентамицина в терапевтически допустимых концентрациях резко повысило уровень активности ЛДГ в стекловидном теле, который составил 33,32±3,54 мкмоль/мин•мл. Разница между данным показателем и уровнем активности ЛДГ в предыдущих сериях статистики достоверна.

При интравитреальном введении озонированных физиологических растворов были получены следующие результаты.

Введение озонированного физиологического раствора с концентрацией 2 мг/л повысило уровень активности ЛДГ до 21,62±3,70 мкмоль/мин•мл, 4 мг/л - до 25,5 мкмоль/мин•мл, 6 мг/л - до 32,65±1,94 мкмоль/мин•мл. Разница между значением активности ЛДГ при 6 мг/л и значениями ЛДГ при других концентрациях озонированных физиологических растворов статически достоверна.

Таким образом, результаты биохимических исследований показали, что введение озонированного физиологического раствора в концентрации 2-4 мг/л не вызывает значительного повышения активности ЛДГ по сравнению с применением стандартного физиологического раствора, при введении озонированного физиологического раствора в концентрации 6 мг/л уровень активности ЛДГ был практически одинаков с уровнем активности ЛДГ при введении терапевтически допустимых доз гентамицина.

Оценка цитотоксичности по активности ЛДГ позволяет быстро выявлять повреждающее действие еще до проявления клинических и патоморфологических изменений. Этот способ не требует энуклеации глазного яблока и животное может быть использовано в повторных экспериментах. Кроме того, при необходимости оценки повреждающего действия лекарственного препарата способ может быть использован и у больных.

Способ осуществляется следующим образом. У экспериментального животного или больного проводят пункцию стекловидного тела и забирают 0,1 мл стекловидного тела или через парацентез роговицы забирают 0,1 мл влаги передней камеры.

Общую активность ЛДГ определяют, например, с помощью набора фирмы CORMEY (Польша), в котором используют кинетический метод, основанный на измерении уменьшения оптической плотности НАДН в ходе реакции, катализируемой лактатдегидрогеназой
Пируват + НАДН + Н⁺ = L-лактат + НАД.

Используемый набор предназначен для определения активности ЛДГ в сыворотке крови, поэтому методика нами была специально модифицирована для измерения активности этого фермента в стекловидном теле и в передней камере с учетом объемов. Инкубационная среда содержала 25 мкл стекловидного тела или влаги передней камеры, 200 мкл раствора НАДН (0,18 ммоль/л) и пирувата (0,6 ммоль/л) в фосфатном буфере pH 7,5. Реакцию запускали добавлением стекловидного тела или влаги передней камеры и проводили при температуре 25^oC. Оптическую плотность проб измеряли через 1, 2, 3, 4 мин. Для измерения использовали биохимический анализ FP-9 (фирмы Labsystems, Финляндия). Определяли среднее изменение оптической плотности за одну минуту (ΔE/мин) .
Расчет общей активности ЛДГ производили по известной формуле
A_o = ΔE•372/1000 , мкмоль/мин•мл,
где
A_о - общая активность фермента в 1 мл стекловидного тела или во влаге передней камеры;
ΔE - среднее изменение оптической плотности за одну минуту;
372 - коэффициент, рассчитанный по калибровочной кривой зависимости оптической плотности от концентрации НАДН в пробе.

Определение ЛДГ можно проводить и с помощью других наборов, при этом следует производить подбор реагентов с учетом количества исследуемого материала.

При показателях активности ЛДГ в стекловидном теле и во влаге передней камеры в 2,5 раза и более вещество, вводимое в стекловидное тело или переднюю камеру надо рассматривать токсичное для тканевых структур глазного яблока. Данные результаты подтверждены гистологически, когда при повышении активности ЛДГ в 2,5 и более раз наблюдались патологические изменения тканей на гистологических препаратах.

Пример. Кролик N 25. Через парацентез склеры введен стандартный физиологический раствор в количестве 0,3 мл. Через 30 мин через тот же прокол 0,2 мл стекловидного тела и по вышеописанной методике определена активность ЛДГ в пробе. Она составила 14,5 мкмоль/мл•мин.

Предлагаемый способ относится к офтальмологии, а именно к способам оценки повреждающего действия веществ на тканевые структуры глаза. Сущность способа: производят определение уровня лактатдегидрогеназы во влаге передней камеры и в стекловидном теле и при увеличении его в 2,5 и более раз оценивают действие веществ как повреждающее. Способ оперативен, не травматичен по сравнению с известными.

Способ оценки повреждающего действия веществ на тканевые структуры глаза, отличающийся тем, что производят определение уровня лактатдегидрогеназы во влаге передней камеры или в стекловидном теле и при увеличении его в 2,5 и более раз оценивают действие веществ как повреждающее.