Способ анализа жидкой среды на присутствие мелатонина Советский патент 1991 года по МПК G01N33/18 

f

(21)4626084/13

(22)28.12.88

(46) 30.04.91. Бюл. № 16

(71)МГУ им. М.В.Ломоносова

(72)О.В.Бурлакова, В.А.Голиченков, Е.Н.Калистратова и Д.В.Попов

(53) 591.481:591.176:597.8(088.8) (56) Mori Wo, Lerner А.В. A.micro- scopie bioassay for melanonin.- Endocrinology, v. 67, 1960, № 4, p.443-450.

Bagnaro J.T., Taylor J.D. и Hadley M.E. The dermal chromatophore unit.- J.Cell.Biol, V. 38,1968, p.67-79.

Ralph Ch.L., Lynch H.J. A.quanti-. tave melatonin bioassay.- Gen.and Сотр. Endocrinology, V.15, 1970, p.334-338.

Higben L., Slome D. The pigmentary effector system. VI. The duel character of endocrine coordination in amphibian colour change.-Proc. Roy.Soc., London В., 1931, V.108, p.10-53. ,

(54) СПОСОБ АНАЛИЗА ЖИДКОЙ СРЕДЫ НА ПРИСУТСТВИЕ МЕЛАТОНИНА (57) Изобретение относится к способам биологического определения гормонов и биологически активных соединений и может быть использовано в биотехнологии, эндокринологии, фармакологии. Целью изобретения является повышение точности и упрощение анализа, а также расширение функциональных возможностей способа. Изолированные участки кожи предварительно адаптированных к темному фону личинок бесхвостых амфибий выдерживают в культуральной среде с испытуемым образцом общим объемом 1-2 мл на свету в течение не менее 30 мин. После чего регистрируют характер распределения пигмента в меланофррах, используя меланофорный индекс, в зависимости от которого определяют наличие или отсутствие мелатонина в испытуемом образце. 1 табл.

3

щ

о

СП

оо со

ГчЭ

Изобретение относится к способам биологического определения гормонов и биологически активных соединений в испытуемых образцах и может быть применено в практике биологических исследований, биотехнологии, эндокринологии, фармакологии, в частности - мелатонин может быть исследован в практике зоотехнических работ, ветеринарии и медицине, как регулятор биологических ритмов животных и человека (уровень гормона мелатонина в организме определяет суточные и сезонные колебания функциональной активности позвоночных животных и человека, применение этого гормона позволяет корригировать нарушение физиологических ритмических процессов в организме) .

Цель изобретения - повышение точности и упрощение анализа, а также

расширение функциональных возможностей способа.

Использование в качестве тест-объекта изолированных участков кожи личинок бесхвостых амфибий позволяет увеличить точность анализа за счет повышения специфичности реакции пигментных клеток, так как исключаются влияния собственной эндокринной системы целого животного. К тому же, использование изолированных участков кожи позволяет в 10 раз снизить объем тестируемых образцов.

Способ значительно повышает точность определения, благодаря исключению реакций пигментных клеток других типов, присутствующих в коже взрослых животных и влияющих на суммарную светопроницаемость кожи. Использование кожи личинок бесхвостых амфибий значительно упрощает способ, не требуя для регистрации ответа специального фотометрического оборудования и высокой квалификации исполнителя, что значительно удешевляет определение. При этом не ограничивается время проведения тестирования в течение суток за счет исключения влияния на реакцию пигментных клеток собственной суточной ритмики эндокринной системы организма, что упрощает способ и обеспечивает его применение в любых областях народного хозяйства для серийного определения, при этом уменьшается количество животных, необходимы для тестирования (3 кусочка изодиро- ванной кожи или 1,5 личинки на одно разведение и 10 личинок в прототипе) поскольку исключаются индивидуальные различия в реакции целых животных. Это упрощает определение и сохраняет животных. Предлагаемый способ расширяет круг тес-объектов, поскольку возможно использование для тестирования личинок многих видов бесхвостых амфибий.

Способ реализуют следующим образом.

Пример 1. В качестве тестируемого образца берут раствор синтетического препарата мелатонина в концентрации г/л. Выполняют шест последовательных 10-кратных разведений тестируемого образца в стандарт ном физиологическом растворе для холоднокровных животных (объем каждого разведения 2 мл) . Берут 9 личинок

0

5

0

5

5

0

5

травяной лягушки, предварительно содержащихся 45 мин в сосуде г темным дном на свету для того, чтобы пигмент в меланофорах кожи максимально диспергировал (личинка благодаря этому выглядит черной). Лезвием безопасной бритвы вырезают симметричные сегменты головного участка под глазами (левая и правая теки) каждого головастика. По три изолированных указанным образом кусочка помещают в каждое приготовленное разведение образца так, чтобы кусочки от одной личинки оказались в разных тестируемых пробах. Через 30 мин кусочки кожи помещают в фиксатор (47,-ный формалин), просматривают под лупой, отмечают количество пигментных клеток меланофорным индексом

0

5

50

11 П 11 -) 11 11 п И

и выводят средний меланофор- ный индекс (М1) для 100 просчитанных клеток трех кусочков кожи, инкуПиру- емых в одном разведении. В результате средний М1 пигментных клеток кусочков кожи, инкубированных в первом разведении (1 «10 г/л) испытуемого препарата, низок (средний М1 1,5), в кусочках из второго разведения степень дисперсии минимальна (М1 1) . В кусочках кожи из третьего и четвертого разведений М1 1,8 и М1 1,3 соответственно, в пятом и шестом разведении пигмент в меланофлрах инкубированных кусочков кожи диспергирован (М1 4,3 и Ml 4,1 соответственно), I т.е. отсутствует реакция на мелато- нин (считают, что реакция агрегации пигмента отсутствует, если ). Следовательно, в четвертом разведении (наименьшем, где обнаружена реакция меланофоров на мелатонин) концентра- ( ция мелатонина определяется равной 1 -10 г/л, т.е. в исходном образце концентрация мелатонина составляет г/л,

Пример 2. Берут 1 мл сыворотки крови взрослой травяной лягушки, выполняют четыре последовательных 10-кратных разведений тестируемого образца сыворотки на стандартном физиологическом растворе для холоднокровных (объем каждого разведения 1 мл). Берут 6 личинок шпорцевой лягушки из сосуда, стоявшего на темном фоне на свету 6 мин (для полной дисперсии пигмента в меланофорах кожи личинки - личинки темные). Лезвием безопасной бритвы вырезают сим 16458

метричные сегменты головного участка личинок под глазами и помещают изолированные таким обратом кусочки по Зшт. в каждое разведение тестируемого образца так, чтобы кусочки от одной личинки оказались в разных тестируемых пробах. Через 45 мин кусочки помещают в фиксатор, просматривают кусочки под лупой и определяют сред- jg нИй Ml меланофоров кожи изолятов, взятых из каждого разведения. Получили, что средняя степень дисперсии пигмента в меланофорах в первом разведении испытуемого образца Ml 2,1, во 15 ния -ни эндогенные организованные втором М1 4,3; в третьем 4,6, в чет- факторы, ни внешние неспецифические вертом М1 4,0, Таким образом, во втором, третьем и четвертом разведениях образца отсутствует реакция мераздражители; упрощение способа за счет возможности проведения тестирования независимо от времени суток,

ланофоров на мелатонин. В первом раз- 20 так как меланофоры изолированных кусочков кожи не обладают свойственной целому организму изменению чувствив

в исходном образце концентрация мелатонина в 10 раз больше, т.е. 1-10 г/л.

ведении концентрация мелатонина соответствует 1 -10 г/л. Следовательно,

тельности к экзогенным гормонам течение суток. Кроме того, предло- В таблице приведены результаты сте-25- женный способ не требует специаль- пени дисперсии пигмента в дермальных меланофорах изолированных участков кожи личинок амфибии по окончании операции по тестированию синтетического

мелатонина (указаны значения М1 , сред-30 экономичность способа, ние для 100 клеток трех изолированных кусочков кожи, инкубированных в растворах, реакция на мелатонин отсутствует при М1 3,00).

Как видно из таблицы, видовая при- , присутствие мелатонина, предусмат- надлежность личинок, используемых в ривающий помещение бесхвостых амфибий в качестве тест-объекта в культуральную среду, добавление в нее тестируемого образца, вндержиного оборудования и высокой квалификации исполнителя и значительно снижает необходимое для тестирования число животных, что в целом повышает

Формула изобретения Способ анализа жидкой среды на

качестве тест-объекта, не влияет на результаты тестирования. Величина параметров делает определение невозможным. Более длительные сроки инкубации, до вание в ней тест-объекта, регистра- не влияя на результат, увеличивают Цию характера распределения пигмен- время проведения опыта.Увеличение объ- та в пигментных клетках (меланофо- ема тестируемого раствора ведет к снижению чувствительности способа.

При недостаточном времени предварительной адаптации личинок на свету к темному фону не достигается максимальная степень дисперсии пигмента в меланофорах перед изоляцией кожи для тестирования образца, поэтому мо- 50 ностей способа, в качестве тест-объ- жет не наблюдаться различия в М1, екта используют изолированные участ- обусловленных присутствием мелатонина ки кожи предварительно адаптиро- в растворе , Увеличение времени пред- ванных к темному фону в течение не варительной адаптации личинок к тем- менее 45 мин личинок бесхвостых ам- ному фону на свету (более 45 мин) не 55 Фибий, а выдерживание тест-объекта

pax) тест-объекта и определение присутствия мелатонина в тестируемом 45 образце по степени посветления тест- объекта, отличающийся тем, что, с целью повышения точности и упрощения анализа, а также расширения функциональных возможвлияет на результаты тестирования, однако удлиняет время проведения опыта, что нежелательно.

Использование способа определения мелатонина обеспечивает (возможность определения меньших количеств мелатонина в пробе, поскольку разведение образца в 10 раз меньшее, чем в известном способе, так как тестирование проводят на трех изолированных кусочках кожи вместо 10 личинок, как в известном способе; высокую точность способа, что обеспечивается стабильной реакцией пигментных клеток изолированных кусочков кожи, на которые не оказывают влияния -ни эндогенные организованные факторы, ни внешние неспецифические

раздражители; упрощение способа за счет возможности проведения тестирования независимо от времени суток,

тельности к экзогенным гормонам течение суток. Кроме того, предло- женный способ не требует специаль-

ного оборудования и высокой квалификации исполнителя и значительно снижает необходимое для тестирования число животных, что в целом повышает

экономичность способа,

Формула изобретения Способ анализа жидкой среды на

вание в ней тест-объекта, регистра- Цию характера распределения пигмен- та в пигментных клетках (меланофо-

ностей способа, в качестве тест-объ- екта используют изолированные участ- ки кожи предварительно адаптиро- ванных к темному фону в течение не менее 45 мин личинок бесхвостых ам- Фибий, а выдерживание тест-объекта

pax) тест-объекта и определение присутствия мелатонина в тестируемом образце по степени посветления тест- объекта, отличающийся тем, что, с целью повышения точности и упрощения анализа, а также расширения функциональных возможс тестируемым образцом проводят на свету в течение не менее 30 мин, при этом объем культуральной среды составляет от 1 до 2 мл.