Способ получения кожного трансплантата для дермопластики Советский патент 1991 года по МПК A61K35/12 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для закрытия раневой хирургии поверхности.

Целью изобретения является повышение выхода конечного продукта.

Пример. Кожный трансплантат для экспериментальной дермопластики морской свинки (вес особи 200 г, на коже ее боковой поверхности под общей анестезией нанесен хирургический дефект на всю глубину кожной ткани величиной 2x3 см) готовят следующим образом.

Смешивают 8 мл уксуснокислого раствора свиного кожного коллагена в концентрации 5 мг/мл с 1 мл 0,1 М NaOH, 1 мл среды Игла десятикратной концентрации, 110 тыс. клеток лейкоцитарной части крови реципиента - морской свинки (из расчета 10 тыс. клеток на 1 мл окончательной смеси) и 1 мл водного раствора хондроитинсульфа- та концентрацией 0,8 мг/мл. Полученную смесь быстро перемешивают, выливают в пластмассовую чашку Петри диаметром

60 мм и выдерживают в термостате при 37°С в течение 20 мин. После образования колла- генового геля толщиной 0,5 см отделившую- ся от него жидкость сливают, на верхнюю сторону геля наносят предварительно полученные эпидермоциты реципиента в количестве 10 тыс. жизнеспособных клеток на 1 см поверхности геля, суспендированные в среде Игла, модифицированной Дальбекко. с добавлением 10%-ной эмбриональной сыворотки коров. Весь полученный таким образом кожный трансплантат заливают питательной средой Игла, модифицированной Дальбекко, с 10%-ной эмбриональной сывороткой коров.

Эпидермоциты для этих целей выделяют следующим образом. Кожу перед взятием образца протирают спиртом. Взятый образец кожи обрабатывают смесью антибиотиков (пенициллин и стрептомицин в концентрации 1000 ед/мл, нистатин в концентрации 100 ед/мл) дважды в течение 15 мин, затем измельчают на кусочки объеЁ

О

ел о

л

MOM 1-2 мм , которые помещают в 0,2%-ный раствор трипсина. Кусочки кожи обрабатывают трипсином при 37°С в течение 30 мин при постоянном помешивании с помощью магнитной мешалки. Затем смесь немного отстаивают, надосадочную жидкость сливают в центрифужные пробирки и центрифугируют. Оставшиеся кусочки кожи вновь заливают свежим раствором трипсина и повторяют процедуру выделения эпидермоци- тов 3-4 раза. Клетки, оставшиеся после центрифугирования в осадках, собирают вместе и суспендируют в питательной среде Игла, модифицированной Дальбекко, с 10%-ной эмбриональной сывороткой коров. Затем определяют количество жизне- способных эпидермоцитов путем прижизненного окрашивания образца клеток 0,2%-ным водным раствором трипано- вого голубого и доводят концентрацию клеток до 200 тыс. кл/мл питательной среды.

Из полученного таким образом кожного трансплантата вырезают лоскут 2x2 см и помещают на раневой участок морской свинки, при этом 1/3 (2 см2) этого участка остается непокрытой и служит контролем. Сверху накладывают асептическую повязку. Через 2 недели на участке, куда был наложен трансплантат наблюдается образование кожного покрова (без волос). На контрольном участке образуется сухой струп.

П р и м е р 2. Для получения кожного трансплантата смешивают 10 мл уксуснокислого раствора свиного кожного коллагена в концентрации 5 мг/мл, 1 мл 0,1 М NaOH, 1 мл среды Игла десятикратной концентрации, содержащей 65 тыс. клеток лейкоцитарной части крови крысы (из расчета 5 тыс. клеток на 1 мл смеси) и 1 мл водного раствора гиалуроновой кислоты в концентрации 0,5 мг/мл. Полученную смесь выливают в пластмассовую чашку Петри диаметром 60 мм и выдерживают при 37°С в течение 30 мин. После образования колла- генового сгустка (геля), сливают отделившуюся от него жидкость, а на поверхность сгустка наносят эпидермоциты крысы, полученные аналогично примеру 1, из расчета 1 тыс. жизнеспособных клеток на 1 см поверхности сгустка.

Полученный кожный эквивалент помещают на резиновое кольцо, заливают средой Игла с 10%-ной эмбриональной сывороткой коров и ставят в термостат на 37°С. В дальнейшем его используют для изучения взаимодействия лейкоцитов и

эпидермальных клеток с коллагеновым мат- риксом.

П р и м е р 3. Для получения кожного эквивалента смешивают 10 мл уксуснокислого раствора кожного человеческого коллагена в концентрации 5 мг/мл с 1 мл 0,1 М NaOH 1 мл питательной среды Игла десятикратной концентрации, содержащем 130 тыс.клеток лейкоцитарной части крови человека - препарат Лейкот (из расчета 10 тыс. клеток на 1 мл смеси) и 1 мл водного раствора гепарансульфата в концентрации 0,25 мг/мл. Коллагеновый гель из этой смеси получают, аналогично примеру 1, при этом смесь выдерживают в течение 40 мин. Затем на поверхность коллагенового сгустка наносят эпидермоциты человека, полученные аналогично примеру 1, из кусочков кожи человека, взятых при операции в количестве 1 тыс.

жизнеспособных клеток на 1 см2 поверхности сгустка.

Полученный трансплантат помещают на полупроницаемую мембрану Миллипор- 0,2 в проточную камеру при 37°С, где проток среды Игла, модифицированной Дальбекко с 10% эмбриональной сыворотки коров, осуществляют снизу через мембрану. В дальнейшем полученный кожный трансплантат используют для изучения развития

эпидермиса In vitro. Длительность получения кожного трансплантата по предложенному способу составляет всего 20-60 мин (без учета времени выделения эпидермоцитов 2-3 ч) вместо 2-3 недель согласно прототипу. При этом надежность образования коллагенового геля, пригодного для манипуляций с ним, составляет 100%, в то время как вероятность образования сжатой колла- геновой решетки с иммобилизованными в

ней фибробластами составляет 30-50% из- за неоднородности популяций фибробла- стов и связанной с этим их разной функциональной активностью.

Формула изобретения

Способ получения кожного трансплантата для дермопластики путем смешивания раствора уксуснокислого коллагена с клетками с последующим нанесением на подложку эпидермоцитов реципиента, о т л и0 чающийся тем, что, с целью ускорения получения и повышения выхода конечного продукта, дополнительно смешивают раствор уксуснокислого коллагена с клетками с гликозоаминогликоном в количестве 0,55 2,0% от сухого веса коллагена, а в качестве клеток используют лейкоцитарную часть крови реципиента или одногруппного донора.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в хирургии для закрытия раневой поверхности. Цель - повышение выхода конечного продукта. Кожный трансплантат для дермопластики получают путем смешения раствора уксуснокислого коллагена с клетками с последующим нанесением на подложку эпидермоцитов реципиента. При этом дополнительно смешивают раствор уксуснокислого коллагена с клетками с гликозаминогликаном, а в качестве клеток используют лейкоцитарную часть крови реципиента или одногруппного донора.