Штамм бактерий Rhodococcus opacus ВКМ Ac-2911D, способный к деградации фенола в высоких концентрациях Российский патент 2022 года по МПК C12N1/00 

Изобретение относится к прикладной микробиологии и биотехнологии и представляет собой новый штамм бактерий Rhodococcus opacus ВКМ Ас-2911D, способный к деградации токсичного загрязнителя окружающей среды - фенола.

Фенол входит в состав сточных вод предприятий химической, нефтехимической, кожевенной, мебельной и целлюлозно-бумажной промышленности. Содержание фенолов в сточных водах может достигать нескольких десятков грамм/л. Фенол является высокотоксичным соединением, его предельно допустимая концентрация в воде хозяйственно-питьевого и культурно-бытового водопользования составляет 0.001 мг/л.

В литературе описаны штаммы микроорганизмов, способные утилизировать фенол и способы их применения для очистки сточных вод от данного загрязнителя. Например, известен способ очистки сточных вод от фенолов путем совместного и одновременного окисления фенолов активным илом и перекисью водорода в аэротенке (Патент RU 2188164 С2). Максимальная концентрация фенолов при этом составляет не более 3.0 г/л.

Недостатком описанного способа является отсутствие данных о численности и видовой принадлежности микроорганизмов-деструкторов фенола.

Известен способ очистки сточных вод от фенола с помощью штамма бактерий Pseudomonas monteilii ВКПМ В-11714 (Патент RU 2661679 С2). В случае иммобилизации клеток штамм Pseudomonas monteilii ВКПМ В-11714 осуществляет деструкцию фенола при концентрации не более 950 мг/дм³. Без иммобилизации клеток штамм деградирует не более 450 мг/дм³ фенола.

Недостатком описанного способа является неполная деструкция фенола и низкие предельные концентрации токсиканта, разлагаемые данным штаммом. В условиях иммобилизации штамма содержание фенола снижается на 78 мас. %, в условиях отсутствия иммобилизации данный показатель составляет 68 мас. % (данные о продолжительности культивирования в приведенных примерах отсутствуют)

Известен штамм бактерий Serratia marcescens (Патент RU 2074254 C1), осуществляющий деградацию фенола и 2,4-дихлорфенола. При концентрации каждого загрязнителя 100 мг/л штамм утилизировал 80% фенола и 60% 2,4-дихлорфенола на 9 сутки. Штамм также способен к деструкции фенола в сточных водах при его низком содержании 0.09-0.75 мг/л.

Недостатком штамма является низкая скорость утилизации фенола. Также вид бактерий Serratia marcescens относится к условно-патогенным микроорганизмам (4 группа патогенности).

Известен штамм бактерий Alcaligenes faecalis KSV21, способный к деградации фенола и передающий это свойство близкородственным штаммам (Патент SU 1198118 А1). Штамм способен разрушать фенол при содержании его в качестве единственного ростового субстрата до 1.0 г/л в течение 72 ч.

Известен штамм бактерий Pseudomonas cepacia ВДК ВКПМ В-7559, способный к полной деградации смеси фенола (400 мг/л) и формальдегида (500 мг/л) в среде культивирования в течение 3 суток (Патент RU 2144079 С1).

Известен штамм бактерий Pseudomonas putida GFS-106, способный утилизировать диметилфенилкарбинол и фенол при их совместном присутствии в сточных водах (Патент SU 1759794 А1). Штамм GFS-106 полностью утилизирует 350 мг/л фенола в иммобилизованном состоянии в течение 48 ч.

Недостатком описываемых штаммов является невысокая скорость утилизации фенола и низкие предельные концентрации токсиканта, которые способны разлагать эти культуры.

Известен штамм бактерий Pseudomonas aeruginosa ХР-25 (Патент RU 2270806 С2), осуществляющий биодеградацию ароматических соединений и описаны способы очистки сточных вод от фенольных соединений при его применении (Патент RU 2270805 С2, Патент RU 2270807 С2). При ферментации на качалочных колбах штамм разрушает фенол в концентрации 1000 мг/л за 4 часа на 99.98%. На проточной лабораторной установке в иммобилизованном состоянии на активированном угле штамм окисляет не менее 2500 мг/л фенола за 1 час.

Недостатком штамма является то, что вид бактерий Pseudomonas aeruginosa относится к условно-патогенным микроорганизмам (4 группа патогенности). Кроме того, недостатком описания представленных изобретений является отсутствие в них данных о снижении содержания фенола на проточной лабораторной установке в отсутствии штамма Pseudomonas aeruginosa ХР-25 (абиотический контроль), поскольку известно, что активированный уголь является эффективным адсорбентом для извлечения органических соединений из водных растворов (Фазылова Г.Ф., Валинурова Э.Р., Хатмуллина P.M., Кудашева Ф.Х. Сорбционные параметры производных фенолов на различных углеродных материалах. Сорбционные и хроматографические процессы. 2013. Т. 13. Вып. 5. С. 728-735).

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому положительному эффекту является штамм бактерий Rhodococcus opacus ВКМ Ac-2546D (Патент RU 2405036 С2). В неиммобилизованном состоянии он способен разлагать фенол в концентрации 0.75 г/л. Иммобилизация клеток на поликапроамидном волокне приводит к увеличению количества фенола, разлагаемого данным штаммом в условиях проточного культивирования до 2.2 г/л.

Недостатком данного штамма является неспособность утилизировать другие токсичные ароматические углеводороды.

Также в приведенных аналогах и прототипе нет данных, касающихся разложения фенола указанными бактериями при пониженных температурах (6-8°С) и сохранении деструктивных свойств штаммов при их хранении в иммобилизованном состоянии в течение длительного времени.

Задачей изобретения является получение штамма-деструктора фенола, способного осуществлять эффективное разложение фенола в высоких концентрациях, утилизировать фенол при пониженных температурах и сохранять деструктивные свойства при хранении в иммобилизованном состоянии в течение длительного времени.

Техническим эффектом, который может быть получен при использовании предлагаемого штамма, является повышение концентрации фенола в очищаемых сточных водах и скорости процесса деградации загрязнителя.

Поставленная задача решается тем, что предлагается штамм бактерий Rhodococcus opacus 3D, способный к разложению фенола.

Штамм бактерий Rhodococcus opacus 3D депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов и хранится под номером ВКМ Ас-2911D.

Штамм бактерий Rhodococcus opacus ВКМ Ас-2911D выделен из активного ила сточных вод очистных сооружений (г. Пущино, Московская обл.) методом прямого высева на агаризованной минеральной среде с нафталином в качестве единственного ростового источника.

Штамм Rhodococcus opacus ВКМ Ас-2911D обладает следующими культурально-морфологическими и физиолого-биохимическими свойствами.

Культуральные свойства: на агаризованной среде LB колонии округлые, гладкие, выпуклые, 1-5 мм в диаметре (в зависимости от продолжительности культивирования (3-7 суток)), край ровный, колонии непрозрачные, кремового цвета. На минеральной агаризованной среде с фенолом в качестве единственного источника углерода и энергии образует мелкие, серо-бежевые колонии.

Морфологические свойства: грамположительный, неподвижный актиномицет. Характерно наличие клеточного полиморфизма, цикл роста палочки-кокки, палочки неправильной формы. При культивировании на минеральной синтетической среде М9 в присутствии сукцината (1.0 г/л) размер палочек 5-8×0.9-1.0 мкм.

Физиолого-биохимические свойства: аэроб; каталазоположительный; температурный оптимум 24-30°С, растет при 7°С; оптимум рН нейтральный или слегка щелочной 7.0-8.0; в дополнительных факторах роста не нуждается (прототроф); хорошо растет на стандартных лабораторных средах. На минеральной среде в качестве ростовых субстратов использует следующие источники углерода: глюкозу, бензоат, глюконат, сукцинат, н-алканы (нонан, декан, ундекан, додекан, гексадекан), фенол, бензол, толуол, этилбензол, нафталин, 2-гидроксикоричную кислоту, фталат, гентизат, кумарин, протокатехоат, нефть. Не утилизирует полициклические ароматические углеводороды (фенантрен, 2-метилнафталин, флюорен, аценафтен, антрацен, бифенил), салицилат, капролактам, камфору.

Чувствительность к антибактериальным препаратам. Штамм чувствителен к стрептомицину (100 мкг/мл), рифампицину (100 мкг/мл), канамицину (100 мкг/мл).

Сведения по биологической безопасности. Штамм не патогенен для теплокровных животных и человека, не обладает фитопатогенной активностью.

Условия хранения. Штамм бактерий Rhodococcus opacus ВКМ Ас-2911D хранят на чашках со средой LB при 6-8°С. Пересевы на свежие среды - один раз в месяц. Может храниться не менее 1 года в 15% глицерине при -70°С, не более 10 лет под вазелиновым маслом в полужидкой среде следующего состава (г/л): питательный бульон - 4.0, NaCl - 5.0, агар - 6.0, рН 6.8.

Штамм бактерий Rhodococcus opacus ВКМ Ас-2911D отличается от известных штаммов-бактерий, являющихся деструкторами фенола.

В неиммобилизованном состоянии штамм способен полностью разлагать фенол в концентрациях, равных 1.0 г/л в течение 60 ч. Способность разлагать фенол не исчезает при пересевах на неселективных средах.

Штамм легко иммобилизуется на поликапроамидном волокне. В иммобилизованном состоянии на поликапроамидном волокне предлагаемый штамм осуществляет полную деградацию фенола в концентрации 2.5 г/л в течение 4 суток. При пониженной температуре 7°С штамм утилизирует 0.2 г/л фенола в течение 6 суток. Иммобилизованные клетки штамма, хранившиеся 2 года при температуре 7°С сохраняют жизнеспособность и разлагают 2.5 г/л фенола за 8 суток.

Возможность осуществления предлагаемого изобретения подтверждается следующими примерами, но не ограничивается ими.

Пример 1. Способность штамма Rhodococcus opacus ВКМ Ас-2911D утилизировать ароматические углеводороды и н-алканы.

Для культивирования штамма бактерий Rhodococcus opacus ВКМ Ас-2911D используют минеральную среду следующего состава (г/л): Na₂HPO₄ 0.73; КН₂РО₄ 0.35; MgSO₄×7H₂O 0.1; NaHCO₃ 0.25; MnSO₄ 0.002; NH₄NO₃ 0.75; FeSO₄×7H₂O 0.02. Для получения агаризованной среды добавляют 15 г/л агара.

Ростовые субстраты (ароматические и алифатические соединения) добавляют в минеральную среду в качестве единственного источника углерода и энергии. Субстраты используют в следующих концентрациях, г/л: нафталин 0.5-1.0; салицилат, бензоат, гентизат, протокатехоат, орто-фталат, 2-гидроксикоричная, 2-карбоксикоричная кислоты 0.2-0.5; фенол 0.1-2.5; нефть 10.0. Нерастворимые в воде ароматические кислоты вводят в питательную среду в виде натриевых солей.

При выращивании штамма на агаризованной среде летучие ароматические и алифатические соединения: 2-метилнафталин, фенантрен, антрацен, флуорен, аценафтен, бифенил, бензол, толуол, этилбензол, ксилолы (орто-, мета-, пара-ксилол), фенол, гексан, октан, нонан, декан, ундекан, додекан, гексадекан, кумарин наносят на крышку перевернутой чашки Петри.

Штамм выращивают при 30°С на чашках Петри или в жидкой среде на круговой качалке (150 об/мин) в 750-мл колбах Эрленмейера, содержащих 100 мл минеральной среды.

В таблице 1 приведены результаты культивирования исследуемого штамма на минеральной агаризованной среде, содержащей различные органические субстраты в качестве единственного источника углерода и энергии. Штамм демонстрирует хороший рост на нафталине, кумарине, ароматических карбоновых кислотах (орто-фталевая, гентизиновая), бензоле и его производных (фенол, толуол, этилбензол, 2-гидроксикоричная кислота), а также н-алканах с длиной углеродной цепи С9-С16. Более медленный рост наблюдается на н-алканах с меньшей длиной цепи (С6-С8), а также на 2-карбоксикоричной кислоте, бензоате и протокатехоате. Штамм Rhodococcus opacus ВКМ Ас-2911D не утилизирует полициклические ароматические углеводороды и салицилат.

Данные, представленные в таблице 1, говорят о способности штамма бактерий Rhodococcus opacus ВКМ Ас-2911D утилизировать ряд ароматических и алифатических углеводородов, в том числе фенол. Это свойство штамма может быть полезным при очистки комплексно загрязненных сточных вод.

Пример 2. Разложение фенола штаммом бактерий Rhodococcus opacus ВКМ Ас-2911D в неиммобилизованном состоянии в условиях периодического культивирования.

Для культивирования штамма бактерий Rhodococcus opacus ВКМ Ас-2911D используют жидкую минеральную среду, состав которой приведен в примере 1.

Культуру для посевного материала выращивают в колбах объемом 750 мл с рабочим объемом 200 мл на минеральной среде с фенолом (0.2 г/л) в качестве единственного источника углерода и энергии. Клетки выращивают при перемешивании на круговой качалке (150 об/мин) при температуре 30°С до плотности 0.5-0.7 оптических единиц, для чего проводят дробное внесение фенола (по 0.2 г/л) по мере его потребления. Инокулят вносят в 100 мл минеральной среды до начальной оптической плотности (D560) 0.13±0.02 опт.ед. при 560 нм. Фенол добавляют в среду в концентрациях 0.5, 0.75, 1.0, 1.5 г/л. Уровень рН 7.0 среды в процессе культивирования штамма поддерживают добавлением 10 н. NaOH. Абиотическим контролем служит стерильная минеральная среда с фенолом (0.2 г/л) без инокулята.

Измерение концентрации фенола в среде культивирования проводят спектрофотометрическим методом по калибровочной кривой на спектрофотометре Shimadzu UV-1800 (Япония) (максимум поглощения фенола 270 нм). Интенсивность роста штамма оценивают спектрофотометрически по поглощению света при длине волны 560 нм.

При концентрации фенола 0.5 г/л штамм бактерий Rhodococcus opacus ВКМ Ас-2911D полностью утилизирует поллютант менее чем за 24 ч. При этом максимальная величина оптической плотности D560 достигает 0.89±0.07 опт.ед. Это говорит о способности предлагаемого штамма Rhodococcus opacus ВКМ Ас-2911D разлагать умеренно-высокие концентрации токсиканта (таблица 2).

При концентрации фенола 0.75 г/л полная деградация токсиканта описываемым штаммом происходит за 36 ч. Оптическая плотность D560 составляет 1.11±0.08 опт.ед. Дополнительное внесение фенола в концентрации 1.0 г/л сопровождается дальнейшим ростом культуры без какой-либо задержки. В этом случае штамм утилизирует 1.0 г/л фенола за 24 ч.

Повышение начальной концентрации фенола в среде до 1.0 г/л приводит к увеличению времени его деградации до 60 ч. За это время культура полностью утилизирует субстрат и достигает максимальной величины оптической плотности D560 1.15±0.06 опт.ед.

При начальной концентрации фенола 1.5 г/л увеличение оптической плотности культуры начинается только после значительного адаптационного периода продолжительностью более 10 сут. На 15 сутки оптическая плотность D560 достигает максимального значения 1.59±0.11. При этом фенол не детектируется в культуральной жидкости, что свидетельствует о его потреблении.

Рост клеток в неиммобилизованном состоянии при более высоких концентрациях фенола отсутствует. Убыль фенола в контрольном варианте (фенол в среде без добавления бактерий) не происходит.

Данный пример подтверждает, что штамм бактерий Rhodococcus opacus ВКМ Ас-2911D в неиммобилизованном состоянии способен утилизировать фенол в концентрациях 0.5-1.0 г/л в качестве единственного источника углерода и энергии при периодическом культивировании в течение 24-60 ч соответственно.

Пример 3. Разложение фенола штаммом бактерий Rhodococcus opacus ВКМ Ас-2911D в иммобилизованном состоянии на поликапроамидном волокне в условиях периодического культивирования.

Для иммобилизации клеток штамма бактерий Rhodococcus opacus ВКМ Ас-2911D в качестве носителя используют поликапроамидное волокно. В качестве инокулята используют суспензию клеток, выращенных на феноле до оптической плотности D₅₆₀ 1.59 опт.ед. Инокулят объемом 10 мл вносят в колбы, содержащие 100 мл минеральной среды (состав среды приведен в примере 1), 2.0 г поликапроамидного волокна и 50 мг/л фенола (для индукции ферментов биодеградации фенола). Клетки инкубируют в течение 18 ч на круговой качалке (150 об/мин) при температуре 30°С, затем вносят фенол в концентрациях 1.0, 1.5, 2.5 г/л. В качестве контроля используют носитель со 100 мл среды, содержащей 0.5 г/л фенола.

Как видно из данных, представленных в таблице 2, штамм бактерий Rhodococcus opacus ВКМ Ас-2911D полностью утилизирует 1.0, 1.5 и 2,5 г/л фенола за 1, 2 и 4 суток соответственно. Убыль в контрольном варианте (носитель и фенол в среде) не происходит.

Из данного примера можно сделать вывод, что предлагаемый штамм легко иммобилизуется на поликапроамидном волокне. Иммобилизация клеток приводит к увеличению концентраций фенола и скорости его деструкции по сравнению со свободными клетками.

Пример 4. Разложение фенола штаммом бактерий Rhodococcus opacus ВКМ Ас-2911D в иммобилизованном состоянии на поликапроамидном волокне после длительного хранения.

Изучение процесса утилизации фенола предлагаемым штаммом аналогично примеру 3, с тем отличием, что поликапроамидное волокно с иммобилизованными на нем клетками, полученное после деградации 2.5 г/л фенола переносят в 100 мл стерильной минеральной среды без добавления субстрата и хранят при температуре 7°С. После периода хранения, длящегося от 2 месяцев до 2 лет, волокно промывают свежей стерильной минеральной средой, добавляют фенол в концентрациях 0.5 и 2.5 г/л и культивируют при 30°С на круговой качалке (150 об/мин).

После хранения иммобилизованных клеток в отсутствии субстрата при 7°С в течение 2 месяцев, штамм бактерий Rhodococcus opacus ВКМ Ас-2911D полностью утилизирует 0.5 и 2,5 г/л фенола за 1 и 4 суток соответственно. Таким образом, после непродолжительного хранения штамм не теряет способность к деградации фенола. Разложение 2.5 г/л субстрата происходит с той же скоростью, что и в случае с иммобилизованными клетками, которые не подвергались хранению.

После хранения иммобилизованных клеток в отсутствии субстрата при 7°С в течение 2 лет, при концентрации фенола 0.5 г/л штамм бактерий Rhodococcus opacus ВКМ Ас-2911D полностью утилизирует поллютант за 2 суток. Дополнительное внесение фенола в концентрации 2.5 г/л к активированной культуре сопровождается деструкцией токсиканта. Полная утилизация фенола проходит за 6 суток.

При добавлении фенола в этой же концентрации, 2.5 г/л, к иммобилизованным, но не активированным после 2 лет хранения клеткам, полная деградация токсиканта предлагаемым штаммом происходит за 8 суток.

Из данного примера можно сделать вывод, что иммобилизованные клетки, хранившиеся 2 года в отсутствии субстрата при 7°С, не потеряли способность деградировать фенол, однако для утилизации высоких концентраций им требуется в 2 раза больше времени, чем раньше.

Пример 5. Разложение фенола штаммом бактерий Rhodococcus opacus ВКМ Ас-2911D в иммобилизованном состоянии на поликапроамидном волокне при температуре 7°С.

Для разложения фенола при температуре 7°С используют поликапроамидное волокно с иммобилизованными на нем клетками, полученное после полной деградации 2.5 г/л фенола. Волокно с иммобилизованными клетками переносят в 100 мл стерильной минеральной среды, содержащей 0.2 г/л фенола. Культивирование ведут при 7°С без аэрации.

При концентрации фенола 0.2 г/л и температуре 7°С полная деградация токсиканта предлагаемым штаммом происходит за 6 суток. При дополнительном внесении фенола в концентрации 0.2 г/л его убыль в тех же условиях также происходит за 6 суток.

Из данного примера видно, что предлагаемый штамм бактерий способен утилизировать низкие концентрации фенола при температуре 7°С.

Таким образом, показано, что предлагаемый штамм бактерий Rhodococcus opacus ВКМ Ас-2911D обеспечивает разложение фенола как неиммобилизованными, так и иммобилизованными клетками при концентрациях токсиканта от 0.5 до 2.5 г/л.

Предлагаемый штамм превосходит штамм-прототип Rhodococcus opacus ВКМ-Ас-2546 D по деструктивной активности по отношению к высоким концентрациям фенола. Так, максимальная концентрация фенола, при которой наблюдается рост и разложение токсиканта при периодическом культивировании, составляет для штамма-прототипа 0.75 г/л для свободных клеток и 1.5 г/л для иммобилизованных клеток. Предлагаемый штамм Rhodococcus opacus ВКМ Ас-2911D способен утилизировать 1.5 и 2.5 г/л в виде свободных и иммобилизованных клеток соответственно.

Изобретение относится к области биотехнологии. Предлагаемый штамм бактерий в неиммобилизованном состоянии способен разрушать фенол в концентрации 1.0 г/л в течение 60 ч. В иммобилизованном состоянии на поликапроамидном волокне предлагаемый штамм осуществляет полную деградацию фенола в концентрации 2.5 г/л в течение 4 суток. При пониженной температуре 7°С штамм утилизирует 200 мг/л фенола в течение 6 суток. Иммобилизованные клетки штамма, хранившиеся 2 года в отсутствие субстрата при температуре 7°С, сохраняют жизнеспособность и разлагают 2.5 г/л фенола за 8 суток. Предлагаемый штамм бактерий Rhodococcus opacus ВКМ Ac-2911D может быть использован для получения на его основе бактериального препарата, предназначенного для очистки окружающей среды от фенола. 2 табл., 10 пр.

Штамм бактерий Rhodococcus opacus ВКМ Ac-2911D, способный к деградации 2.5 г/л фенола.