Способ определения гонадотропной активности химических соединений Советский патент 1992 года по МПК A01K61/00 

Изобретение относится к искусственному разведению и воспроизводству морских организмов - марикультуре, а именно к способам определения гонадотропного влияния химических соединений на морских беспозвоночных.

Известно применение половых клеток, зародышей и личинок морских ежей в качестве тест-объекта для оценки влияния фармакологических препаратов, токсичности растворимых фракций нефтепродуктов, солей тяжелых металлов и др, Тестируемый препарат вводят в сосуды с водой, где проводят оплодотворение яйцеклеток морских ежей и где протекает их эмбриональное развитие. Оценка тестируемого препарата ведется на протяжении 2-3 сут. (от момента оплодотворения до развития плавающей личинки - плутеуса) путем оплодотворения доли оплодотворенных яйцеклеток, скорости развития эмбрионов и личинок, наличия у них отклонений от нормального развития.

Способ широко используется как у нас в стране, так и за рубежом. Однако он дает возможность определять действие тестируемого химического соединения на оплодотворение и развитие соматических элементов, но не клеток сперматогенного ряда.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату к предлагаемому является морфометрический способ определения действия химических соединений на сперматогенез брюхоногих моллюсков.

Через неделю после инъекции на гистологических препаратах половых желез моллюсков определяют изменение доли сперматогенных клеток: сперматоцитов I порядка, сперматоцитов II порядка, сперма- тид и сперматозоидов по сравнению с контролем. Основным недостатком этого метода является использование в качестве тест-объекта животных, у которых трудно, а чаще невозможно выделить в половом цикле отдельные периоды сперматогенеза и оценить влияние химических соединений на каждый период развития половых клеток, поскольку процессы пролиферации гониев, созревание сперматоцитов t порядка и сперматоцмтов I порядка, формирование сперматид и сперматозоидов протекает одновременно.

XJ Ь

сЈ оо

Целью изобретения является повышение точности оценки избирательного влияния химических соединений на сперматогенез.

Для достижения цели в качестве тест- объекта используют половые железы самцов приморского гребешка.

В основе способа лежит явление годовой цикличности сперматогенеза у приморского гребешка.

Для осуществления способа отбор половозрелых приморских гребешков проводят в определенные стадии их полового цикла. Самцов приморского гребешка в период пролиферации сперматогониев (вторая половина сентября - первая половина декабря), созревания сперматоцитов I и II порядков (вторая половина декабря - первая половина апреля) или созревания спер- матид и сперматозоидов (вторая половина апреля - первая половина мая) берут из природных мест обитания илимарикультур- ных хозяйств и помещают в проточные аэрируемые аквариумы с температурой воды, равной природной, или садки в море. После 2 сут. акклимации животным из опытной группы (10 экземпляров) вводят в аддукторную мышцу 0,1 - 0,5 мл раствора тестируемого химического соединения, а животным контрольной группы (10 экземпляров) такой же объем растворителя. Планирование эксперимента и расчет концентраций тестируемых химических соединений подробно описаны в ряде руководств по фармакологии.

Продолжительность опыта 14 сут. Затем кусочки семенников опытных и контрольных животных фиксируют в жидкости Буэна и готовят из них гистологические препараты по общепринятой методике. Количество и состав сперматогенных клеток в ацинусах просчитывают под микроскопом при увеличении 1000х с помощью окулярной сетки на 500 клеток. Плотность клеток сперматоген- ного ряда определяют делением суммы просчитанных клеток на число просчетов. Достоверность различий результатов, полученных в опыте и контроле, определяют с помощью стандартных статических методов.

Способ осуществляют следующим образом.

I. Определение гонадотропного действия химических соединений на пролиферацию сперматогониев (вторая половина сентября - первая половина декабря).

Пример 1. Моллюсков отбирают в ноябре в период пролиферации сперматогониев. Животным опытных групп однократно вводят в аддукторную мышцу по 0.1 мл масляного раствора, содержащего или 0,1 мг эстрадиола дипропионата, или 5 мг тестостерона пропионата, или 2,5 мг прогестерона, а животным контрольных групп - равное

количество растворителя и выдерживают в проточных аэрируемых аквариумах две недели. Плотность сперматогониев в ацинусах семенников животных опытных групп, по сравнению с контрольными, достоверно

возрастает (в 2,8, 1,9 и 2,6 раз соответственно).

Таким образом, эстрогенные, андро- генные и гестагенные половые стероидные гормоны эстрадиол дипропионат, тестостерон пропионат и прогестерон обладают гонадотропной активностью. Способ позволяет уточнить, по сравнению с прототипом, характер их гонадотропного действия, а именно выявить их положительную гонадотропную активность по Отношению к пролиферации сперматогониев. Одновременное протекание в половой железе других моллюсков (способ-прототип) пролиферации, созревания и формирования сперматогенных

клеток приводит к наличию в семеннике этих животных всех типов клеток, что не дает возможности сделать заключение о действии эстрогенных, андрогенных и гес- тагенных гормонов именно на пролиферацию, а не на сперматогенез в целом.

П р и м е р 2. Моллюсков отбирают в октябре в период пролиферации сперматогониев. Животным опытной группы ежедневно на протяжении двух недель вводят в

аддукторную мышцу по 0,2 мл физиологического раствора, содержащего 5 мкг пептидного морфогена гидры пироГлу-Про- Про-Гли-Гли-Сер-Лиз-Вал-Иле-Лей-Фен (ПМГ), а животным контрольной группы - по

0,2 мл физиологического раствора и содержат в проточных аэрируемых аквариумах. В ацинусах животных опытной группы, по сравнению с контрольной, плотность сперматогониев возрастает достоверно (почти в

два раза). Таким образом, ПМГ обладает положительной пролиферативной гонадотропной активностью.

П р и м е р 3. Моллюсков отбирают в ноябре в период пролиферации сперматогониев. Животным опытной группы ежедневно в течение двух недель вводят в аддукторную мышцу по 0,2 мл физиологического раствора, содержащего 5 мкг даларги- на Тир-Д-Ала-Гли-Фен-Лей-Арг, и животным контрольной группу - по 0,2 мл физиологического раствора. Изменений плотности сперматогониев в ацинусах семенников опытных животных, по сравнению с контрольными, не выявлено. Таким образом, даларгин не обладает пролиферативной гона- дотропной активностью,

П р и м е р 4. Моллюсков отбирают в ноябре в период пролиферации спермато- гониев. Животным опытной группы на про- тяжении двух недель вводят в аддукторную мышцу по 0.2 мл физиологического раствора, содержащего 10 мкг налоксона - блока- тора опиатных рецепторов мю- и дельта-типов, а животным контрольной группы - по 0,2 мл физиологического раствора. Изменений плотности сперматогони- ев в ацинусах семенников опытных животных, по отношению к контрольным, не выявлено. Таким образом, налоксон не об- ладает пролиферативной гонадотропной активностью.

П р и м е р 5. Моллюсков отбирают во второй половине октября в период пролиферации сперматогониев Животным опыт- ной группы ежедневно в течение двух недель вводят в аддукторную мышцу по 0,2 мл спиртового раствора, содержащего 50 мкг индометацина, а животным контрольной группы - равное количество рас- творителя. В ацинусах семенников опытной группы, по сравнению с контрольной, плотность сперматогониев достоверно возрастает (почти в три раза). Таким образом, индометацин обладает пролиферативной гонадотропной активностью.

II. Определение гонадотропного действия химических соединений на созревание сперматогенных клеток (вторая половина декабря - первая половина апреля)

П р и м е р 6. Моллюсков отбирают в первой половине апреля в период созревания сперматоцитов II порядка. Животным опытных групп однократно вводят в аддук- торную мышцу по 0,2 мл масляного раствора, содержащего или 0,1 мг эстрадиола дипропионата, или 5 мг тестостерона про- пионата, или 2,5 мг прогестерона, а животным контрольных групп - равное количество растворителя и выдерживают в проточных аэрируемых аквариумах в течение двух недель. Плотность сперматоцит.рв 11 порядка в ацинусах семенников животных опытных групп, по сравнению с контрольными, достоверно увеличивается (во всех случаях почти в два раза). Таким образом, указанные экстрогенные, андро- генные и гестагенные половые стероидные гормоны обладают сперматоцитогенной го- надотропной активностью. Способ дает возможность определить их влияние не в целом на сперматогенез, а выявить их положительное гонадотропное действие непосредственно на созревание сперматоцитов II

порядка, чего нельзя достигнуть при использовании способа-прототипа.

Пример. Моллюсков отбирают во второй половине декабря в период созревания спеоматоцитов I порядка. Животным опытной группы ежедневно на протяжении двух недель вводят в аддукторную мышцу по 0,2 мл физиологического раствора, содержащего 5 мкг ПМГ, а животным контрольной группы - по 0,2 мп физиологического раствора. В ацинусах семенников животных опытной группы, по сравнению с контрольной, достоверно возрастает плотность сперматоцитов I порядка начала профазы мейоза. Плотность сперматоцитов конца профазы мейоза не меняется. Таким образом, ПМГ обладает спер ч1атоцитогенной гонадотропной активностью, а именно ускоряет созревание сперматоцитов I порядка начала профазы мейоза.

П р и м е р 8. Моллюсков отбирают во второй половине января в период созревания сперматоцитов II порядка. Животным опытной группы ежедневно на протяжении двух недель вводят в аддукторную мышцу по 0:2 мл физиологического раствора, содержащего 5 мкг ПМГ, а животным контрольной группы - по 0,2 мл физиологического раствора. В ацинусах семенников животных опытной группы, по сравнению с контрольной, плотность сперматоцитов II порядка не меняется. Таким образом, ПМГ не обладает сперматоцитогенной гонадотропной активностью.

П р и м е р 9. Моллюсков отбирают во второй половине января в период созревания сперматоцитов II порядка. Животным опытной группы ежедневно на протяжении двух недель вводят в аддукторную мышцу по 0,2 мл физиологического раствора, содержащего 5 мкг даларгина, а животным контрольной группы - по 0,2 мл физиологического раствора и выдерживают в проточных аэрируемых аквариумах. В ацинусах семенников животных опытной группы, по сравнению с контрольной, плотность спер- матоцитов 11 порядка не меняется. Таким образом, даларгин не обладает сперматоцитогенной гочадотропной активностью.

III. Определение гонадотропного действия химических соединений на формирование сперматид. и сперматозоидов (вторая половина апреля - первая половина мая).

Пример 0. Моллюсков отбирают во второй половине апреля в период формирования сперматид. Животным оаытных групп однократно вводят по 0,1 мл масляного раствора, содержащего или 0,1 мг эстрадиола дипропионата, или 5 мг тестостерона пропионата, или 2,5 мг прогестерона, а животным контрольной группы - равное количество растворителя и выдерживают в проточных аэрируемых аквариумах в течение двух недель. Плотность сперматид в ацинусах семенников животных групп, по сравнению с контрольными, возрастает достоверно во всех случаях. Таким образом, указанные эс- трогенные, андрогенные и гестагенные половые стероидные гормоны обладают сперматидогенной гонадотропной активностью. Способ дает возможность, по сравнению со способом-прототипом, уточнить направленность гонадотропного действия гормонов, а именно выявить их влияние на формирование сперматид.

П р и м е р 11. Моллюсков отбирают во второй половине апреля в период формирования сперматид. Животным опытной группы ежедневно на протяжении двух недель вводят в аддукторную мышцу по 0,2 мл физиологического раствора, содержащего 25 мкг ПМГ, а животным контрольной группы - по 0,2 мл физиологического раствора. Изменений плотности сперматид в ацинусах семенников животных опытной группы, по сравнению с контрольной, не обнаружено. Таким образом, ПМГ не обладает сперматидогенной гонадотропной активностью.

П р и м е р 12. Моллюсков отбирают по второй половине апреля в период созревания сперматид. Животным опытных групп ежедневно на протяжении двух недель вводят в аддукторную мышцу по 0,2 мл физиологического раствора, содержащего 5 или 25 мкг даларгмна, а животным контрольной группы - по 0,2 мл физиологического раствора и выдерживают их в проточных аэрируемых аквариумах. Плотность сперматид в ацинусах животных опытных групп, по сравнению с контрольными, не меняется. Таким образом, даларгин не обладает сперматидогенной гонадотропной активностью.

П р и м е р 13. Моллюсков отбирают в первой половине мая в период формирования сперматозоидов. Животным опытных групп однократно вводят в аддукторную .мышцу по 0,1 мл масляного раствора, содержащего или 0,1 мг эстрадиола дипропиона- та, или 5 мг тестостерона пропионата, или 2,5 мг прогестерона, а.животным контрольных групп - равное количество растворителя и выдерживают в проточных аэрируемых аквариумах в течение двух недель. Плотность сперматозоидов в ацинусах семенников животных опытных групп, по сравнению с контрольными, достоверно возрастает. Таким образом, эстрадиол дип- ропионат, тестостерон пропионат и прогестерон обладают сперматозоидогенной

гонадотропной активностью. Способ дает возможность, в отличие от спосоРа-прототи- па, выявить их положительное гонадотроп- ное действие на формирование

сперматозоидов.

П р и м е р 14. Моллюсков отбирают в первой половине мая в период формирования сперматозоидов. Животным опытной группы ежедневно на протяжении двух неДель вводят в аддукторную мышцу по 0,2 мл физиологического раствора, содержащего 25 мкг ПМГ, а животным контрольной группы - равное количество растворителя и содержат в проточных аэрируемых

5 аквариумах Изменений плотности сперматозоидов в ацинусах семенников животных опытных групп, по сравнению с контрольными, не обнаружено. Таким образом, ПМГ не обладает сперматозоидогенной гонадот0 ропной активностью.

Предлагаемый способ относится к области разработок морфологических методов Определения гонадотропной активности химических соединений. Особенности спосо5 ба, т.е. возможность дифференцированной оценки изменений пролиферативной активности сперматогониев, генеза сперматоци- тов I порядка, сперматоцитов II порядка, сперматид или сперматозоидов после воз0 действия химических соединений дают возможность проводить проверку химических соединений на наличие у них способности отказывать положительное или отрицательное влияние на развитие различных типов

5 сперматогенных клеток (сперматогониев, или сперматоцитов I порядка, или сперматоцитов II порядка, или сперматид, или сперматозоидов) и поиски новых химических соединений с такими свойствами.

0 Способ предлагается использовать .в марикультуре при разработке технологий выращивания двустворчатых моллюсков и других беспозвоночных для обеспечения поиска веществ, избирательно влияющих на

5 развитие половых клеток. Способ может быть использован при оценке избирательного действия загрязнений на развитие половых клеток морских беспозвоночных, поиска и оценки состояния акваторий, ис0 пользуемых для выращивания морских беспозвоночных, Способ может быть использован в медицине для предварительной оценки характера гонадотропного действия используемых и. новых

5 фармакологических препаоатов и других химических соединений.

Формула изобретения Способ определения гонадотропной активности химических соединений, предусматривающий отбор моллюсков,

внутримышечное введение им исследуемо-соединения по плотности клеток, о т л и ч аго химического соединения, приготовлениею щ и и с я тем, что, с целью повышения

гистологических препаратов из семенниковточности определения, в качестве моллюмоллюсков, подсчет плотности клеток спер-сков используют самцов приморского грематогенного ряда в ацинусах и суждение о5 бешка, а отбор моллюсков проводят в

гонадотропной активности исследуемогокаждый период сперматогенеза.

Применение: определение гонадотроп- ной активности химических соединений, Сущность- осуществляют отбор моллюсков приморского гребешка в каждый период сперматогенеза, внутримышечно вводят им исследуемое химическое соединение, готовят гистологические препараты из семенников, подсчитывают плотность клеток сперматогенного ряда в ацинусах, по которой судят об активности соединения