Штамм бактерий BacILLUS SUвтILIS - деструктор поликапроамидных волокнистых материалов на уровне макро-и микроструктуры Советский патент 1991 года по МПК C12N1/20 C12Q1/18 

Изобретение относится к биотехнологии и касается нового штамма бактерий - деструктора поликапроамидных (ПКА) волокнистых материалов и может быть исполь- зованодляопределения

микробиологической стойкости текстильных материалов, содержащих в своем составе ПКА волокна.

Целью изобретения является получение штамма бактерий Bacillus subtllls ВКМ В- 1676Д(К1), обладающего высокой биологической активностью по отношению к ПКА волокнистым материалам и способного выэывать гидролиз макромолекул ПКА с образованием s-аминокапроновой кислоты.

Штамм выделен из поврежденного микроорганизма капронового волокна. Штамм хранят в чашках Петри на стерильных ПКА волокнах при 100% влажности и температуре 35-37°С.

Штамм имеет следующую характеристику.

Культу рал ьно-морфологические признаки. Клетки палочковиДные, прямые, размером 0,7-0,8 2-3 мкм. Подвижные. Реакция по Граму положительная. Образуют эллиптические по форме эндоспоры, коО

ел о

4 xj

СО

торые располагаются в центре, раздутости спорангия нет.

На мясопептонном агаре (37°С, 48 ч) образует округлые крупные, плоские колонии. Поверхность колоний бороздчатая, ра- диально исчерченная. Колонии серого цвета матовые; мелкоскладчатый центр - беловатый; край волнистый, структура струйчатая.

На мясопептонном бульоне (37°С, 44 ч) без встряхивания рост без помутнения ере- ды, на поверхности образуется складчауо- бугристая кожистая пленка.

Синтетическая среда с минеральным азотом, г/л: глюкоза 3,0; 0,3; КН2Р04 0,1; К2НР04 0,1; MgSCU 0,05; NaC 0,05; СаСОз 0,5; FeSCM 0,0002; агар-агар 15,0. Образует средние круглые; выпуклые в центре колонии, Поверхность колоний ра- диально исчерченная. Колонии матовые, белые, средняя часть колонии более темного цвета; край лопастной, структура струйчатая. На ломтиках картофеля (37°С. 48 ч) образует морщинистую мелкоскладчатую пленку кремового цвета.

Физиолого-биохимические признаки.

Отношение к источникам углерода. Хорошо усваивает и растет на глюкозе, араби- нозе, ксилозе, манните: образует из них кислоту. Не образует газа из глюкозы. Образует ацетоин.

Отношение к источникам азота: нитраты восстанавливает до нитритов; индол не выделяет. Молекулярный азот не использует. Тирозин не разрушает. Фенилаланин не дезаминирует. В дополнительных факторах роста не нуждается. Желатину разжижают. Крахмал и казеин гидролизуют. Каталазопо- ложительный. Растет на среде с 7% NaCI. Облигатный аэроб.

Температурный диапазон роста: от +5 до 55°С; оптимальная область 29-38°С. Оптимум рН 6,7-7,1.

Штамм вызывает нарушение структуры ПКА волокон на уровне макро и микроструктуры.

Деструкция на уровне макроструктуры, контролируемая с помощью электронной микроскопии и рентгеноструктурного анализа, проявляется в разориентации кристаллических областей; расслоении фибрилл до отдельных макромолекул; разрушении кристаллических областей до аморфного состояния.

На основе получения данных выявлено, что показатель биодеструкции (К) в интерва- ле 0,3 свидетельствует об изменении макроструктуры волокнистых материалов.

С помощью ИК-спектроскопии, полярографии и ЯМР - спектроскопии доказана деструкция макромолекул поликапроамида:

образуется 6-аминокапроновая кислота; происходит разрыв углеродных цепочек. Выявлено что эти изменения в микроструктуре волокна соответствуют показателю биодеструкции в интервале 0, 45,0.

Оценку биодеструкции проводили следующим образом. Для этого под микроскопом выявляли типы повреждений волокон в зависимости от нарушения структуры и рассчитывали по совокупности абсолютных и относительных повреждений и показателя биостойкости степень деструкции волокон (К).

Показатель биодеструкции (К) рассчитывали пс следующей формуле:

K(Xi; Х2; Х3) «Д.Х2+ q,X3. где М Х1+Х2+Хз;

N - полное число повреждений;

Xi - число повреждений класса А;

Х2 - число повреждений класса В;

Хз - число повреждений класса С;

см 0,002 - коэффициент веса повреждений класса А;

G2 0,025 - коэффициент веса повреждений класса В;

аз 0,255 - коэффициент веса повреждений класса С.

Повреждения класса А характеризуются совокупностью начальных изменений поверхности волокна в виде обрастания микроорганизмами и продуктами их обмена, слабой пятнистости и испещренности. Повреждения класса А не влияютна изменение внутренней структуры и свойств волокна. Однако при обнаружении этих начальных стадий деструкции можно судить о возникновении процесса повреждения, который в определенных условиях может прогрессировать.

Повреждения класса В объединяют более сильные проявления деструкции: глубокую испещренность, вздутия, утонения, повреждения стенки. Подобные повреждения влияют не только на изменение структуры, но и на изменение свойств волокна: падает механическая прочность, увеличивается удлинение при разрыве.

Для повреждений класса С характерны такие виды, как расслоение, глубокое местное повреждение стенки, распад до отдельных конгломератов. Появление таких повреждений свидетельствует о глубокой биологической деструкции структуры волокна на всех ее уровнях.

Изменение показателя биодеструкцчи в интервале 0,3 соответствует начальным изменениям поверхности волокон; в интервале 0,3 SK 3,55 - деструкции не только поверхности, но и внутренних участков волокон, сопровождающихся изменениями его структуры; в интервале 3,55 К 42,25 - глубокой деструкции структуры волокон на всех уровнях.

Определяли биостойкость ПКА волокон, нитей, нетканных материалов при воздействии на них известного стандартного набора микроскопических грибов и предложенного штамма бактерии. Штаммы, входящие в из- вестный набор тест-культур, следующие: Asperglllus nlger31 - СЭ

A,.terreus8254

Aureobasldium, pullulans 1116 Paecilomyces varlotii1749

Penlcllllum Henlculosum 61-ГЭ P. ochro-chloron1702

Scopularlopsis brevlcaulls 19-ИЭ Trichoderma vlride27-ИЭ

Испытания проводили для грибов при 28±2°С, относительной влажности 90% в течение 1 мес. для бактерий при 35± 2°С, относительной влажности, близкой к 100%, в течение 1 мес. Результаты в табл. 1.

Таким образом, при воздействии штам- ма бактерий Вас. subtllls BKM В-1676Д на ПКА волокнистые материалы показатель биодеструкции находится в диапазоне 0.31- 0,67, что соответствует возрождению не только поверхности, но и внутренних уча- стков волокна. Показатель биодеструкции, равный 0,004-0,32, при воздействии стандартного набора микроскопических грибов свидетельствует о начальной деструкции поверхности волокон.

Для доказательства биодеструкции ПКА волокон на уровне микроструктуры при воздействии предложенного штамма бактерий применяли метод полярографии. При деструкции ПКА волокон на уровне микро- структуры происходит гидролиз макромолекул поликапроамида с образованием Ј-аминокапроновой кислоты.

Определение образования Ј -аминокап- роновой кислоты проводят на полярографе IIV-I Гомельского завода измерительных приборов по трехэлектродной схеме относительно насыщенного коломельного электрода. Используют среду следующего состава, в которой поликапроамидные во- локна служат единственными источниками углерода, мас.%: К2НР04 0,3; КН2Р04 0,1; MgS04 7H20 0,02; СаС12 0,01; NaCI 0,01; 0,5; FeCb 0,1; поликапроамидное волокно 0.5; 0,5.

В колбы емкостью 250 мл вносят по 100 мл среды, засевают суточной бульонной культурой штамма в количестве 3,1 107 клеток/мл и выдерживают в термостате при 35°С. Через каждые сутки отбирают пробы,

добавляют 5 мл насыщенного раствора, содержащего 1 моль/л бикарбоната натрия, 6% формалина и 0,04% желатина. Полученный раствор после продувки аргоном поляг- рафируют в интервале потенциалов ,8-М,5 норм.к.э. Содержание Ј-амино- капроновой кислоты определяют по калибровочной кривой, Данные представлены в табл. 2.

Из табл. 2 видно, что максимальное количество Ј-аминокапроновой кислоты выделяется в среду на 5-е сут, после чего содержание ее в среде уменьшается, что связано с потреблением штамма Ј-амино- капроновой кислоты.

При воздействии стандартного набора микроскопических грибов на ПКА волокна выделения Ј-аминокапроновой кислоты не наблюдают.

Предложенный штамм можно использовать для оценки эффективности защиты волокон от биоповреждений. С этой целью определяют биостойкость ПКА волокон, химически модифицированных нитрофурилак- ролеином (НФА). При этом испытаниям подвергают ПКА волокна тониной 0,7 текс (образец 1) и 0,4 текс (образец 2). Данные представлены в табл. 3.

Из данных табл. 3 видно, что антимикробные волокна тониной 0,7 текс более бак- териостойки сравнительно с волокнами тониной 0,4 текс. Таким образом, предложенный штамм дает возможность выявить волокна, обладающие большим антимикробным эффектом.

П р и м е р 1. Предварительно простери- лизованные ПКА волокна тониной 0,7 текс помещают в количестве 20 мг в стерильные чашки Петри.

Посевной материал получают выращиванием штамма на скошенном мясо-пептон- ном агаре в течение суток при 35°С. Готовят суспензию бактериальных клеток в концентрации 106 клеток на 1 мл стерильной воды и заражают ею 20 мг волокна.

В течение 1 мес волокна выдерживают в термостате при 35-37°С, относительную влажность, близкую к 100%, поддерживают добавлением 1 мл стерильной воды через каждые трое суток. Затем проводят подсчет показателя биодеструкции (К).

ПКА волокна тониной 0,7 текс при воздействии штамма имеют показатель ,67.

Для определения образования Ј-ами- нокапроновой кислоты методом полярографии используют следующую среду, в которой ПКА волокна служат единственным источником углерода, %: ПКА волокно 0,5; КаНР04 0,3; КН2Р04 0,1; MgS04 7H20 0,02;

CaCI 0,01; NaCI 0,01; КН/|МОз0,5; NhMCU0,5; .1.

В колбы емкостью 250 мл вносят по 100 мл среды, засевают суточной бульонной культурой штамма в количестве 3,1-107 клеток на 1 мл и выдерживают в термостате при 35°С. Через каждые сутки отбирают пробы И по калибровочной кривой определяют содержание Ј-АКК. Максимальное количество S-AKK 32,3 мг/л у этих волокон отмечено на 5-е сут. ,

Таким образом, при воздействии штам- а бактерий В. subtllls ВКМ В-1676Д на ПКА волокна тониной 0,7 текс происходит деI.

0

5

струкция на уровне макро- и микроструктуры.

П р и м е р 2. Заражение ПКА нетканного иглопробивного материала поверхностной плотности 250 r/м (волокна тониной 0,4 текс) осуществляет аналогично примеру 1.

Показатель биодеструкции через 1 мес воздействия штамма равен 0,63. Максимальное образование fi-AKK, равное 66,0 мг/л, наблюдают на 5-е сут.

Формула изобретения

Штамм бактерий Bacillus subtllls BKM B-1676D - деструктор поликапроамидных волокнистых материалов на уровне макро- и микроструктуры.

Таблица 1

Изобретение относится к биотехнологии и касается нового штамма бактерий - деструктора поликапроамидных (ПКА) волокнистых материалов и может быть использованодляохлаждения микробиологической стойкости текстильных материалов, содержащих в своем составе ПКА волокна. Целью изобретения является получение штамма бактерий Bacillus subtilis ВКМ В-1676Д (К1), обладающего высокой биологической активностью по отношению к ПКА-волокнистым материалам и способного вызывать гидролиз мак- ромолекул ПКА с образованием Ј - аминокапроновой кислоты (Е-АКК). При выдерживании штамма в течение месяца при 35-37°С и влажности, близкой к 100%, на ПКА-волокна показатель биодеструкции волокна составляет 0,67. При выращивании штамма в среде, содержащей ПКА волокно в качестве единственного источника углерода и минеральные соли, при 35-37°С на 5-е сут образуется 32,3 мг/л Е-АКК. 3 табл.

Степень биоденструкций ПКА волокнистых материалов под действием известного набора микроскопических грибов и штамма бактерий B.subtills BKM В-1676Д

Таблица 2

Образование Ј -аминокапроновой кислоты под действием штамма бактерий B.subtills ВКМ В-1676Д на ПКА волокнистые материалы